环境雌激素生物效应的作用机制研究进展

环境雌激素(environmental estrogens,EEs)种类繁多,来源多样且分布广泛,大量工业添加剂、食品添加剂和农药类物质已被证实具有雌激素活性。EEs对人体生殖、神经、免疫等系统的生物毒性已经引起了公众的普遍关注。近年来的研究表明,EEs不仅结合雌激素核受体(nuclear estrogen receptor,n ER),还可以活化雌激素膜受体(membrane estrogen receptor,m ER),干扰正常的雌激素信号通路。本文总结了EEs通过n ER、m ER介导的多种雌激素基因组和非基因组信号途径及其产生的生物学效应,综述了在其毒理学作用机理基础上发展的环境样品的雌激素活性评估和EEs混合物的联合作用研究,以期为该类污染物的筛查、风险评估和进一步的机制研究提供参考。     

雌激素受体在环境雌激素评估中的研究进展（Review on Estrogen Receptor to Estimate Environmental Estrogen）

水环境是环境雌激素最大的储存库,环境雌激素可通过水体传递,对水生动物产生严重危害.雌激素的生理功能通过雌激素受体(ER)介导.ER是一种配体依赖性转录因子,通过雌激素应答元件调节靶基因的转录.大量研究证实,在环境雌激素类化合物污染的评价中,ER可作为检测环境雌激素效应的生物标记物之一.但不同亚型的ER具有组织特异性且对配体的结合存在差异,因此在环境雌激素效应的检测中,应注意化学污染物的类型以及受检动物的物种及组织的特异性.检测ER的方法包括ER蛋白直接定量检测和ERmRNA定量分析,检测技术的选择要依据实验设计而定.论文对环境雌激素效应检测中ER的研究进展进行了综述,为环境雌激素污染检测工作提供了理论依据和基本方法.     

细胞膜结合的雌激素受体的特异性标记

细胞膜结合的雌激素受体(Cell membrane-bound estrogen receptor,cmER)介导了雌激素的非基因组作用,参与了乳腺癌等诸多疾病的发生,但是作用机制研究受限于能够有效区分cmER和细胞质内ER(Estrogen receptor)的标记手段.为了实现cmER的特异性标记,首先在体外分别表达含有A1、S6和ybbR三个不同短肽的谷胱甘肽S转移酶融合蛋白,比较磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Phosphopantetheinyl transferase,PPTase)-AcpS和Sfp对其的识别选择性.选取识别效率较高和特异性较好的A1短肽,将其构建到雌激素受体ERα的C端(ERα-A1),结果表明该偶联并不影响ERα的蛋白质表达及其在雌激素作用下的转录.进一步研究表明,来源于大肠杆菌的PPTase-AcpS可以以辅酶A-生物素(Coenzyme A-biotin)为底物,将生物素特异性标记到ERα-A1.这些结果为进一步研究雌激素及cmER介导的非基因组调控机制提供了新的方法.     

基于膜雌激素受体(GPER)结合化合物能力的分类预测模型

近年来,计算毒理学的方法被广泛应用于潜在的环境内分泌干扰物(EDCs)的筛选.膜雌激素受体(GPER),作为一种可以快速响应内源性配体雌激素的关键靶蛋白,调控其介导的多项生理学功能.但是针对GPER的化合物毒性预测模型仍未见报道.因此,本研究收集了130个化合物对GPER的结合活性数据,主要包括双酚类、多溴联苯类以及农...     

环境雌激素生物效应的作用机制研究进展

环境雌激素(Environmental Estrogens, EEs)种类繁多、来源多样且分布广泛,大量工业添加剂、食品添加剂和农药类物质已被证实具有雌激素活性。EEs对人体生殖、神经、免疫等系统生物毒性,已经引起了公众的普遍关注。近年来的研究表明,EEs不仅可以结合雌激素核受体(nuclear Estrogen Receptor, nER)干扰正常的雌激素基因组信号通路,还能活化雌激素膜受体(membrane Estrogen Receptor, mER)引发快速的雌激素非基因组信号转导途径。本文总结了EEs通过nER、mER介导的多种雌激素基因组和非基因组信号途径及其产生的生物学效应,综述了在其毒理学作用机理基础上发展的环境样品的雌激素活性评估和EEs混合物的联合作用研究,以期为该类污染物的筛查、风险评估和进一步的机制研究提供参考。     

对特辛基苯酚干扰雌激素受体作用的分子基础及其对ERβ亚型选择性结合的理论研究

对特辛基苯酚(4-tert-octylphenol,PTOP)是一种环境内分泌干扰物。已有研究发现虽然其能够直接与雌激素受体(estrogen receptor,ER)的两种亚型(ERα,ERβ)结合并产生干扰效应,但其结合能力却各不相同,PTOP对ERβ表现出更强的结合活性。为了探究PTOP与ER结合的分子机制及其对ER两种亚型的选择性机制,本文采用分子动力学模拟对PTOP-ER复合物进行了研究,并利用MM-GBSA方法计算了结合自由能。结果表明,范德华作用是维持PTOP与ER结合的主要驱动力;而极性相互作用的差异是导致PTOP对ERα和ERβ产生选择性结合的重要因素,PTOP与ERα之间的极性溶剂化作用阻碍了两者的结合。将PTOP与ER的天然底物雌二醇进行比较,发现PTOP与ER口袋之间缺乏氢键稳定二者结合,因此PTOP的结合活性较低。计算模拟亦指出了PTOP结合过程中发挥重要作用的关键氨基酸。以上计算结果将有助于我们进一步理解PTOP影响ER介导生理过程的干扰机制。     

酵母双杂交技术构建稀有鮈鲫不同雌激素受体亚型的重组荧光酵母

目前关于环境雌激素(environmental estrogens,EEs)的效应评估大多数是基于人的雌激素受体(estrogen receptor,ER)的离体检测,缺乏EEs对鱼类ER影响的研究。本研究利用酵母双杂交技术构建模式生物稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母,用以快速检测EEs的雌激素活性并研究不同ER亚型对17β-雌二醇(E_2)敏感度的差异。采用反转录多聚酶链反应法获取稀有鮈鲫ERα、ERβ1和ERβ2的配体结合域(LBD)序列,构建并鉴别诱饵质粒pGBKT7-ERα-LBD、p GBKT7-ERβ1-LBD和pGBKT7-ERβ2-LBD。将诱饵质粒和猎物质粒pGAD424-GRIP1同时转化荧光酵母Y187-Luc,分别构建3株稀有鮈鲫ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1重组荧光双杂交酵母,并考察了E_2、双氢睾酮(DHT)、9-顺维甲酸(9-cis RA)、三碘甲状腺原氨酸(T_3)和孕酮(PG)对荧光素酶的诱导情况。结果显示:ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1重组荧光双杂交酵母能够专一性地被E_2诱导产生荧光素酶,并存在显著的剂量-效应关系,半数效应浓度(EC_(50))值分别为1.98×10~(-9)、1.77×10~(-10)、和3.52×10~(-10)mol·L~(-1),对E_2的敏感程度排序为:ERβ1-GRIP1>ERβ2-GRIP1>ERα-GRIP1。研究表明,稀有鮈鲫不同ER亚型对E_2的响应具有差异,3株重组荧光双杂交酵母不仅可以应用于快速识别内分泌干扰物中的类雌激素物质,分析稀有鮈鲫不同ER亚型对EEs的敏感性,解析雌激素污染物对稀有鮈鲫的作用机制,评估鱼类接触EEs的潜在风险,以期为水质保障和污染治理提供重要依据。     

酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母

应用酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母,用以检测类/抗雌激素化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.采用多聚酶链反应(PCR)法扩增人雌激素受体(hER)基因,构建诱饵质粒pGBKT7-ER LBD;分别提取并纯化两种含有ER共激活因子基因的靶质粒pGAD424-GRIP1和pGAD424-SRC1;诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Y187,于营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)上筛选阳性菌落,分别构建两种ER双杂交酵母ER+GRIP1和ER+SRC1.考察双杂交酵母与不同激素:17β-雌二醇(E2)、二氢睾酮(DHT)、孕酮(PG)以及三碘甲状腺原氨酸(T3)的结合情况,并考察了雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬(4-OHT)与酵母的相互作用.结果表明:ER+GRIP1和ER+SRC1酵母均能够专一性的和E2结合,并存在显著的剂量-效应关系,E2对ER+GRIP1和ER+SRC1酵母β-半乳糖苷酶活性诱导的EC50值分别为7.3×10-11mol·L-1和1.5×10-10mol·L-1,其中ER+GRIP1酵母细胞诱导产生的酶活性值明显高于ER+SRC1酵母细胞.4-OHT能够抑制E2诱导ER+GRIP1酵母细胞产生的酶活性,并存在显著的剂量-效应关系,IC50值为1.0×10-7mol·L-1.表明重组人雌激素受体基因酵母可以用于检测化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.     

基于ELISA的受体竞争结合法检测环境雌激素(Competitive Estrogen Receptor Binding Based ELISA for Detection of Estrogen in Environment)

为建立环境雌激素的体外快速筛选方法,采用免疫测定介导受体竞争结合试验定量检测环境雌激素.将17β-雌二醇-BSA固定在微孔板上,环境雌激素与微孔板上的17β-雌二醇-BSA竞争性地与雌激素受体结合,与微孔板上17β-雌二醇-BSA结合的受体与雌激素受体的抗体、雌激素受体抗体的二抗形成一个三明治形式的复合物,通过显色剂显色,最后用比色法对试验结果进行定量.结果表明,环境雌激素的浓度与溶液吸光度值成负相关.定量研究可以得到环境雌激素剂量-效应关系曲线,在一定浓度范围内(10ng·L-1～100μg·L-1),溶液的吸光度值与环境雌激素的浓度直接呈现良好的线性关系(R2=0.9583).利用这种方法能检测到的标准品雌二醇的最低浓度为10ng·L-1.以上结果表明,本方法检测环境雌激素操作简便,具有广泛的应用前景.     

对羟基苯甲酸酯雌激素活性物种差异的理论研究

受体功能区结构的分化是导致部分环境污染物内分泌干扰效应种间选择性的主要原因之一.本研究采用同源模建的方法构建了青鳉的雌激素受体α亚型(medERα)配体结合区的三维结构,并与人的hERα结构进行比对.在此基础上,经过分子对接分析了对羟基苯甲酸酯类化合物及其含氯衍生物与两个物种ERα作用模式的差异及其分子基础,并基于此提...     

雌激素受体作为壬基酚的主要作用靶点导致机体免疫毒性

雌激素作为一类重要的性腺类固醇化学信使,已经被证实能够直接调节机体免疫反应,因此,一些具有拟雌激素特性的环境内分泌干扰物(endocrine disruptors,EDs),会通过影响雌激素相关信号通路对免疫系统产生干扰作用。壬基酚(nonylphenol,NP)作为典型的环境内分泌干扰物,已有大量的文献报道其通过拟雌激素特性或干扰雌激素的合成、分泌、转运以及与靶点的结合,破坏机体生殖功能以及神经-免疫-内分泌系统,影响整体生理平衡与稳定。近年来,NP对免疫系统的干扰作用逐渐引起重视,研究发现,NP暴露会引起小鼠免疫器官及免疫细胞的发育异常,并且会导致新生小鼠肝毒性,肝脏细胞内炎性因子TNF-α、IL-1β分泌增加。除NP作为配体干扰雌激素信号通路外,尚未发现其他明确的分子机制解释NP造成的免疫毒性。本综述主要结合近年来相关的实验结果,总结了NP对免疫系统的潜在影响及其可能的分子机制。     

药品和个人护理用品(PPCPs)对环境的污染现状与研究进展

在过去的30多年中，有关有毒污染物的研究主要集中在工业化学物质和农药上。近5年多来，国外已经开始关注药品和个人护理用品（PPCPs）对环境的污染，但在我国还没有引起重视。国外的研究表明，合成麝香物质、显影剂、抗生素、雌激素、消炎止痛药、杀菌消毒剂等与人类生活密切相关的药品和个人护理用品在环境中普遍存在，但是其质量浓度通常非常低，多数情况下在ng/L～μg/L水平。粪便施肥和污水排放是PPCPs进入环境的主要途径。在常见的PPCPs中，抗生素和消炎止痛药在环境中检测出的频率最高，在地表水、地下水、饮用水、污泥、土壤等环境介质中，PPCPs在地表水中检测出的频率最高。目前关于PPCPs的研究主要集中在分析方法以及环境污染水平的调查，有关PPCPs在环境中的迁移转化规律，生态与健康风险以及PPCPs污染控制技术等方面的研究有待加强。     

西维因对雄性罗非鱼(GIFT Oreochromis niloticus)内分泌干扰效应的研究

在实验室条件下研究了西维因对罗非鱼的急性毒性以及在不同暴露浓度下的西维因(0.064,0.8和5mg·L-1)对雄性罗非鱼性腺系数、血清雌二醇、睾酮含量的影响以及对卵黄蛋白原的诱导效应,以期对其环境雌激素效应研究有所贡献。结果表明:西维因对罗非鱼的24、48、72和96h的LC50分别为30.21、25.16、19.76和17.86mg·L-1。长期暴露于低剂量的西维因中,会使雄性罗非鱼精巢系数降低;对其血清雌二醇的合成具有诱导作用,当浓度为0.8mg·L-1时,诱导作用最强,此时血清雌二醇的含量为218.83pg·mL-1;卵黄蛋白原的含量随着西维因浓度的升高,逐渐增多,当处理浓度为5mg·L-1时,达到最大为393.01μg·L-1;随着西维因浓度的升高,睾酮含量逐渐降低,西维因的浓度为5mg·L-1时,睾酮含量达到10.58mol·L-1,差异极显著(p<0.01),这可能是由于西维因对雄性罗非鱼具有雌激素效应。     

Acute toxicity of industrial endocrine-disrupting chemicals,natural and synthetic sex hormones to the freshwater planarian,Dugesia japonica

Many chemicals commonly occurring in surface water are found to be hormonally active. Fourteen compounds including four sex hormones, three synthetic hormones, one non-steroidal anti-androgen, and six industrial endocrine-disrupting chemicals were selected to examine their acute toxicities on the freshwater planarian, Dugesia japonica. Among all test chemicals, diethylstilbestrol had the highest toxicity. Relatively, the toxicities of the synthetic hormones were higher than the natural ones. Among the six industrial endocrine-disrupting chemicals tested, bisphenol A was the most toxic, with a 48-h LC₅₀ of 8.3 mg L^?1. Overall, the natural or synthetic hormones, other than estrone and estriol, were more acutely toxic to planarians than the industrial endocrine disruptors tested. The acute toxicities of the test chemicals to Dugesia japonica were in the same order of magnitude as those to Daphnia magna based on available published data. Despite this study used non-environmentally relevant levels, such kinds of chemicals do not exist singly in the aquatic environment, but typically act in synergistic and/or additive ways in the complex environmental mixtures, and the total estrogen equivalents are much higher than a single chemical. This study stands as a starting point for other acute and chronic assays, namely using mixtures.     

羟基多溴联苯醚(OH-PBDEs)小鼠肝脏微粒体体外代谢及对雌激素代谢的影响研究

羟基化多溴联苯醚(OH-PBDEs)是一类具有内分泌干扰效应的酚类化合物,以小鼠肝脏微粒体作为研究对象,考察了OH-PBDEs的体外代谢行为及对雌激素代谢的影响。研究结果发现,4种OH-PBDE均能够代谢,其代谢率大小为6-OH-BDE-996’-OH-BDE-996-OH-BDE-1375’-OH-BDE-99,表明羟基官能团(-OH)与醚键及溴原子处于邻位时,表现出较高的代谢率; 4种OH-PBDE对3种天然雌激素包括雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)、雌三醇(E3)的代谢表现出不同作用,整体来说,对E1和E2代谢随着OH-PBDE浓度的增加抑制作用逐渐增强,对E3代谢则表现出促进作用,但是对人工合成的雌激素17α-炔雌醇(EE2)无明显影响;对E2代谢产物2-羟基雌二醇(2-OH-E2)的生成量定量表征表明,除6-OH-BDE-99促进了2-OH-E2的生成量,其余3种OH-PBDE随实验添加浓度的增加,抑制了2-OH-E2的生成量,这可能与酶介导的不同代谢机制有关。     

腺苷酸环化酶抑制剂体外筛选模型的建立及应用

腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)通过调节环磷酸腺苷(cyclic adenosine cyclophosphate,cAMP)的合成从而调控细胞相关功能.在卵巢中,cAMP调控卵母细胞的发育及卵子的成熟,cAMP含量变化影响下游芳香化酶的表达,进而影响雌激素的生物合成.为开发靶向AC的候选药物,根据AC1、AC2两个活性区域,利用大肠杆菌系统克隆表达可溶ⅠC1-ⅡC2重组融合蛋白,使用ATP检测试剂盒,检测ⅠC1-ⅡC2的催化活性,从而建立有效的ⅠC1-ⅡC2蛋白体外筛选抑制剂模型.利用该模型筛选了由2 861个化合物组成的文库.化合物来那替尼(neratinib)可明显抑制ⅠC1-ⅡC2蛋白活性,且呈浓度依赖性,其IC50为10.2±0.152 2μmol/L.进一步研究发现,来那替尼可显著降低人卵巢颗粒细胞KGN细胞中芳香化酶的表达,并且抑制雌激素的生物合成.本研究通过建立蛋白体外筛选模型发现来那替尼具有抑制AC的活性,结果可为开发新的靶向芳香化酶治疗多囊卵巢综合征等疾病的候选药物提供参考.(图5表1参28)     

固相萃取-LC-MS法检测水中痕量雌激素

研究了乙腈 /水、乙腈 /甲醇 /水、甲醇 /水三种不同流动相的条件下 ,LC MS分析雌酮 ,雌二醇 ,雌三醇 ,炔雌醇四种对象物质的灵敏度 ,发现流动相对灵敏度影响较大 ,不同流动相的对象物质的仪器检出限分别为 :330— 75 0ng·l- 1 ,1 0 0— 30 0ng·l- 1 ,5 0— 1 0 0ng·l- 1 .用固相萃取 LC MS检测杭州地区河水 ,在 8个采样点中 ,有 7个检测出了炔雌醇 ,其浓度范围在 1 1 7— 3 35ng·l- 1 之间 ,一个采样点检测出雌二醇 ,其浓度为 0 32ng·l- 1 .