大肠杆菌植酸酶的原核表达及酶学性质

将大肠杆菌植酸酶appA摹因重组于表达载体pET32a中,导人大肠杆菌Origami(DE3)构建工程菌Origami(DE3)-pET32aappA.对表达的appA重组植酸酶经Ni柱亲和纯化、SDS-PAGE分析表明,纯化后条带单一,酶的纯度较高.对其酶学性质的研究表明,该酶反应的比活力为3.36×106 U/mg;最适pH为4.5;最适温度为60℃ ;在80℃和85℃的耐干热能力超过耐湿热能力;在37℃下,Mg2+、Ca2+、Mn2+对酶活性有促进作用,CO2+、Cu2+、K+对酶活性有不同程度的抑制作用,而Fe3+和Zn2+对酶活性有强烈的抑制作用;此外,该酶还具有非常好的抗胃蛋白酶水解的能力和部分抗胰蛋白酶水解的能力.图8表1参21     

重组植酸酶appAM8的异源表达与性质比较

为比较在不同宿主中表达的大肠杆菌植酸酶突变体app AM8的性质,将app AM8基因分别在大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GS115中进行表达,对纯化后的植酸酶进行酶学性质分析与比较.结果显示:(1)在大肠杆菌中表达的app AM8(E-app AM8)和酵母中表达的app AM8(P-app AM8)的最适p H值均为4.5,最适反应温度均为65℃,与野生型的app A的最适p H无明显区别,比app A的最适温度高了5℃;(2)经SDS-PAGE检测,E-app AM8分子量(Mr)大小为47×103,而P-app AM8为53×103左右,由于在酵母中的糖基化修饰电泳显示为两条带;(3)在60-80℃之间,E-app AM8的热稳定性性明显下降,而且在70℃处理15 min后,E-app AM8残余活性仅为4%,而P-app AM8仍保留50%的残余活性,表明酵母表达的植酸酶经过糖基化修饰后提高了酶的热稳定性.(4)E-app AM8的Km=0.245 mmol/L,Vmax=3196 U/mg,P-app AM8的Km=0.36 mmol/L,Vmax=3333 U/mg.本研究表明,糖基化修饰对植酸酶app AM8的热稳定性起着重要作用,8个位点的突变对该植酸酶的稳定性也起到了一定作用.     

产碱杆菌DN25中降氰酶的分离纯化及生化特性

以一株可降氰的产碱杆菌DN25为酶来源,通过超滤、30 mg/mL硫酸鱼精蛋白沉淀、30%～70%硫酸铵盐析和Phenyl-Toyopearl 650M疏水层析等步骤,获得比活力为44 U/mg的纯化酶制剂.在确定酶浓度、反应时间等氰降解活力测定条件后开展酶学性质研究,试图为将来氰降解代谢机理的深入研究和菌株的基因工程改造提供理论基础.研究结果表明,此纯化酶催化氰化物水解的最适pH值为8.0,最适温度为30℃.该酶在pH 7.0～8.0区域稳定,而在pH>9时会很快失活;在30℃保存10 h,酶活力保持稳定,高于60℃,酶快速失活.加入甘氨酸稳定剂,在60℃下保存20 min酶活仍可保留19.6%.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为3.11 mmol/L,最大反应速率Vmax为0.23 mmolL-1min-1.     

一种田头菇属真菌新记录种的生物学与产酶特性

田头菇是重要的经济食用菌类型,目前我国报道种仅有10个.为驯化栽培和开发利用新的田头菇属食用菌种质资源,以采集自北京延庆的我国新记录种菌核田头菇(Agrocybe tuberosa)GSM-12菌株为材料,研究了菌丝生长的最适碳源、氮源、C/N比、最适温度、最适pH值等生物学特性,以及菌丝体液体发酵产漆酶、蛋白酶、植酸酶和核糖核酸酶的特性.结果显示,菌丝生长的最适碳源为蔗糖,最适氮源为黄豆粉,最适C/N比为20/1-30/1,最适温度为24℃,最适pH为7.0.产酶特性研究显示,GSM-12菌株具有漆酶、植酸酶和核糖核酸酶活性,菌丝体中酶活较高,分别为(77.28±10.44)U/mg、(61.01±2.71)U/mg和(21.13±0.60)U/mg.本研究表明菌株GSM-12可以利用常规营养元素实现营养生长,同时菌丝体液体发酵具有良好的产酶特性.     

热解糖高温厌氧杆菌β-葡萄糖苷酶的重组表达与酶学性质

β-葡萄糖苷酶是纤维素分解酶系中的重要组成部分,为从嗜热微生物中挖掘酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶,解决β-葡萄糖苷酶在工业应用方面普遍存在的活力偏低、稳定性不足、易受产物抑制等问题,通过密码子优化、基因合成和分子克隆技术,从热解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷酶基因bglY,构建重组表达载体pET22b-bglY,并转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,经IPTG诱导获得可溶性表达,采用Ni-NTA亲和层析法获得纯酶,并探究其酶学性质.结果显示,BglY属于GH1家族成员,分子量为52 × 10~3,最适反应温度65℃,70℃的半衰期达 1 h;最适反应pH 6.5,在pH 5-10范围内稳定;p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG)为底物时比活为420.2 ± 5.6 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率V_(max)分别为2.1 ± 0.4 mmol/L和909.1 ± 6.2 μmol min~(-1) mg~(-1);该酶对β-1,4糖苷键的底物具有水解偏好性,也可以水解纤维二糖和乳糖;5 mmol/L Fe~(3+)、Fe~(2+)、Cr~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)和EDTA对酶有激活作用,1% SDS完全抑制其活性;该酶可以抵抗产物葡萄糖的反馈抑制,且0.1-0.6 mol/L浓度的葡萄糖对酶具有激活作用,其中0.4 mol/L葡萄糖可提升活性至1.3倍,当葡萄糖浓度超过0.6 mol/L时,酶的活性才开始出现抑制.本研究表明BglY是一个葡萄糖激活型β-葡萄糖苷酶,其酶学性质优异,反应pH和温度范围较广且稳定,同时能水解天然底物纤维二糖和乳糖,可在提高纤维素生物质向葡萄糖的酶促转化等方面发挥应用潜力.(图7表3参32)     

基于杀螨剂靶标朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶体外表达的新型杀螨活性化合物筛选

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是保证神经信号在生物体内正常传递的关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的作用靶标.本研究在前期朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶基因原核表达及最适反应条件摸索的基础上,大规模表达纯化朱砂叶螨AChE,进一步研究其酶学性质.研究结果显示,在温度为25℃、其他条件最适的情况下,测定酶K_m值为0.67 mmol/L,K_(cat)/K_m值为13.53 mmol L~(-1) s~(-1).随后,从SPECS化学库筛选到了55个候选AChE抑制性化合物,获得了9个抑制活性优于或相当于毒扁豆碱的朱砂叶螨AChE抑制化合物,并且它们对朱砂叶螨有较好的毒性.本研究为乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选以及以乙酰胆碱酯酶为靶标的农药开发提供了理论依据和实验基础.     

白地霉(lip42)脂肪酶的纯化及酶学性质

白地霉(Geotrichum candidum)经过发酵培养,以发酵液为lip42脂肪酶粗酶液,经硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、DEAE纤维素柱层析及Sephadex-75凝胶柱层析纯化处理,脂肪酶比活力达到121.68U/mg,纯化倍数为粗酶液的7.3倍,回收率为30.25%,经SDS-PAGE电泳显示为单一条带,相对分子质量约64×103.脂肪酶的酶学性质研究结果表明:在40℃以下温度保存1h内酶活性相对稳定;在pH8.0和30℃反应条件下表现相对高的酶活性;在Mg2+存在情况下酶活性提高10%左右,而其它离子如Cu2+、Zn2+等以及0.1%的Tween80、Tween20及Triton-100对酶活性却有不同程度的抑制作用,1mmol/L的SDS和EDTA-Na对酶活性的影响很微小.     

微酸多年卧孔菌产漆酶条件优化及其在染料脱色中的应用

微酸多年卧孔菌(Perenniporia subacida)产漆酶能力对生物漂白等研究具有重要意义.通过单因子和正交试验确定了微酸多年卧孔菌(菌株号:Dai 8224)的最适产酶条件:麦芽糖20 g/L,酵母浸粉5 g/L,pH 5.4,Cu2+2.0 mmol/L,培养温度24℃,转速160 r/min,接种量1.5%(V/V),此时酶活最高可达1.945 U/mL.单独使用微酸多年卧孔菌漆酶粗酶液对染料具有很好的脱色效果.该菌株对于50 mg/L杂环类染料中性红的脱色率可达98.3%,对偶氮染料刚果红的脱色率次之,为91.57%,对亚甲基蓝和铬天青的脱色率也都在80%以上.此外,其催化中性红脱色的最佳底物浓度为60 mg/L,脱色率达到99.42%,其中,生物降解作用占55.92%,菌体吸附作用占43.5%.结果表明该菌对多种染料脱色具有较大的应用潜力.图4表3参31     

β-甘露聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达

从Bacillus subtilis JNA 3-10中克隆出β-甘露聚糖酶基因成熟肽链编码序列manA1和含信号肽的β-甘露聚糖酶基因manA2,在B.subtilis 168中克隆表达,分别筛选获得高效分泌表达β-甘露聚糖酶的重组菌株BPM1001(pMA5-manA1/B.subtilis 168)和BPM1002(pMA5-manA2/B.subtilis 168),结果表明菌株BPM1002总酶活力是菌株BPM1001的9.65倍,是原始菌株的13.1倍.在基因manA2下游引入His序列克隆出β-甘露聚糖酶基因manA3,获得枯草芽孢杆菌168重组菌株BPM1003.采用Ni-NTA柱纯化重组菌株BPM1003分泌表达的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质,该酶促反应的最适pH为6.5,最适温度为65℃,在37℃条件下保存一个月酶活力依然保留有77.8%.5 L发酵罐放大实验结果表明魔芋粉对于产β-甘露聚糖酶具有明显的诱导作用,酶活力最高可达2 748.82 U/mL.图9表3参19     

影响重寄生真菌盾壳霉几丁质酶的活性因子

盾壳霉是油菜菌核病菌(核盘菌)的一种重寄生菌,为了探索几丁质酶在盾壳霉寄生核盘菌过程中的作用,本文研究了影响盾壳霉几丁质酶活性的因子.结果表明,盾壳霉几丁质酶酶促反应的最适温度为50℃,最适pH 8.0.当温度不高于50℃、pH在5.0～9.0范围内酶活性较稳定.一些金属离子,包括Mg2+、Fe2+、Ca2+、Ba2+和Mn2+等,对盾壳霉几丁质酶活性有促进作用,而另外一些金属离子,包括Zn2+和Cu2+,却对盾壳霉几丁质酶活性发挥有抑制作用.一定浓度的草酸(1～4 mmol L-1)和硼酸(25～75 mmol L-1)可显著提高盾壳霉几丁质酶活性.本文还就上述结果的生物学意义和潜在利用价值进行了讨论.图6表1参19     

二年残孔菌的培养条件优化及其液体发酵产物的抗氧化及漆酶活性

二年残孔菌(Abortiporus biennis)是一种具有抗氧化、抗肿瘤功效的药用白腐真菌,可降解木质素、造成木材白色腐朽.以分离自江苏无锡的二年残孔菌WX-02菌株为材料,开展菌丝最适培养条件、液体发酵产物抗氧化活性及Cu2+诱导产漆酶活性研究.基于单因子试验的最适生长条件结果表明,葡萄糖是WX-02菌株菌丝体生长的最适碳源,牛肉膏和黄豆粉为最适氮源,C/N比为40/1时长势最佳,玉米粉和VC为最适生长因子,而菌丝生长最适pH和温度分别为7.0和32℃10%(V/V)接种量、28℃、150 r/min培养72 h条件下,PD培养基发酵液的总抗氧化活性为2.76±0.31mmol/L(FeSO4)和0.40±0.01 mmol/L(Trolox),DPPH自由基清除率为100.00%±0.00%,总SOD活力为15.75±0.25 U/mL;最适培养条件液体培养基发酵液的总抗氧化活性为0.20±0.03mmol/L(FeSO4)和0.16±0.01 mmol/L(Trolox),DPPH自由基清除率为59.06%±0.61%,总SOD活力为15.65±0.62 U/mL. 0.25 mmol/L Cu2+对胞外漆酶诱导效果最佳,PD培养基、0.25 mmol/L Cu2+、28℃、150 r/min培养96 h,胞外漆酶活性最高,为(1.82±0.02)×105 U/mL,是对照组的1.72倍.本研究表明WX-02菌株具有良好的抗氧化和产漆酶活性,具有药用和环境治理开发应用潜能.(图4表4参34)     

一株白腐菌产生的漆酶对RB亮蓝的脱色作用

W 1是一株能在液体条件下产漆酶的白腐菌 ,纯化的漆酶对RB亮蓝有很好的脱色作用 .漆酶的最适脱色温度为 4 5℃ ,最适脱色pH值为 6 .0 ,脱色pH范围在 4～ 7之间 .当溶液中漆酶活力为 2 .0× 10 3 U/L时 ,在最适脱色条件下、16h内 ,RB亮蓝 (30 0mg/L)的脱色率可以达到 90 % .经酶作用后 ,RB亮蓝在 4 30～ 70 0nm范围内的特征颜色吸收峰基本消失 .实验证明 ,在相同的条件下 ,漆酶粗酶对RB亮蓝有更好的脱色效果 .图 7表 1参 6     

经DNA改组的植酸酶纯化和酶学性质

经DNA改组的重组植酸酶通过有机膜超滤、DEAE -SepharoseF .F离子交换层析两步纯化 ,其纯度可达90 %左右 .SDS -PAGE分析表明 ,重组植酸酶的分子量Mr 约为 85 0 0 0 .酶学实验结果表明 :该酶反应最适pH为 4 .5 ,最适温度为 4 0℃ ,Km为 0 .11mmolL-1,Vmax为 96 4mmolL-1min-1,植酸酶活性不依赖任何金属离子的存在 .向酶液中分别添加MgSO4、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、蔗糖及葡萄糖 (10 0 g/L)后 ,植酸酶在 90℃处理 10min的活性比对照增加了 1～ 3倍 ,说明这些物质为酶保护剂 ;在 37℃下以植酸钠为底物的SDS对酶活性具有强烈的抑制作用 ;金属离子如Cu2 ,Zn2 ,K 以及EDTA对酶活性具有较弱抑制作用 ;金属离子如Mn2 ,Mg2 、Fe2 、Ba2 、Ca2 、Co2 低浓度时对酶活性有促进作用 ,当Mg2 浓度增加到 10mmolL-1时 ,则对酶活性起抑制效应 .图 4表 4参 19     

一种野生香蘑的分离、鉴定、培养条件与产酶特性

为充分开发利用野生食用菌资源,从采集自北京怀柔的野生香蘑子实体中分离获得纯培养,编号为Lepista sp.GSM-11,结合形态学特征与ITS序列分析鉴定其分类学地位,并进一步研究其菌丝生长的最适碳源、氮源、C/N比、生长因子、最适温度和最适pH值,并测定了菌体液体发酵产漆酶、蛋白酶、植酸酶、核糖核酸酶和凝集素的特性,同时还研究了Cu2+对漆酶产量的影响.结果表明,该菌株与GenBank中报道的采集自中国辽宁、美国马里兰州和日本宫城的紫丁香蘑(Lepista nuda)同源性最高,分别为100%、99.98%和99.93%,确定该野生香蘑为紫丁香蘑(ITS序列GenBank登录号JQ519375);菌丝体生长的最适碳源为蔗糖,最适氮源为酵母浸膏,最适C/N比为20/1,最适生长因子为维生素C,最适温度为24℃,最适pH为7.0;GSM-11菌株菌丝体和发酵液中均具有漆酶活性,但缺乏其他3种酶和凝集素活性.1.0～2.0 mmol/L的Cu2+对漆酶分泌有显著的促进作用,其活性达到对照组的149.2%～196.4%.     

重组大肠杆菌产CotA漆酶的发酵条件优化

CotA漆酶在环境保护、食品工业和纸浆漂白等工业中具有重要的应用价值.将重组表达载体pET-22b/CotA转入大肠杆菌BL21(DE3),得到工程菌株,采用单因素实验和正交实验相结合的方法,研究诱导表达条件和发酵培养基对重组大肠杆菌产CotA漆酶量的影响.结果表明,初始pH 7.5的培养基中,添加0.6 mmol L-1 Cu2+,1 g L-1葡萄糖作碳源、15 g L-1蛋白胨和2 g L-1硫酸铵作氮源,以10%的接种量,37℃、200 r/min,直到菌液的D600 nm值为1.0,加入终浓度为1.0 mmol L-1的IPTG,25℃诱导12 h,漆酶的产量最高.优化前发酵液的粗提液的漆酶活性仅为1 190 U mL-1,优化后达到3 526 U mL-1,正交实验优化后漆酶活性提高了2.96倍.纯化的CotA漆酶最适反应温度为45℃,最适pH值为7.2.CotA漆酶对RBBR的脱色率在90%以上,此CotA漆酶在短时间内对染料能够有效地脱色,能够成为有潜力的工业用酶.图6表3参17     

大肠杆菌植酸酶在毕赤酵母中的表达与纯化

为探讨植酸酶的结构与功能,研究了来源于大肠杆菌的植酸酶基因在酵母中的表达和纯化条件.将含有大肠杆菌植酸酶基因的毕赤酵母工程菌在不同甲醇浓度和不同诱导时间下培养,检测植酸酶的表达情况.结果表明:诱导培养基中一次性添加2.5%的甲醇,诱导96 h后,蛋白浓度达到1.36 mg mL-1,酶活力达到6 530 U mL-1;将在毕赤酵母中表达的植酸酶粗酶液经过硫酸铵盐析、Resource S柱和Superdex-75三步纯化,得到单峰纯的蛋白,比活力为137 280 Umg-1.用圆二色谱分析纯化后的蛋白在pH 5.0和8.0环境中的结构变化,结果显示pH 8.0环境使大肠杆菌植酸酶发生了变性.图3参16     

海洋微生物Fulvimarina manganoxydans磷酸酶FM2382的克隆表达及酶学性质

为促进海洋微生物及基因资源的开发应用,将海洋微生物Fulvimarina manganoxydans sp.nov.8047的磷酸酶基因fm2382在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达、纯化,并研究磷酸酶FM2382的酶学性质.设计引物从F.manganoxydans sp.nov.8047基因组DNA中扩增出磷酸酶fm2382基因,克隆至pET28(a)表达载体中,构建重组菌株,表达纯化后对磷酸酶FM2382的酶学性质进行分析.结果表明:磷酸酶FM2382最适反应温度为45℃,最适反应pH 7.1,70-80℃高温处理1 h后仍具35%左右的活力,在pH 7.1-9.0范围内具有较好的稳定性;金属离子对磷酸酶活力有不同程度的影响,其中Mg~(2+)、Mn~(2+)具有强烈的激活作用;K_m=1.42×10~(-3)mol/L,V_m=2.5×10~(-7)mol/L.本研究表明F.manganoxydans sp.nov.中获得的fm2382基因可以在大肠杆菌中高效表达且FM2382是一种新的磷酸酶.     

大肠杆菌乙酰酯酶(AES)的酶学性质

以乙酸香叶酯为底物,对大肠杆菌乙酰酯酶(Acetyl esterase,AES)的酶学性质进行解析,实现将乙酸香叶酯生物转化为香叶醇.结果显示:大肠杆菌AES酶的最佳反应p H范围为6.0-7.5;最适反应温度为30℃;最佳催化时间为2 h;Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)对酶活没有太大影响,而Cu~(2+)、Zn~(2+)明显抑制酶的活性.对AES的动力学研究可知,其米氏常数Km、最大反应常数Vm分别为2.88 mmol/L、1.87 mmol/L.该酶同样可水解乙酸松油酯、乙酸薄荷酯、乙酸香茅酯,分别产生松油醇、薄荷醇和香茅醇.本研究得出了大肠杆菌乙酰酯酶的最适反应条件,可为后期香叶醇的生物合成优化和产量提高以及其他萜醇类化合物的生物合成提供参考依据.     

灵芝TR6号漆酶的分离纯化及性质研究

采用硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和Sephadex G100凝胶柱层析对灵芝TR6号漆酶发酵液进行分离纯化,得到电泳纯漆酶.SDS-PAGE电泳结果显示,该漆酶表观分子量为62×103.Native-PAGE鉴定该漆酶由一种同工酶组成,为单体酶.试验结果表明,该漆酶的最适反应温度为60℃,与ABTS的最适反应pH为4.5,Km为0.188 mmol/L,在pH 6.0～8.0之间较稳定.Fe2 、SDS和Tris对该漆酶活性具有抑制作用,EDTA和Tween80则对该漆酶活性具有促进作用.图8表2参10     

产大分子levan的果糖基蔗糖转移酶的原核表达及酶学性质

Levan型果聚糖是由微生物通过果糖组成的一个均聚物,寻找可以产均一度高的大分子果聚糖的果糖基蔗糖转移酶对其工业应用具有十分重要的意义.本研究克隆了来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis,SCTCC102250)的果糖基蔗糖转移酶基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功实现表达.通过His-tag柱层析对表达的果糖基蔗糖转移酶进行纯化,将纯化的酶与底物蔗糖反应,经乙醇沉淀得到多糖样品,利用凝胶色谱法确定了其分子量(Mr)的大小为2×106.多糖酸水解后的样品Rt与果糖标准品的Rt保持一致,表明该聚合物为levan果聚糖.最后,通过研究果糖基蔗糖转移酶的酶学性质,确定其最适温度为40℃,最适pH为6.0,Km值为3.95 mmol/L,Vmax为1 31.58μmol m L-1 min-1.本研究通过酶法合成得到levan果聚糖,为今后制备大分子levan果聚糖提供了理论依据.