红树林沉积物Bt菌株的分离与cry基因型的鉴定（Isolation of Bacillus thuringiensis Strains from Mangrove Sediment Samples and Identification for cry Genes）

从收集自泉州洛江红树林保护区的400个沉积物土壤样品中,分离到18株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt).利用PCR-RFLP体系对Bt菌株杀虫晶体蛋白的基因型进行了鉴定,发现15株Bt含有cry1基因,4株含有cry2基因,有3株分别含有cry7、cry8、cry9基因.克隆了一个新型的cry2Ab基因,其编码蛋白与现有Cry2Ab型杀虫晶体蛋白的最高同源性为95%.     

转Bt基因抗虫棉对土壤微生物群落生物多样性的影响

设置非转基因抗虫棉棉田以及分别种植7和10 a转Bt基因抗虫棉的棉田3个处理,于2007--2008年棉花苗期、蕾期、花铃期和吐絮期采样测定了土壤中5个微生物种类的数量,以监测长期种植转Bt基因抗虫棉对土壤微生物群落生物多样性的影响.结果表明,3种类型棉田土壤细菌、真菌、固氮菌、反硝化细菌、亚硝化细菌数量以及微生物多样性指数在整个棉花生长期内变化趋势基本一致,其中,在棉花蕾期各种微生物数量达到高峰.与种植非转基因抗虫棉相比,不同种植年限转Bt基因抗虫棉对土壤细菌、真菌、固氮菌、反硝化细菌、亚硝化细菌数量和微生物多样性指数都无显著影响,但随着采样时间的不同,3种类型棉田土壤各类微生物数量和多样性指数都呈明显季节变化.     

转sck单价基因和cry1Ac/sck双价基因水稻对二化螟的致死效应及中肠组织病理变化观察

室内采用离体叶片法研究了转sck单价基因抗虫水稻86AS1和转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻MSB不同生育期主茎顶叶对二化螟幼虫的杀虫效果.结果发现,不同生育期的MSB对二化螟初孵幼虫表现出了很强的毒杀效果,二化螟幼虫校正死亡率在扬花期前均达到90%以上;扬花期和灌浆期抗虫性有所下降,校正死亡率高于80%;成熟期校正死亡率在60%以上.在整个生育期,二化螟幼虫取食86AS1主茎顶叶的校正死亡率均未超过50%.MSB对二化螟幼虫的毒杀效果明显高于86AS1.采用透射电镜观察二化螟幼虫取食转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻和转sck单价基因抗虫水稻主茎顶叶后中肠组织的病理变化.结果发现,两种转基因水稻都能够引起二化螟幼虫中肠组织发生病理变化,但病变程度有明显差异.二化螟幼虫取食转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻3d,中肠组织受到严重破坏且病理变化明显;取食转sck单价基因抗虫水稻3d,幼虫中肠组织的病理变化却较缓慢.图2参10     

贫瘠营养条件下转cry1Ab/c基因水稻的生态适合度

以抗虫转cry1 Ab/c基因水稻华恢1号(Bt水稻)及其非转基因亲本明恢63(CK水稻)为研究材料,在模拟贫瘠营养条件下(不施肥、无靶标虫压)初步评估了转cry1Ab/c抗虫基因水稻的生态适合度效应.结果表明:贫瘠条件下Bt水稻cry1 Ab/c基因的基本表达规律与大田条件下相似,但是Bt蛋白表达量更低.与亲本明恢63相比,Bt水稻在主要生长发育期的株高、叶绿素含量、叶形和根系等指标方面呈现出显著的生态适合度利益,Bt水稻实粒数、谷粒数、实粒重和千粒重这些重要繁殖指标也较亲本水稻显示出明显的生态适合度正效应,表明其种群在自然界中的生存能力和延续能力可能超越CK水稻,从而产生环境风险.     

多年连续种植转基因Bt汕优63稻田水体和土壤中Cry1Ab/c蛋白残留调查

以湖北武汉、随州、武穴和孝感以及山东德州5个多年转基因水稻种植区为试验地,在水稻生育期采集转cry1 Ab/c基因水稻Bt汕优63(Bt-SY63)和对照非转基因汕优63(SY63)稻田水体和土壤,使用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法对稻田水体和土壤Cry1 Ab/c蛋白残留量进行动态监测.结果显示,与SY63稻田相比,连续种植2～4 a后,不同生育期Bt-SY63稻田水体Cry1Ab/c蛋白残留量大多与同一生育期SY63样品间差异未达显著水平(P＞0.05),最高残留量为0.373 ng· mL-1.与水体Cry1Ab/c蛋白残留情况相似,不同生育期Bt-SY63稻田土壤Cry 1Ab/c蛋白残留量大都低于试剂盒检测限(0.25 ng·g-1),仅随州苗期、德州拔节期和开花期样品有微量残留,鲜土残留量分别为0.261、0.540和0.361 ng·g-1,并分别与SY63样品间差异显著(P＜0.05).另外,多年连续种植Bt-SY63水稻后,2、3和4a种植年限的Bt-SY63稻田水体和土壤中Cry1Ab/c蛋白残留量之间大都没有显著差异(P＞0.05).认为连续种植2、3和4a的Bt-SY63水稻稻田水体和土壤仅存在微量Cry1Ab/c蛋白残留,不会造成Cry1Ab/c蛋白在稻田水体和土壤中的累积.     

抗虫-耐除草剂转基因玉米种植对根际土壤细菌和真菌群落的影响

全生育期种植抗虫基因cry1Ab/cry2Aj和耐除草剂基因G10evo-spsps的转基因玉米及其亲本非转基因玉米,采用定量聚合酶链式反应(PCR)和高通量测序技术,测定玉米拔节期和成熟期根际土壤细菌和真菌群落数量、组成及多样性,研究种植抗虫耐除草剂转基因玉米对根际土壤微生物的影响。结果表明,种植转基因玉米未显著影响根际土壤理化性质、土壤荧光素二乙酸酯水解酶活性、微生物群落丰度及多样性;在门水平上,种植转基因玉米仅显著提高2个生长时期根际土壤细菌放线菌门(Actinobacteria)相对丰度;在属水平上,种植转基因玉米均显著降低2个生长时期根际土壤细菌Candidatus_Nitrososphaera相对丰度;种植转基因玉米未影响真菌门水平相对丰度,但影响根际土壤真菌Fusarium、Staphylotrichum和Lophiostoma属相对丰度。另外,生长时期显著影响根际土壤可溶性有机碳和全氮含量,也显著影响根际土壤细菌群落组成和多样性,但未显著影响根际土壤真菌群落组成和多样性。该研究旨在为转基因作物产业化的自然生态风险管理和控制提供基础数据和理论支撑。     

苏云金芽孢杆菌新基因cry1Ab17的克隆和生物信息学

利用高效克隆PCR产物的专用载体pMD18T,直接从苏云金芽孢杆菌WB9的PCR产物中克隆了cry1Ab17新基因.测序结果表明,该基因(GenBank登录号为AY646166)由3471个碱基组成,其编码的蛋白质含有1156个氨基酸残基,其中亲水性氨基酸占30.8%,疏水性氨基酸占45.2%,酸性氨基酸占12.9%,碱性氨基酸占11.1%.氨基酸序列的同源性分析结果表明,Cry1Ab17蛋白与已报道的Cry1Ab蛋白同源性为95.4%～99.7%,该蛋白的4个氨基酸残基———Pro170、Gly449、Gly796和Gly863与其它已报道Cry1Ab蛋白相应位置的氨基酸残基均不同.在核苷酸序列和氨基酸序列多重比较的基础上,应用PAUP4.0构建了Cry1A蛋白家族的系统发育树.SignalP分析结果显示,Cry1Ab17蛋白中不含信号肽序列.此外,对Cry1Ab17蛋白的二级结构和3个结构域也进行了预测和分析.图4表2参15     

江苏沿海地区转Bt基因抗虫棉对棉田昆虫种群的影响

2004-2005年,在江苏沿海地区采用系统调查与面上普查相结合的方法,比较分析转Bt基因抗虫棉(中棉所44)与常规棉(中棉所17)2类棉田昆虫种群的差异.结果表明,与常规棉田相比,Bt棉田棉铃虫、玉米螟、金刚钻、棉小造桥虫等鳞翅目害虫种群数量显著降低,而盲蝽象、红蜘蛛、棉蚜、烟粉虱等非靶标刺吸式害虫种群数量显著增加;蜘蛛、瓢虫等捕食性天敌种群数量显著增加,而棉铃虫的寄生性天敌种群数量则显著下降.转Bt基因抗虫棉对棉田昆虫种群的影响在数年间保持相对稳定的状态.     

不同棉花品种及种植区域对土壤无脊椎动物群落结构的影响

采用干、湿漏斗分离法,在山东省陵县采集了试验田的Bt棉(新棉33B)和常规棉(中棉12)及大田条件下Bt棉的0～15cm土层中的土壤无脊椎动物,并对其群落结构进行了分析.结果表明,线虫和螨类是3种类型棉田的优势土壤动物类群,其频度分别为60%～85%和9%～27%.试验田的常规棉和Bt棉相比,33B棉田土壤动物的类群较多,线虫、鞘翅目、双翅目数量和土壤动物总数均较高,但各土层土壤动物的多样性指数H’和均匀度指数J值均较低.试验田和大田的33B相比,其土壤动物的类群数相近,但大田33B的轮虫和线蚓数量较高,线虫、蠋、鞘翅目数量和土壤动物总数均较低,各土层土壤动物的多样性和均匀度均较高.Rényi多样性指数曲线也表明,试验田33B棉田的土壤动物多样性高于中棉12,大田33B的土壤动物多样性高于33B试验田.6～11月期间,各土层土壤动物的数量动态在不同类型棉田趋势基本相同.7月是中棉12棉田土壤动物数量的高峰期,9月是试验田和大田33B的高峰期.试验田的中棉12和33B棉田,6～8月土壤动物的多样性指数和均匀度指数变化趋势较为一致;9～10月,33B棉田土壤动物的多样性和均匀度较高.6～11月,大田33B土壤动物的多样性和均匀度均显著高于试验田33B.可见,棉花品种和实验地点等因素均可显著影响土壤动物的群落结构.Bt棉33B棉田的土壤动物多样性高于常规棉中棉12;大田33B的土壤动物多样性高于33B试验田.图2表4参29     

新疆黄萎病发病程度不同棉田土壤细菌群落结构差异分析

新疆棉区棉花黄萎病发生危害严重,提高该病的生态防控技术对实现棉花"化肥、农药"减施增效有重要意义。文章以阿克苏、石河子和库尔勒三地棉花黄萎病不同发生程度棉田土壤为研究对象,利用高通量测序技术对土壤细菌种群结构进行研究,并分析土壤理化性质与细菌多样性及种群结构的相关性,以期揭示棉田土壤的细菌群落结构差异及主要影响因子,为提高新疆棉花黄萎病生态防控技术提供依据。结果表明,在97%相似水平上,阿克苏、库尔勒重病棉田土壤细菌的OTU数量及ACE、Chao1、Shannon-Wiener指数均分别与其对照田土壤无显著差异,石河子重病田土壤细菌的ACE、Chao1指数均显著低于其对照田,而Shannon-Wiener指数显著高于对照田。聚类分析发现,阿克苏、石河子重病田均分别与对照田土壤的细菌群落组成差异显著,而库尔勒重病田与其对照田土壤细菌群落组成差异较小。在属水平上,阿克苏重病田土壤中有益菌群溶杆菌属(Lysobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)的丰度分别为3.67%和3.15%,均显著高于无病田对照(2.35%和0.18%),而芽胞杆菌属(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces)的丰度在阿克苏、石河子、库尔勒三地重病田与对照田之间均无显著差异。差异标记分析同样发现在阿克苏重病田中显著富集了假单胞菌目(Pseudomonadales),在石河子重病田中显著富集了放线菌门(Actinobacteria)。相关分析表明,棉田土壤细菌的OTU数量、Alpah多样性指数与土壤pH值、全钾含量呈正相关,与总盐含量、碳氮比呈负相关,与有机质、全氮、全磷含量及棉田发病程度无明显相关,土壤pH值、总盐含量是影响土壤细菌多样性的主要因子。     

转Bt-cry1Ac基因棉花对意大利蜜蜂肠道细菌群落的影响*

采用基于16 SrDNA的变性梯度凝胶电泳(DGGE)的方法,研究了转Btcry1Ac基因棉花SGK321对益虫——意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)肠道细菌群落的影响.分别用转基因/非转基因棉花花粉和高浓度外源DNA饲喂蜜蜂7d,通过DGGE分析经不同处理的蜜蜂肠道细菌群落组成的差异,同时用PCR检测是否发生外源基因的横向转移.结果显示,各个处理组DGGE图谱中的条带数目在11.3～15.0之间,Shannon’s指数在0.87～1.05之间,相似性系数介于68.3%～84.7%,不同处理组肠道细菌组成差异不明显,用PCR的方法也没有检测到外源基因的横向转移.因此初步判定转基因棉花SGK321短期内对蜜蜂细菌群落尚无不利影响.图2表3参22     

水稻生育期对不同施肥条件下黄泥田土壤无机氮及细菌群落的影响

为揭示不同施肥条件下水稻生育期黄泥田土壤细菌群落的动态变化及对可溶性无机氮的影响,以33年不同施肥处理(不施肥CK、单施无机肥NPK、无机肥配施牛粪NPKM和无机肥配施秸秆NPKS)的黄泥田为研究对象,采用实时荧光定量PCR和高通量测序等技术分析水稻幼苗期、分蘖期、拔节期、扬花期和成熟期的黄泥田耕层土壤细菌数量、群落组成和结构.结果显示,黄泥田可溶性无机氮以铵态氮为主,含量为6.01-30.93 mg/kg,占可溶性无机氮总量的95%以上.细菌16S rRNA基因拷贝数为3.03×107-14.33×107/g干土.土壤优势细菌群落为变形菌门、绿弯菌门、放线菌门和酸杆菌门.偏最小二乘法判别分析表明,不同施肥处理细菌群落差异以拔节期最为明显;不同生育期细菌群落差异以无机有机肥配施处理最为明显.多元方差分析表明,水稻生育期可以解释细菌群落结构59.79%的变异,施肥处理可以解释细菌群落结构10.44%的变异,土壤铵态氮与细菌16S rRNA基因拷贝数呈显著正相关(P 0.05).本研究表明土壤细菌群落与土壤铵态氮存在一定的相关性,且水稻不同生育期引起的土壤细菌群落结构差异比不同施肥处理引起的细菌群落结构差异更为明显.(图3表4参26)     

抗旱和耐盐碱转基因棉花对土壤线虫群落的影响

土壤线虫作为土壤质量的重要指标,已成为转基因作物环境安全性评价的重要内容之一。于2014和2015年,以抗旱转基因棉花013011和耐盐碱转基因棉花013018为对象,研究2种抗逆转基因棉花对棉田土壤线虫群落结构的影响。结果表明,在所有处理中共鉴定出土壤线虫34属,其中,食细菌线虫13属,食真菌线虫3属,捕食性线虫9属,植食性线虫9属,其中优势属均为头叶属(Cephalobus)、真头叶属(Eucephalobus)和螺旋属(Helicotylenchus)。与各自受体对照相比,除了抗旱转基因棉花013011土壤线虫的属丰富度显著降低(P0.05)、食细菌线虫丰度显著增加(P0.05)外,各处理其他生态学指标和营养类群并不受性状因素的影响。耐盐碱转基因棉013018及其受体对照棉Q处理棉田土壤线虫总丰度,食细菌线虫丰度、捕食杂食性线虫丰度在不同采样时间之间均存在显著或极显著差异。抗旱转基因棉013011及其受体棉TH2处理棉田土壤线虫通路指数、成熟度指数和植食性线虫指数在不同采样时间之间存在极显著差异。抗旱和耐盐碱转基因棉田与对照田相比,中杆属(Mesorhabditis)和桑尼属(Thornia)个别稀有属土壤线虫相对丰度发生显著变化,而优势属土壤线虫相对丰度无显著变化。     

转Bt-cry1Ac棉花花粉对意大利蜜蜂生长发育的影响

研究了取食转Bt-cry1Ac棉花花粉对意大利蜜蜂的影响,主要包括意大利蜜蜂的生长发育、体内酶活性的变化.结果发现,取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的意大利蜜蜂与取食非转基因亲本棉花花粉的蜜蜂(CK)相比,4、5、6日龄幼虫体重差异不显著,幼虫及蛹的历期也没有明显差异.取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的意大利蜜蜂6日龄幼虫体内的谷胱甘肽-S-转移酶、总蛋白酶活力与CK相比,没有显著差异.取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的意大利蜜蜂幼虫体内的α-乙酸萘酯酶、乙酰胆碱酯酶活力极显著高于CK,强碱性、弱碱性类胰蛋白酶活力极显著低于CK,类胰凝乳蛋白酶活力显著低于CK.另外,采用酶联免疫(ELISA)方法在取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的蜜蜂6日龄幼虫体内能够检测到Bt杀虫蛋白.表4参12     

转双价抗真菌病害基因大豆对根际土壤微生物群落结构的影响

采用传统的平板计数法和变性梯度凝胶电泳技术,对转chi+rip(几丁质酶和核糖体失活蛋白)双价抗真菌基因大豆转基因G0431以及其亲本非转基因大豆黑农35种植后的根部土壤可培养细菌(含芽胞杆菌、产荧光假单胞菌)、真菌、放线菌进行平板计数及细菌和真菌的群落结构分析.结果表明,二者根部土壤可培养细菌(含芽胞杆菌和产荧光假单胞)、真菌和放线菌的数量并无显著差异;此外,变性梯度凝胶电泳图谱的聚类分析结果显示,时间变化是造成根部土壤细菌和真菌群落结构变化的主要因素,而同一时间内转基因G0431和黑农35根部土壤的细菌和真菌群落结构之间并无显著不同.在大豆的整个生长期内,根部土壤细菌群落多样性指数为5.32～5.37,群落分布均匀度指数为0.91~0.95;根部土壤真菌群落多样性指数为4.78～4.91,群落分布均匀度指数为0.81～0.89.以上结果说明,几丁质酶和核糖体失活蛋白双价基因的导入并没有对大豆根际可培养细菌(含芽胞杆菌和产荧光假单胞)、真菌和放线菌的数量以及细菌和真菌的群落结构产生显著影响.图4表2参22     

杨树人工林土壤养分有效性变化及其与土壤细菌群落演变的相关性

为揭示连作人工林衰退机制,基于离子交换树脂膜埋置和PCR-DGGE技术,对杨树人工林土壤养分库与流特征、土壤细菌群落结构的代际差异进行了对比分析.结果表明,随连作代数增加,杨树人工林土壤养分含量总体呈现逐渐下降的趋势;根际和非根际土壤中速效氮和钾的含量在代际间呈现显著降低(P0.05),说明连作人工林极易出现养分亏缺.养分离子流在非根际土壤中并没有显著差异,但根际土壤中NH4+和K+在单位时间内的提取量呈现显著增加,NO3-则显著减少(P0.05),说明连作杨树人工林土壤硝化作用存在障碍.对土壤细菌群落结构的研究表明,根际土壤细菌丰富度和Shannon-wiener多样性显著低于非根际土,但氨化细菌、好气性固氮菌和纤维素分解菌的数量显著高于非根际土;而且呈现出氨化细菌数量在代际间显著增加,亚硝化细菌和好气性固氮菌显著减少的趋势(P0.05).典型相关分析表明,杨树人工林土壤养分有效性变化与细菌群落演变具有极显著相关性(P0.01).因此,细菌群落演变可能是影响土壤硝化作用和氮素有效性变化的重要机制.     

膜下滴灌棉田不同土层盐分变化及其对棉花生长的影响

研究选择两种不同盐分含量土壤（中度盐渍化EC25：4-7 dS.m-1和轻度盐渍化EC25：1-4 dS.m-1）,通过对棉田整个生育期的土壤盐分含量测定,研究棉田不同土层盐分变化及其对棉花生长的影响。结果表明：两种不同盐分含量土壤,盐分降幅较大的在0-20、40-80 cm土层为膜下滴灌棉田盐分积聚区。整个生育期土壤盐分变化趋势相似,都表现为土壤盐分前期（现蕾期）快速下降后期有所增加;中度盐渍化和轻度盐渍化棉田的单株干物质积累量差异不显著,单位面积的干物质积累和籽棉产量差异显著,其主要原因是两种盐分土壤棉花的成活率差异较大。     

长期连作及秸秆还田对棉田土壤微生物量及种群结构的影响

通过采用常规微生物培养技术分析长期不同连作年限及秸秆还田棉田土壤微生物量及种群结构变化,揭示棉花连作及秸秆还田与土壤微生物多样性关系。研究表明,随着连作年限增加,秸秆还田连作模式下真菌数量持续增加,细菌和微生物总量在连作5-20 a逐渐下降,25 a后又上升;非秸秆还田连作模式随着连作年限增加其微生物种群变化与秸秆还田连作模式变化一致,但非秸秆还田连作模式土壤细菌和微生物总量分别比秸秆还田连作模式在连作5、10和15 a降低42.9%、57.9%、70.6%和41.9%、54.7%和65.7%,而真菌数量增加28.4%、80.8%和116.7%。说明棉花秸秆还田能够增加微生物数量,改善棉田土壤微生物种群结构。连作棉田土壤Simpson指数和Shannon指数呈随连作年限增加呈增加的趋势,连作棉田土壤微生物细菌/真菌（B/F）和放线菌/真菌（A/F）比值在秸秆还田模式下先逐渐减小至连作25 a有升高,而非秸秆还田模式下持续下降。     

mCry1Ac基因在抗虫转基因玉米Bt799中的表达特征

采用双抗夹心酶联免疫法(ELISA)定量检测转mCry1 Ac基因抗虫玉米Bt799在不同生育期不同植株部位的mCry1Ac蛋白含量。结果显示:mCry1 Ac基因在整个生育期玉米叶、茎、根和种子中均能表达,mCry1Ac蛋白含量为(0.82±0.10)~(15.83±1.77)μg·g-1;随着生育期和植株部位的不同,mCry1Ac蛋白含量呈现明显的时空动态变化,其中,叶、茎和根中mCry1Ac蛋白含量随转基因玉米生育期的推移均呈增加趋势,并均在完熟期达最高;在除苗期外的其他各生育期叶中mCry1Ac蛋白含量均显著高于其他植株部位,而在完熟期种子中mCry1Ac蛋白含量在各植株部位中最低,为(2.86±1.71)μg·g-1。     

转Bt基因玉米种植对土壤细菌数量及多样性的影响

利用三室根箱装置获得玉米生长室土壤(S I)、根际土(SⅡ)、非根际土(SⅢ)3个不同根区土壤,采用传统平板计数培养与变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术相结合的方法,研究了转基因玉米Btll及其非转基因亲本在播种后40、50、60 d各根区土壤细菌数量及多样性的变化.结果表明,转Bt基因玉米播种后50、60 d S I根区土壤可培养细菌数量显著低于非转基因亲本,播种后40、50 d SⅡ根区土壤可培养细菌数量较亲本玉米显著增加,而在其他时期和根区与亲本玉米之间均无显著差异.DGGE图谱显示,3个采样时期各根区DGGE图谱条带数、土壤细菌多样性指数和均匀度指数均无显著差异(P＞0.05).