一株对鳞翅目害虫高毒力的苏云金芽孢杆菌菌株基因型鉴定及新基因cry2Ah3克隆

HYW-8是本实验室自行分离的一株对鳞翅目害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌,PCR-RFLP鉴定含有cry1Ab、cry1E基因和一种新的cry2A基因,根据cry2A全长基因序列设计特异引物,获得全长基因.测序结果表明,该基因开放阅读框为1 896 bp,编码632个氨基酸,相对分子质量(Mr)是70.774×103,等电点pI=7.79,与已知的cry2Ah2基因编码的蛋白的同源性最高为98%.该基因序列已在GenBank中登记注册,登录号为GU073380,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry2Ah3.SDS-PAGE分析,HYW-8菌株表达130×103大小蛋白,未见70×103大小蛋白.     

贫瘠营养条件下转cry1Ab/c基因水稻的生态适合度

以抗虫转cry1 Ab/c基因水稻华恢1号(Bt水稻)及其非转基因亲本明恢63(CK水稻)为研究材料,在模拟贫瘠营养条件下(不施肥、无靶标虫压)初步评估了转cry1Ab/c抗虫基因水稻的生态适合度效应.结果表明:贫瘠条件下Bt水稻cry1 Ab/c基因的基本表达规律与大田条件下相似,但是Bt蛋白表达量更低.与亲本明恢63相比,Bt水稻在主要生长发育期的株高、叶绿素含量、叶形和根系等指标方面呈现出显著的生态适合度利益,Bt水稻实粒数、谷粒数、实粒重和千粒重这些重要繁殖指标也较亲本水稻显示出明显的生态适合度正效应,表明其种群在自然界中的生存能力和延续能力可能超越CK水稻,从而产生环境风险.     

转cry1Ac+cry2Ab基因棉对土壤细菌群落结构和功能多样性的影响

以不同生育期转cry1 Ac+cry2Ab基因棉和常规棉田土壤为对象,采用传统平板培养、Biolog分析和变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,研究了该新型转基因材料对土壤细菌群落结构和功能多样性的影响。可培养细菌数量测定结果表明,在棉花整个生育期,2种棉田土壤可培养细菌数量具有相同的变化趋势;与常规棉相比,转cry1 Ac+cry2 Ab基因棉田可培养土壤细菌数量在蕾期存在显著差异(P0.05),其他生育期则无显著差异。Biolog分析结果显示,转cry1 Ac+cry2 Ab基因棉和常规棉田土壤细菌活性和碳源利用能力在苗期和蕾期存在明显差异,其他生育期则无明显不同。PCR-DGGE图谱的聚类分析结果表明,转cry1 Ac+cry2 Ab基因棉与常规棉田土壤细菌群落结构均随着生育期的不同而发生改变,且两者仅在花铃期出现明显差异。对PCR-DGGE条带的序列分析表明,转cry1 Ac+cry2 Ab基因棉与常规棉田土壤细菌之间的差异具有随机性,可能与采样时期或采样点的差异有关。综上所述,2种棉田土壤细菌群落结构和功能多样性在整个棉花生育期的变化趋势基本一致,转cry1Ac+cry2Ab基因棉仅在某些时期对其产生短暂影响,大部分时期无明显影响。     

苏云金芽孢杆菌新基因cry1Ab17的克隆和生物信息学

利用高效克隆PCR产物的专用载体pMD18T,直接从苏云金芽孢杆菌WB9的PCR产物中克隆了cry1Ab17新基因.测序结果表明,该基因(GenBank登录号为AY646166)由3471个碱基组成,其编码的蛋白质含有1156个氨基酸残基,其中亲水性氨基酸占30.8%,疏水性氨基酸占45.2%,酸性氨基酸占12.9%,碱性氨基酸占11.1%.氨基酸序列的同源性分析结果表明,Cry1Ab17蛋白与已报道的Cry1Ab蛋白同源性为95.4%～99.7%,该蛋白的4个氨基酸残基———Pro170、Gly449、Gly796和Gly863与其它已报道Cry1Ab蛋白相应位置的氨基酸残基均不同.在核苷酸序列和氨基酸序列多重比较的基础上,应用PAUP4.0构建了Cry1A蛋白家族的系统发育树.SignalP分析结果显示,Cry1Ab17蛋白中不含信号肽序列.此外,对Cry1Ab17蛋白的二级结构和3个结构域也进行了预测和分析.图4表2参15     

转Bt基因抗虫玉米植株叶腋处花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态

以表达Cry1Ab杀虫蛋白的两种转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法研究了玉米散粉时沉积在植株叶腋处Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态,比较了两种Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度.结果表明, Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白是逐渐降解的,且降解速度逐渐加快.但两种Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同, MON810中的Bt杀虫蛋白降解较快,而Bt11中的降解较慢. D 15时在MON810叶腋处的花粉中已经检测不到Bt杀虫蛋白,而在Bt11花粉中Bt杀虫蛋白到d 18才完全降解.两种Bt玉米花粉中杀虫蛋白的初始含量差异显著,且在各个取样时间内Bt杀虫蛋白的残留量存在显著差异.玉米散粉时留在田间的Bt玉米花粉中的Cry1Ab杀虫蛋白不会在自然界累积.     

苏云金芽胞杆菌苏云金素缺失突变株的筛选及特性研究

利用高温和SDS对苏云金素高产菌株CT-43-1c进行了质粒消除,筛选得到一株不产苏云金素的无晶体突变株BMB0806;并通过SDS-PAGE、高效液相色谱(HPLC)和脉冲电泳(PFGE)分析了野生型菌株CT-43、出发菌株CT-43-1c和突变株BMB0806杀虫晶体蛋白的组成、苏云金素的产量和质粒图谱之间的差异.结果表明,突变株BMB0806与菌株CT-43和CT-43-1c相比,分别缺失了3个和2个大质粒,从而不再产生苏云金素和由cry1B基因编码的分子量为140×103的杀虫晶体蛋白.进一步分析三者质粒图谱后发现,突变株BMB0806中苏云金素的缺失和cry1B基因所在的大质粒A直接相关.图5参12     

苏云金芽胞杆菌菌株WB9编码活性因子的基因分析

采用PCR—RFLP及PCR技术对苏云金芽胞杆菌新分离菌株WB9的ICP、VIP、几丁质酶和肠毒素4种活性因子的编码基因进行了分析．结果表明，该菌株含有编码ICP的cry1Aa、cry1Ab、cry1Cb、cry1Fa和cry1GaS个cry1基因型，编码Vip3A蛋白的vip3A基因以及编码3种肠毒素的hblA、bceT和entS基因；不含编码几丁质酶的基因．将vip3A、hblA、bceT和entS基因PCR产物回收纯化后直接测序，经在线的BLAST软件进行同源性分析，前两个基因片段与Bt已公布基因序列的相应片段同源性分别为99％和96％～98％，bceT基因片段与蜡质芽孢杆菌bceT相应片段同源性为97％．     

基于环介导等温扩增法可视化检测玉米转基因成分

快速准确的转基因检测技术是严格监管转基因作物及其产品的重要支撑;不同转基因作物由于导入不同外源目的基因从而表现出不同性状,因此外源目的基因序列可作为基于核酸检测技术进行转基因筛选的标志物.基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以中性红染料作为比色试剂,建立玉米内源基因和玉米转基因成分的基因特异性的可视化快速检测方法.针对玉米内源基因IVR基因,抗虫外源bar、pat基因,和Bt176中的抗除草剂外源cry1Ab基因分别设计了LAMP引物.结果表明,在Real-time LAMP体系下,能够实现对玉米内源IVR基因、转基因玉米品系Bt176中的bar基因和转基因玉米品系TC1507和59122中的pat基因的检测.对转基因玉米品系Bt176中的cry1Ab基因设计的引物能特异性扩增Bt176,而对Bt11和MON810两种转基因玉米品系无效.通过优化Tris-HCl和中性红浓度,在5 mmol/L Tris-HCl和100μmol/L中性红浓度条件下建立了可视化检测体系,反应1 h即可分别实现对玉米内源基因IVR基因,抗虫外源bar、pat基因,和抗除草剂外源cry1Ab基因的检测.中性红可视化检测结果与Real-time LAMP荧光扩增曲线结果一致,体现了该可视化检测方法具有较高的准确性.本研究建立了一种对玉米转基因相关成分的可视化检测体系,该方法既快速又简便且尤其适用于现场检测.(图6表1参17)     

我国土壤中苏云金芽孢杆菌的分离与基因型的鉴定

从我国20个省市采集176份土壤中分离出苏云金芽孢杆菌51株.以cry1,cry2,cry3,cry4,cry-n,cry7,cry8,cry11,cry13和cyt的引物作PCR分析.结果表明:4株含有cry4,12株含有cry7,4株含有cry8,4株含有cry1,2株同时含有cry1和cry2,27株无PCR产物.未检测到其它基因型.经电镜扫描伴胞晶体形态多种多样,主要有菱形、球形、方形、多边形和不规则形.图3表3参15     

转sck单价基因和cry1Ac/sck双价基因水稻对二化螟的致死效应及中肠组织病理变化观察

室内采用离体叶片法研究了转sck单价基因抗虫水稻86AS1和转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻MSB不同生育期主茎顶叶对二化螟幼虫的杀虫效果.结果发现,不同生育期的MSB对二化螟初孵幼虫表现出了很强的毒杀效果,二化螟幼虫校正死亡率在扬花期前均达到90%以上;扬花期和灌浆期抗虫性有所下降,校正死亡率高于80%;成熟期校正死亡率在60%以上.在整个生育期,二化螟幼虫取食86AS1主茎顶叶的校正死亡率均未超过50%.MSB对二化螟幼虫的毒杀效果明显高于86AS1.采用透射电镜观察二化螟幼虫取食转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻和转sck单价基因抗虫水稻主茎顶叶后中肠组织的病理变化.结果发现,两种转基因水稻都能够引起二化螟幼虫中肠组织发生病理变化,但病变程度有明显差异.二化螟幼虫取食转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻3d,中肠组织受到严重破坏且病理变化明显;取食转sck单价基因抗虫水稻3d,幼虫中肠组织的病理变化却较缓慢.图2参10     

转Bt基因工程菌BioP8在环境中的消长动态及生物学效应

2001~2004年,在河北省保定市对转Bt基因荧光假单胞菌工程菌BioP8进行了环境释放,并跟踪调查该工程菌在田间的定殖、扩散、田间防效以及对田间节肢动物群落的影响.结果表明,BioP8在甘蓝叶、根及土壤中均能定殖、存活,在植物根部存活能力较强.在施药后d3,BioP8菌密度均达最高值,之后趋于衰减;BioP8对甘蓝田中天敌有较明显的保护作用,对田间节肢动物群落物种丰富度有一定的影响,BioP8防治区的节肢动物个体总量介于化防区和空白对照区的个体总量.图2表1参7     

Bt抗性和敏感棉铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶基因克隆及半定量测定

克隆了Bt-Cry1Ac抗性和敏感棉铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶基因,并进行了半定量RT-PCR测定.定量结果显示,类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶在不同龄期棉铃虫中肠表达量存在差异,其中在5龄棉铃虫体内转录水平最高,3龄棉铃虫次之,而在4龄棉铃虫中肠内转录水平最低.此外,相同龄期的抗性品系棉铃虫体内的类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶转录水平明显高于敏感品系棉铃虫.中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的mRNA表达量的升高,可能与抗性棉铃虫对Bt杀虫蛋白的抗性演化有关.图6参17     

转基因毛白杨外源基因转移的环境风险分析

以8年生转Bt基因败育毛白杨雄株为实验材料,分离其体内、体外、根际土壤、蛀干桑天牛(Apripona germari Hope)排泄物中可培养的细菌和真菌,利用特异引物对获得的微生物进行转Bt基因败育毛白杨雄株外源基因PCR检测.实验发现,381株次细菌中有6株PCR检测阳性;307株次真菌中有4株PCR检测阳性.     

Bt作物杀虫蛋白在农田土壤中残留动态的研究进展

综述了转Bt作物释放的杀虫蛋白在农田土壤中的残留动态．重点阐述了：①土壤中Bt毒素蛋白的检测方法；②Bt毒素在土壤中残留、富集与降解动态；③Bt毒素蛋白与土壤中具有表面活性颗粒的吸附结合规律；④土壤中Bt毒素的杀虫活性．国内外研究结果表明，转基因植物释放到土壤中的Bt毒素蛋白迅速与土壤中具有表面活性的颗粒吸附并紧密结合，降低生物降解，但结合后的Bt毒素结构没有改变，致使毒素蛋白在土壤中长期滞留并保持其杀虫活性，可能会对土壤中非靶标生物造成不良影响．因此深入、系统地研究和评价转Bt作物释放的Bt毒素对土壤生态系统的风险迫在眉睫．参50     

不同虫压下转Bt基因水稻与非转基因水稻生态适合度差异

为了解转基因水稻的基因扩散效率和潜在生态风险,以转Bt抗虫水稻Bt63、R1、R2和非转基因常规水稻Ⅱ优838为试材,采用高、低两个不同虫害胁迫水平和转基因与非转基因水稻相间种植方式,通过观察水稻植株营养生长、结实以及对螟虫危害的抗性表现等差异,研究比较了Bt外源基因插入后对水稻植株适合度的影响.结果表明:在低虫害胁迫条件下,转Bt基因水稻在植株分蘖数、生物量鲜重等营养生长指标方面与非转基因对照品系间无明显差异,但株高、穗长、穗重等指标不及对照,且R2和Bt63与对照间差异显著;在高虫害胁迫条件下,3个转Bt基因水稻品系的分蘖数、穗长、穗重等指标明显高于对照.而不同转基因品系株高适合度效应不同,这可能与受体本身的特性相关.3种转基因水稻的单株结实粒数、千粒重与对照在两种虫害胁迫条件下均无显著性差异,Bt基因对受体植株的结实影响不明显.在高虫害胁迫条件下,3种转Bt基因水稻的抗虫能力均显著优于非转基因水稻,表明Bt基因对受体植株的抗虫性影响显著.同时,本研究结果还表明转Bt基因水稻的适合度代价较小,预示了抗虫转基因水稻外源Bt基因在一定环境条件下具有逃逸的可能,但这种风险比较小.     

水稻抗虫转基因光温敏核不育系植株的获得

以质粒pCUBAC-HPT作抗虫基因供体，优良光温敏核不育系612S为受体，采用基因枪转化法，获得了转抗虫基因sck和sbk的植株．分子证据表明，外源基因己整合到受体基因组中．蛋白活性测定和Western blotting结果显示，转基因在受体植株中得到表达．田间抗虫性测定表明，外源基因的转入提高了受体的抗虫性．本文还讨论了转基因技术在水稻育种中的作用．图5表2参12     

转Bt基因抗虫棉对土壤微生物群落生物多样性的影响

设置非转基因抗虫棉棉田以及分别种植7和10 a转Bt基因抗虫棉的棉田3个处理,于2007--2008年棉花苗期、蕾期、花铃期和吐絮期采样测定了土壤中5个微生物种类的数量,以监测长期种植转Bt基因抗虫棉对土壤微生物群落生物多样性的影响.结果表明,3种类型棉田土壤细菌、真菌、固氮菌、反硝化细菌、亚硝化细菌数量以及微生物多样性指数在整个棉花生长期内变化趋势基本一致,其中,在棉花蕾期各种微生物数量达到高峰.与种植非转基因抗虫棉相比,不同种植年限转Bt基因抗虫棉对土壤细菌、真菌、固氮菌、反硝化细菌、亚硝化细菌数量和微生物多样性指数都无显著影响,但随着采样时间的不同,3种类型棉田土壤各类微生物数量和多样性指数都呈明显季节变化.