盐生杜氏藻CPD光裂合酶FAD结合结构域Gln336在逆境胁迫下的修复活性

为了解盐生杜氏藻环丁烷嘧啶二聚体(CPD)光裂合酶的作用机制,通过定点突变的方法对其黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域α13中保守氨基酸残基Gln336进行突变,并比较野生型菌株PGEX-4T-1-Ds PHR2(WT)和突变菌株PGEX-4T-1-Ds PHR2-Q336H(Q336H)表达的光裂合酶在体内外的光修复活性及其在不同盐浓度下修复光损伤的效果.结果显示:采用Dpn I法定点突变,成功获得盐生杜氏藻CPD光裂合酶突变体Q336H的基因,构建表达载体并导入到大肠杆菌BL21(DE3)中,构建了突变菌株Q336H.体内外活性研究发现,野生型菌株的CPD光裂合酶的活性显著大于突变菌株Q336H(P0.05).在不同盐浓度条件下,野生型菌株存活率基本没有变化,而突变菌株Q336H随着盐浓度增加存活率迅速下降.在体外修复实验中,甘油浓度对突变酶Q336H活性影响显著大于对CPD光裂合酶活性影响(P0.05).甘油浓度增加导致突变酶Q336H修复活性逐渐下降,而CPD光裂合酶活性变化趋势是先增加后下降.因此,Gln336对盐生杜氏藻CPD光裂合酶活性具有重要影响,而且可能是该酶在盐胁迫下发挥功能的关键氨基酸残基.     

麻疯树小热激蛋白基因JcHSP15.9的原核表达及耐热胁迫

小热激蛋白(sHSPs)是植物在逆境条件下产生的一类具有分子伴侣活性的应激蛋白,本研究拟构建原核表达载体并表达具生物学活性的麻疯树小热激蛋白以进一步研究其功能及应用.从麻疯树胚乳cDNA文库中获得全长为652 bp的cDNA序列,包含一个426 bp的开放阅读框,编码分子量大小约为15 926.13的胞质Ⅰ型小热激蛋白,命名为JcHSP15.9.通过构建原核表达载体,得到BL21(DE3)plysS/pET32a-HSP重组菌株.用JcHSP15.9在大肠杆菌中的过量表达来研究它的耐热胁迫能力,发现在常温(37℃)下重组菌株与野生型菌株生长曲线基本相似,但在高温(50℃)下重组菌较对照组菌株存活率有了显著的提高,推测JcHSP15.9可能与麻疯树的耐热胁迫有关.通过镍亲和层析柱纯化得到纯度较高的JcHSP15.9蛋白,分子量大小与预期一致,蛋白条带单一清晰.     

产甘油假丝酵母抗逆转录因子的过表达对酿酒酵母耐酸胁迫性的影响

以具有优良环境耐受性的产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)为研究对象,考察其抗逆转录因子对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酸胁迫耐受性的影响.分别克隆获得C.glycerinogenes和S.cerevisiae的转录因子基因haa1和asg1,在S.cerevisiae W303-1A中分别过表达这4个基因,继而进行摇瓶试验考察重组菌株的酸耐受性.结果显示,过表达不同转录因子均能提高细胞酸耐受性,其中90 mmol/L乙酸时重组菌S.cerevisiae/Cghaa1和S.cerevisiae/Cgasg1的生物量与S.cerevisiae/Schaa1和S.cerevisiae/Scasg1相比分别提高了44.3%和18.9%.q RT-PCR发现,与Schaa1和Scasg1相比,过表达Cghaa1和Cgasg1能够显著上调下游酸耐受相关基因的表达水平.酸胁迫下乙醇发酵结果显示,相比对照组,重组菌S.cerevisiae/Cgasg1的乙醇产量提高11.1%.上述结果表明转录因子HAA1和ASG1均能提高酿酒酵母酸耐受性和酸胁迫下乙醇产量,其中Cghaa1和Cgasg1效果更为明显,结果可为提高酿酒酵母酸耐受性提供新的基因资源和思路,为进一步挖掘C.glycerinogenes抗逆基因提供借鉴.     

矮牵牛花香基因BSMT3的cDNA克隆与表达特征分析

以矮牵牛花瓣总RNA为模板,RT-PCR方法克隆得到其BSMTcDNA,全长1100bp,编码357aa,与已有报道phBSMT1(GenBank No.AA0501)和phBSMT2(AAO45013)的同源性分别达到97.76%和98.6%,该序列在Gen-Bank登录号为DQ494491,命名为phBSMT3.构建的BSMT3 cDNA的原核表达质粒pGBSMT转化BL21(DE3)E.coli,获得的重组菌株经0.01mol/LIPTG诱导后得到正确表达的GST-BSMT融合蛋白带,以纯化的重组表达蛋白免疫家兔获得其兔抗免疫血清.免疫组化研究结果证实,矮牵牛花香基因BSMT在花瓣、花管中的表达量较其它组织的表达量高.图5参24     

渗透压对产甘油假丝酵母磷酸果糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的调控

磷酸果糖激酶(PFK)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)分别是糖酵解途径(EMP)途径和磷酸戊糖途径(HMP)途径的关键酶,控制着流入两种途径的葡萄糖流量,对耐高渗产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)高效合成甘油、抵抗渗透压胁迫非常重要.为考察渗透压对产甘油假丝酵母这两个关键酶的影响,首先克隆得到编码产甘油假丝酵母G6PDH的Cgzwf基因及编码PFK亚基的Cgpfk1和Cgpfk2,并通过生物信息学分析、酶活检测及基因互补实验验证它们的功能.渗透压胁迫发酵(添加50 g/L NaCl)结果显示,菌株生物量未受渗透压影响,但甘油积累量增加了2倍.与对照相比,盐胁迫激活PFK但弱化了G6PDH活性.此外,盐胁迫下PFK活性表现出更为明显的先降低后升高的趋势,而G6PDH活性的变化则与对照基本相似,表明盐胁迫下碳流可能存在EMP-HMP-EMP形式的不同程度偏转.转录水平检测发现,在发酵中的甘油积累过程盐胁迫对上述酶基因转录的影响并不明显,表明细胞可能通过酶活性调节而不是主要依赖于转录调节来调控两种关键酶以适应耐渗长期胁迫和甘油合成的需要.综上,产甘油假丝酵母以调节关键代谢酶活性的方式来实现碳硫偏转,高产甘油,从而适应外界渗透压力,这一结果可为阐明产甘油假丝酵母耐高渗和高产甘油机制提供新的信息,为未来代谢改造该菌株打下基础.     

过表达IbOr基因甘薯增强抗盐性的生理机制

明确转基因甘薯对盐胁迫响应的生理机制,开发种植耐盐性强甘薯对有效利用盐渍化土地和缓解能源危机具有重要的理论与实践意义.以过表达IbOr基因甘薯及其非转基因甘薯为实验材料,通过室内水培试验,研究150mmol/L NaCl胁迫不同时期甘薯叶片光合参数和抗氧化酶活性等变化规律.结果显示,随着盐胁迫时间延长,甘薯叶片中叶绿素、类胡萝卜素含量及叶片净光合速率(P_n)、气孔导度、胞间CO_2浓度、蒸腾速率都显著降低,但转基因甘薯降低幅度更小.盐胁迫3 d后,转基因甘薯叶片中O_2—·和MDA含量分别为61.23μg/g FW和22.51μmol/g FW,而非转基因植株叶片中O_2—·和MDA含量分别达到80.56μg/g FW和31.92μmol,分别是转基因甘薯的1.31和1.42倍,相比于非转基因植株,盐胁迫后转基因甘薯叶片中具有较低水平的O_2—·和MDA含量.甘薯叶片中SOD、POD和CAT的活性在胁迫后都表现出先升高后降低趋势,且转基因甘薯的酶活性显著高于非转基因甘薯.Na~+含量在盐胁迫后也显著升高,胁迫9d后,转基因和非转基因植株叶片中Na~+含量分别达到25.44 mg/g DW和35.08 mg/g DW,分别是处理前的11.47倍和14.83倍,并且转基因甘薯Na~+含量显著低于非转基因甘薯.以上结果说明盐胁迫下转基因甘薯具有较低的活性氧含量并且膜脂的损伤较小,保持了相对较高的叶绿素含量且含较高类胡萝卜素含量进而维持相对较强的光合作用;转基因甘薯抗盐性的增强很可能通过提高甘薯抗氧化胁迫的能力来实现.     

来源于污染土壤的植物根际促生细菌对番茄幼苗的促生与盐耐受机制

从来源于盐碱地和重金属污染地的8株菌中筛选对盐胁迫下番茄幼苗具有明显促生作用的菌株,并研究这些菌株的相关生物学特性及其对番茄幼苗的盐耐受机制,检测菌株产1-氨基-环丙烷-1-羧酸(ACC)酶活、吲哚乙酸(IAA)产量、解磷、生物膜形成能力、耐盐性和菌株对盐胁迫下植株叶片中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性,叶片中丙二醛(MDA)、脯氨酸和叶绿素含量的影响.结果显示,其中4株菌(Pseudomonas protegens TM1109、Achromobacter sp.KY5104、Variovorax sp.TY4204和P.protegens KY4410)在0.7%盐胁迫下对番茄鲜重增长效果更好,增长率范围为33%-50%.盐耐受机制研究结果显示TY4204和KY5104通过诱导或增强SOD和POD活性来清除番茄体内氧自由基对番茄的损伤.它们也可以合成ACC脱氨酶来抗盐胁迫,同时通过降低叶片中MDA含量来减轻番茄在盐胁迫下的损伤.TM1109和KY4410虽然不产生ACC脱氨酶,IAA产量水平也较低,但可以在盐胁迫下通过诱导或增强SOD和POD活性来清除番茄体内氧自由基对番茄的损伤,具备溶解有机磷能力,且TM1109可溶解无机磷并具备良好的生物膜形成能力,有助于番茄对营养的吸收和生物膜对离子的选择性吸收以抵抗盐胁迫.本研究表明TM1109、KY5104、TY4204和KY4410菌株可以通过多种作用机制来缓解番茄盐胁迫并促进番茄的生长.     

Halomonas socia NY-011~T中四氢嘧啶合成基因簇ectABC和ectD的克隆及其功能鉴定

由ectA、ectB、ectC和ectD编码的酶可以催化对细胞起保护作用的四氢嘧啶类物质的生物合成,嗜盐菌新种Halomonas socia NY-011~T ectABC和ectD为四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的生产提供新的基因来源.通过SEFA-PCR步移方法从Halomonas socia NY-011~T中克隆ectA、ectB、ectC和ectD基因,并分别构建ectABC和ectD的原核表达质粒,在E.coli BL21(DE3)中异源表达,利用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定,通过ACQUITY UPLC MS/MS检测四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的生成.结果显示:H.socia NY-011~T的四氢嘧啶合成基因ectA、ectB、ectC形成基因簇ectABC(KP717055-57),大小为2 506 bp,四氢嘧啶羟化酶基因ectD大小为942 bp(KP717058),与近源种H.elongata DSM258同源性分别为81%和78%;SDS-PAGE检测到4种融合蛋白,大小(M_r)分别为21.6×10~3、46.4×10~3、14.4×10~3、55.3×10~3,与预期相符;利用ACQUITY UPLC MS/MS发现仅表达ectABC的重组菌株[E.coli BL21(DE3)/pltac-ABC]中只存在四氢嘧啶,而在表达ectABC和ectD的重组菌株[E.coli BL21(DE3)/pltac-ABC/pETect D]中检测到四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶.本研究从H.socia NY-011~T中分离得到的四氢嘧啶类物质的合成基因,能够在E.coli BL21(DE3)中异源表达并行使功能,为四氢嘧啶类物质异源生产提供了新的基因来源.     

高浓度氯化镍胁迫下酿酒酵母组蛋白H4K5去乙酰化调控金属硫蛋白基因的表达

金属硫蛋白(MTs)具有重金属解毒功能.组蛋白乙酰化/去乙酰化是表观遗传因子之一,并且参与基因的表达调控.然而,组蛋白乙酰化/去乙酰化在真核生物响应氯化镍胁迫过程中对金属硫蛋白基因的调控作用还不清楚.以酿酒酵母突变株H4K5R(该菌株模拟组蛋白H4赖氨酸5去乙酰化的状态)为试验材料,采用流式细胞术检测不同浓度氯化镍处理下酵母细胞的死亡率,发现突变菌株的生长状态和细胞存活率明显优于野生型菌株BY4741;qRT-PCR检测5 mmol/L氯化镍处理后,酿酒酵母金属硫蛋白基因Cup1、Crs5、Sod1及转录因子Cup2的表达量.结果显示,高浓度氯化镍胁迫下,野生型菌株中基因的表达水平均显著降低;耐镍菌株H4K5R中,金属硫蛋白基因Cup1表达量上调7.4倍,Crs5表达量显著下调2.56倍,Sod1表达量不显著上调,转录因子Cup2表达量上调3.81倍,并且表达水平均显著高于镍处理后的BY4741.本研究表明突变菌株H4K5R具有较强的镍耐受性;镍胁迫下,突变菌株中金属硫蛋白Cup1与转录因子Cup2的表达变化趋势与BY4741相反,说明组蛋白H4K5的去乙酰化可能通过改变基因表达模式,从而在酿酒酵母响应镍胁迫时发挥重要的调控作用.(图6表1参38)     

香菇生长发育过程中漆酶基因家族的转录表达

香菇可分泌胞外漆酶降解木质素作为自身营养物质.为探究不同漆酶基因在香菇生长发育过程中的不同作用,采用RT-q PCR方法分析10个漆酶基因在香菇4个不同发育阶段(菌丝体、原基、幼小子实体和成熟子实体)的转录表达情况.结果显示,5个漆酶基因(Lelac1、Lelac3、Lelac5、Lelac8和Lelac9)的转录表达表现出差异性和发育阶段特异性,另外5个漆酶基因(Lelac2、Lelac4、Lelac7、Lelac10和Lelac11)只表现出差异性.Lelac2和Lelac3随着香菇的生长,其转录表达量持续上升,可能与成菇过程有关;Lelac1和Lelac7在菌丝体阶段大量表达,可能参与菌丝体的生长代谢;Lelac8在原基时期表达量显著高于其他时期,与原基分化有关.本研究表明漆酶基因在香菇不同发育阶段的转录表达存在差异,结果可为进一步阐明漆酶在香菇生长发育阶段的作用奠定基础.     

碱性果胶酯裂解酶工程菌的构建

从本研究室筛选的BacillussubtilisWSHB04-02菌株中扩增出编码碱性果胶酯裂解酶的结构基因PL,将其插入大肠杆菌分泌表达载体pET22b( )多克隆位点,得到重组载体pET22b( )PL.序列分析表明,所获PL基因与已报道的B.subtilisSO113的PL基因的同源性为98%.重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达.SDS-PAGE分析显示,表达产物的分子量(Mr)均为43×103,同核酸序列测定所推导的值相符.该工程菌经IPTG诱导后,胞内酶活为8U/mL.研究发现,碱性果胶酯裂解酶不仅在胞内有酶活,胞外也有酶活,说明所构建的表达体系可使该酶向胞外分泌.图3表1参6     

香蕉MaMPK1基因的克隆与表达模式

为研究香蕉MAPK1的序列特征及其在不同激素处理、逆境胁迫下的表达趋势,以‘天宝蕉’为材料,采用RTPCR技术克隆MaMPK1并对其进行生物信息学分析和不同处理下的表达模式分析.结果显示该基因编码区长为1182bp,可编码393个氨基酸.其编码蛋白具有STKc_TEY_MAPK结构域,属于MAPK基因家族TEY亚型A亚家族,是不稳定的脂溶性亲水酸性蛋白,无信号肽和跨膜结构,有多个磷酸化位点.亚细胞定位预测结果显示MaMPK1主要定位于细胞核.蛋白互作预测结果显示该蛋白与HSFA4A存在互作,暗示其可能在香蕉抗热反应过程中发挥作用.启动子顺式作用元件预测结果显示MaMPK1启动子包含多种激素和逆境胁迫相关作用元件.定量分析结果显示MaMPK1的表达受SA、45℃、低温和盐胁迫抑制,受茉莉酸甲酯(MeJA)和枯萎病菌侵染诱导上调,在脱落酸(ABA)处理后期极显著上调表达.本研究表明MaMPK1广泛参与香蕉逆境胁迫应答.(图9表1参35)     

拟南芥硫酯酶基因(atfata)在大肠杆菌中的表达及其对游离脂肪酸合成的影响

硫酯酶催化脂酰ACP(酰基载体蛋白)水解生成游离脂肪酸和ACP载体蛋白,能够解除脂肪酸合成与磷脂合成的偶联,是获得游离脂肪酸的关键基因.将拟南芥的硫酯酶基因atfata克隆到原核表达载体pET30a上,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了His-tag融合蛋白,经SDS-PAGE检测获得特异性表达条带.对该重组菌株进行摇瓶发酵实验,GC-MS检测表明其与对照菌株脂肪酸组成并未发生变化;但其脂肪酸产量达到232.06 mg/L,比对照菌株提高了70%;同时胞外游离脂肪酸产量达到了33 mg/L,占总脂肪酸含量的15%,是野生菌株胞外脂肪酸产量的7倍.图3表2参17     

香蕉含VQ基序蛋白基因MaVQ1的克隆与表达

克隆香蕉含VQ基序蛋白基因MaVQ1,研究其序列特征及其在不同激素处理和逆境胁迫下的表达模式.采用RTPCR技术从‘天宝蕉’中克隆了该基因,对其进行生物信息学分析,并利用实时定量PCR技术(qRT-PCR)研究它在不同组织部位和不同激素、不同逆境胁迫处理下的表达情况.结果显示:MaVQ1编码序列(CDS)长为459 bp,可编码一个分子式为C_(732)H_(1164)N_(210)O_(207)S_3、分子量为16 314.76、等电点为10.19的不稳定亲水性蛋白.MaVQ1含有保守的VQ结构域,不含跨膜结构和信号肽,与小果野蕉VQ亲缘关系最近.亚细胞定位预测结果显示MaVQ1主要定位在细胞核.蛋白互作预测结果显示MaVQ1与其他香蕉VQ蛋白以及WRKY互作系数最高.启动子顺式作用元件预测结果显示MaVQ1启动子包含多种光响应元件、激素响应元件和逆境胁迫相关作用元件.转录因子结合位点分析结果显示其启动子上存在大量的ERF结合位点.qRT-PCR结果显示:MaVQ1在不同组织部位中的表达无显著差异,其表达受茉莉酸、脱落酸和低温显著诱导,受高温和干旱抑制.本研究表明,与其他植物VQ类似,MaVQ1的表达受多种激素和逆境影响,暗示其可能在香蕉抗逆防御反应过程中发挥着重要调节作用.(图6表2参33)     

香蕉MaPFK基因家族鉴定、MaPFK3克隆和表达

为研究香蕉中MaPFK基因的功能和生物学特性,采用生物信息学分析法对香蕉A基因组的MaPFK基因家族成员进行鉴定、蛋白特性分析、分子进化树分析、FPKM值分析,同时以‘天宝蕉’为材料,通过RT-PCR技术克隆MaPFK3基因,进行生物信息学分析;采用qRT-PCR技术进行低温胁迫下的表达分析.结果表明,MaPFK家族包含12个成员,分子进化树分析可分为3类,FPKM值分析表明MaPFK成员在13、4、0℃不同低温胁迫下有不同程度的上调或下调表达.采用RT-PCR技术克隆了MaPFK3,其基因编码区长1 617 bp,预测编码538个氨基酸,MaPFK3编码蛋白属于PFK超家族,是不稳定的酸性亲水蛋白,无信号肽,亚细胞预测定位于细胞质;MaPFK3启动子顺式作用元件预测分析结果显示,MaPFK3启动子含有光响应、激素响应以及与逆境胁迫相关的作用元件.qRT-PCR分析结果显示,香蕉MaPFK3基因的表达具有组织差异性,且表达量为叶片>假茎>根;低温胁迫引起‘天宝蕉’中MaPFK3基因下调表达,在13、4、0℃不同低温胁迫下,MaPFK3的表达量为13℃<4℃<0℃.本研究表明MaPFK基因家族成员能在香蕉应对低温胁迫的过程中发挥着重要作用.(图11表2参32)     

海马齿小热激蛋白SpHSP18.1基因的克隆及盐胁迫表达分析北大核心CSCD

为探究海马齿高盐环境耐受性的分子机制,根据海马齿c DNA文库序列设计引物,采用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术克隆得到海马齿小分子热激蛋白Sp Hsp18.1基因序列.Blast分析表明,该c DNA序列(968 bp)含完整开放阅读框(ORF)全长为489 bp,编码162个氨基酸.等电点(p I)为6.19,分子量(Mr)大小为1860 5.90.Sp HSP18.1编码氨基酸序列具有分子伴侣蛋白特有的ACD保守区域(Alpha crystallin domain),与拟南芥、西瓜等植物的细胞质I型小热激蛋白具较高同源性(>75%).将Sp Hsp18.1基因克隆到PUCm-T原核表达载体上,得到重组菌株,通过过量表达探究其耐热胁迫能力.结果表明,在37℃下重组菌株与野生型菌株的生长曲线基本相似,但在高温(45℃)下,重组菌株较对照组菌株存活率有显著提高.荧光实时定量PCR分析表明,在不同浓度海水培养条件下,海马齿根部均表达Sp Hsp18.1基因,且随着海水浓度的增加,该基因的表达量呈现上升的趋势.说明Sp Hsp18.1基因在海马齿应答高盐胁迫过程中起到一定的作用.     

木聚糖酶基因xynB在不同大肠杆菌表达系统中的表达比较

从黑曲霉(Aspergillus niger)nl-1中克隆获得木聚糖酶基因xynB.该基因全长745 bp,含有67 bp内含子,与公布的黑曲霉xynB基因有较高的同源性.将PCR扩增的木聚糖酶成熟肽基因和含有信号肽的基因分别连接到表达载体肠杆菌Top10 F’、DH10B和两种BL21宿主中获得重组菌株.通过IPTG诱导,xynB基因在重组菌株中获得特异性表达.表达产物以胞内可溶性蛋白和不溶性包涵体形式存在.诱导4 h,重组菌株pTrc-99a-xynB[BL21 condon plus(DE3)]表达量最高,胞内酶活达到299 IU/L.重组质粒pTrc-99a-xyn B(S)在不同宿主胞内和胞外均能分泌目的蛋白,诱导10 h,胞外酶活pTrc-99a-xynB(S)[BL21 condon plus(DE3)]达到347 IU/L.而pET-20b-xynB(S)在两种BL21宿主中均不表达.经SDS-PAGE分析,以pTrc-99a和pET-20b作为表达载体时,重组蛋白相对分子质量分别约为45×103和30×103.与pET-20b相比,pTrc-99a以及自身信号肽的引导更有利于重组木聚糖酶的表达.     

关键基因过表达提高酿酒酵母抑制剂耐受性及乙醇发酵性能

木质纤维素预处理过程中会产生多种抑制物,抑制酿酒酵母细胞生长及乙醇发酵性能,为挖掘耐性基因、构建新的菌株,进一步提高酿酒酵母对这些抑制物的胁迫耐受性,研究在硫酸锌添加条件下转录组学分析过程中筛选到的可能关键基因ADE17、SSZ1、SET5、PPR1、OGG1和YKL222C过表达对酿酒酵母环境胁迫耐受性的影响.结果显示,不同基因过表达对酿酒酵母在多种抑制物胁迫条件下生长性能的影响不同,其中ADE17过表达对菌株在乙酸、糠醛、苯酚、丙酸和氯化钠胁迫条件下的生长提升最显著,而OGG1和SSZ1过表达对菌株生长的影响相对较弱.进一步对菌株进行驯化,在混合抑制物条件下驯化得到的BADE17-2和BADE17-4菌株延滞期比对照菌株BADE17缩短23 h.上述研究表明,硫酸锌添加从多方面影响了酿酒酵母耐受性,且关键基因过表达对不同环境胁迫条件具有多样性的影响,并且通过基因过表达和驯化方式结合可进一步提高酿酒酵母环境胁迫耐受性,提高纤维素乙醇发酵效率.     

茶树RING-finger型E3泛素连接酶基因CsSDIR的克隆与表达

蛋白质泛素化修饰广泛参与植物的生长发育及逆境胁迫响应,其中RING-finger型E3泛素连接酶基因salt and drought induced ring finger1(SDIR1)在植物抗逆中具有重要的作用.为了解茶树SDIR1(CsSDIR1)在抗逆应答中的作用机制,采用RT-PCR技术从茶树中克隆CsSDIR1的全长cDNA序列及启动子序列,对其生物信息学特征进行分析,并采用qRT-PCR技术检测该基因的组织表达特异性及在不同逆境胁迫下的表达模式.结果显示,CsSDIR1基因的开放阅读框(ORF)长831 bp,编码276个氨基酸,蛋白质分子量(Mr)为30.085×103,理论等电点为6.54;氨基酸序列分析表明,CsSDIR1属于疏水性蛋白、定位在胞内膜上,与其他植物中的SDIR1相似性较高,在其N-端和C-端分别含有2个保守的跨膜结构域和C3H2C3 RING finger功能域;CsSDIR1与猕猴桃关系最近. CsSDIR1上游启动子含多个与干旱胁迫和盐胁迫响应相关的元件.表达分析显示,CsSDIR1在茎中的表达量显著高于根、叶和花;ABA、干旱和高盐诱导其表达,低温抑制CsSDIR1的表达.根据上述结果推测CsSDIR1基因可能参与了茶树的抗逆响应.     

人α-防御素HNP-2基因在大肠杆菌中的表达

通过半化学合成方法获得具有大肠杆菌密码子偏爱性的人α-防御素(Human α-defensin或human neutrophil peptide,HNP)HNP-2基因.将其克隆到pET-32a( )表达载体,构建了重组表达质粒pET-32a( )/HNP-2.分别转化大肠杆菌BL21(DE3),ER2566以及Origami B(DE3)宿主菌,经过表达条件的优化,结果在大肠杆菌Origami B(DE3)宿主菌中得到了HNP-2基因高效率可溶性的表达,融合蛋白表达量占细菌总蛋白的60%以上.为避免表达产物水解,得到更稳定的人α-防御素,尝试以环化形式和酰胺化形式表达人α-防御素.为得到环化形式的表达,采用intein作为工具,利用其可剪接extein的特点,将其N端区域和C端区域分别融合到HNP-2的C端和N端,其两端的intein片段可将其拼接成环肽.以此为基础构建了环化表达质粒,并对表达条件进行了探索.本文采用了一种新的酰胺化方法,即将intein与HNP-2融合表达,intein对目的短肽进行酰胺化修饰.图6表1参16