一株嗜酸性产纤维素酶真菌的特性及产酶条件优化

从四川海螺沟原始森林腐土中分离到一株嗜酸性产纤维素酶的真菌X-13,其主要特点是产纤维素酶的最适pH及其纤维素酶最适反应pH均为2.0.在PDA培养基上培养时菌落呈浅黄色至肉桂色,反面呈黄色至棕褐色,产黄色色素;菌丝体透明有隔膜,分生孢子呈球形或近球形.根据菌株的形态特征以及ITS序列同源性和系统发育分析结果,鉴定该菌株为土曲霉(Aspergillus terreus Thom).该菌最佳产酶培养时间为8～10 d;最适产酶温度为30℃,纤维素酶最适反应温度为50℃;最佳碳源、氮源分别为纤维素粉和硫酸铵.通过响应面法对菌株产纤维素酶条件进行优化,使菌株X-13纤维素酶活从1.39 IU/mL提高到2.94 IU/mL,提高了111.5%.     

黑胸散白蚁纤维素酶的体外酶学特性

采用DNS法研究了我国广泛分布的一种低等木食性白蚁——黑胸散白蚁纤维素酶的体外酶活特性以了解其纤维素降解机制.结果表明,内切β-1,4-葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)这3种酶的最佳反应时间均为15 min,最佳底物浓度为1%,最适反应pH为5.6,最适反应温度为35℃.在最适反应条件下,EG、CBH和BG的活性分别达到71.3(±13.9)U/mg、5.8(±0.8)U/mg和4.1(±0.7)U/mg.EG在体外的热稳定性较差,在50℃及更高温度酶活很低或完全失活,但该酶对pH稳定性较好,在pH 3.2～8.0范围内酶活力变化不大.Native-PAGE电泳检测到该白蚁体内至少有8种不同的EG活性条带,肠道不同部位纤维素酶活性条带种类不同.这些研究表明,木食性白蚁降解纤维素是一个复杂的过程,需要多种纤维素酶的共同作用.     

耐碱性木聚糖酶产生菌的筛选及发酵条件研究

利用刚果红透明圈法,从造纸厂碱性土壤中筛选到一株木聚糖酶生产菌株X24-14,经培养特性研究及16S rDNA序列分析,初步认为该菌属于纤维菌属(Cellulosimicrobium).经发酵条件优化,该菌在麸皮60 g/L,蛋白胨10 g/L,K2HPO4 7.0 g/L, pH 8.5,接种量为5%, 37 ℃, 200 r/min的条件下发酵培养108 h,可达到最大活力,为2 204 u/mL. 该酶最适反应温度为60 ℃;具有较宽的pH作用范围,在pH 4.2～9.4范围内能保持较高的酶活力,在pH 9.4条件下,仍具有80%的酶活力; pH稳定性较好,在4 ℃、pH 11.0的条件下处理24 h仍能保持75%的酶活力.图3表1参12     

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)几丁质酶的分离纯化及酶学性质

以苏云金芽胞杆菌为材料 ,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE - 32离子交换柱层析初步纯化 ,获得比活力为15 0 .5Umg-1的酶制剂 .研究酶催化胶体几丁质水解的反应时间和酶量对酶活力的关系 ,探讨酶催化胶体几丁质的最适条件 .温度和 pH对酶活力的影响和酶的热稳定性及酸碱稳定性的结果表明 :酶催化胶体几丁质水解的的最适pH为 5 .6、最适温度为 5 8℃ .该酶在pH 4 .5～ 6 .5区域稳定 ,而在pH >8能很快失活 ;在 5 5℃以下处理 30min ,酶活力保持不变 ;高于 5 5℃ ,酶快速失活 .图 5参 11     

嗜碱菌A4-10碱性纤维素酶产生条件及性质的初步研究

从４８ 份土壤和天然碱湖样品分离出能产生胞外碱性纤维素酶的嗜碱细菌１３５ 株,其中７ 株菌产酶活力大于３ Ｕ／ｍＬ,菌株Ａ４１０ 经条件试验后酶活力达２１ Ｕ／ｍＬ,该菌产生碱性纤维素酶最适培养温度为３４ ℃,最适碳源为ＣＭＣＮａ,最适氮源为复合蛋白胨和酵母粉,该酶的最适反应温度５５ ℃,最适反应ｐＨ９．０ ．     

嗜碱菌A4—10碱性纤维素酶产生及性质的初步研究

从４８份土壤和天然碱湖榈分离出能产生胞外碱性纤维素酶的嗜碱细菌１３５株,其中７株菌产酶活力大于３Ｕ／ｍＬ,菌株Ａ４－１０经条件试验后酶活力达２１Ｕ／ｍＬ,该菌产生碱性纤维素酶最适培养温度为３４℃,最适碳源为ＣＭＣ－Ｎａ,最适氮源为复合蛋白胨和酵母粉,该酶的最适反应温度５５℃,最适反应ｐＨ９．０。     

纤维素酶产生菌HS-F9的筛选鉴定和产酶条件优化

为了选育高产纤维素酶菌株,通过刚果红鉴别培养基以及滤纸条崩解实验测定,从牛粪堆肥中筛选到一株产纤维素酶的真菌HS-F9,根据菌株形态特性和18SrRNA基因序列分析,初步鉴定该菌为绿色木霉(Trichoderma viride).利用液体发酵培养产生纤维素酶,研究了碳源、氮源、培养时间、培养温度、培养基起始pH、接种量对菌株HS-F9产酶的影响.结果表明:产EG、CBH和FPA的最适碳源均为CMC-Na;EG和CBH在以蛋白胨为唯一氮源时酶活最高,FPase则在以黄豆粉为唯一氮源时酶活最高;产生EG、CBH和FPA的最适温度分别为30℃、30℃、33℃;最适起始pH为3.0、3.0和4.0;EG和FPase的最适接种量为2%,CBH最适接种量达到了8%;培养时间均以5～6d为宜.在最适条件下培养,该菌株EG、CBH和FPase的酶活分别达到了5275.3U/mL、8502.1U/mL和3619.1U/mL,是未优化前的1.42、1.35和1.32倍.图6表2参23     

一株能分解纤维素的高温耐碱放线菌

对一株分离于堆肥的分解纤维素的放线菌的形态学和生理生化特征进行了研究．结果表明：基丝由分枝发达的不断裂的菌丝组成，气丝发达；孢子单个长在气丝上，孢子表面光滑，细胞壁含meso-DAP；该菌能分解纤维素，液化明胶、水解酪素和淀粉，在35-60℃生长，pH范围为6．0—12．0．按《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》进行了鉴定，初步将此菌归为高温单孢菌属(Thermomonospora sp.)的一个新种．研究了产羧甲基纤维素酶(CMCase)和滤纸酶(FPA)的条件．CMCase最适产酶时间为5d，FPA为8d，最适产酶温度为50℃，产酶最适起始pH为9．5—10．5．最适氮源为黄豆粉，最佳碳源为棉花纤维．图6表2参10     

秸秆污泥堆肥产纤维素酶细菌的筛选及产酶条件优化

从添加秸秆进行堆肥处理的污泥中采集样品,通过富集培养和刚果红平板染色法筛选分离出具有纤维素降解能力的细菌,再通过酶活力测定从中分离筛选出1株相对高活性的产纤维素酶细菌CI;通过基于16S rRNA基因序列的系统发育分析,初步确定该菌株为Devosia sp..利用单因素试验对目的菌株C1进行产纤维素酶发酵条件优化,结果表明菌株C1产纤维素酶的最佳发酵时间、培养温度、摇床转速以及最适初始pH值分别为60 h、30℃、130 r·min^-1和7.2～7.5,且在该条件下其滤纸酶（FPase）和羧甲基纤维素酶（CMCase）活力分别达23.10和54.97 U·mL^-1.     

产冷适应复合酶菌株Pseudomonas sp.NJ197的选育、发酵条件及酶学性质

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株同时产多种冷适应酶的菌株NJ197,细菌学形态鉴定及16S rDNA序列分析表明,该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas).生长特性研究表明,该菌株属于耐冷菌,其最适生长温度为5~15℃.NJ197菌株能利用多种单一的碳、氮源产酶,最适产酶温度为20℃,最高产酶温度为30℃.粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE cellulose-52柱层析初步分离纯化后进行酶学性质的研究.该菌株所分泌复合酶中脂肪酶和淀粉酶的活力最高,它们的最适作用温度分别为30℃和35℃,最适pH值分别为9.0和9.5,对热敏感,是典型的碱性冷适应复合酶.Ca2 、Mn2 、Cu2 、Co2 、Fe3 对该复合酶有较为明显的激活作用,而Zn2 、Hg2 、Rb2 、Cd2 、EDTA则能抑制酶活.其中脂肪酶能在高浓度的SDS、CHAPS等变性剂中表现出较好的稳定性.图5表2参21     

产碱杆菌DN25中降氰酶的分离纯化及生化特性

以一株可降氰的产碱杆菌DN25为酶来源,通过超滤、30 mg/mL硫酸鱼精蛋白沉淀、30%～70%硫酸铵盐析和Phenyl-Toyopearl 650M疏水层析等步骤,获得比活力为44 U/mg的纯化酶制剂.在确定酶浓度、反应时间等氰降解活力测定条件后开展酶学性质研究,试图为将来氰降解代谢机理的深入研究和菌株的基因工程改造提供理论基础.研究结果表明,此纯化酶催化氰化物水解的最适pH值为8.0,最适温度为30℃.该酶在pH 7.0～8.0区域稳定,而在pH>9时会很快失活;在30℃保存10 h,酶活力保持稳定,高于60℃,酶快速失活.加入甘氨酸稳定剂,在60℃下保存20 min酶活仍可保留19.6%.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为3.11 mmol/L,最大反应速率Vmax为0.23 mmolL-1min-1.     

Studies on influence of natural biowastes on cellulase production by Aspergillus niger

The objective of this study was to determine the influence of natural biowaste substrates such as banana peel powder and coir powder at varying environmental parameters of pH (4-9) and temperature (20-50 degrees C) on the cellulase enzyme production by Aspergillus niger. The cellulase enzyme production was analyzed by measuring the amount of glucose liberated in IU ml(-1) by using the dinitrosalicylic acid assay method. The substrates were pretreated with 1% NaOH (alkaline treatment) and autoclaved. The maximum activity of the enzyme was assayed at varying pH with temperatures being constant and varying temperatures with pH being constant. The highest activity of the enzyme at varying pH was recorded at pH 6 for banana peel powder (0.068 +/- 0.002 IU ml) and coir powder (0.049 +/- 0.002 IU ml(-1)) and the maximum activity of the enzyme at varying temperature was recorded at 35 degrees C for both banana peel powder (0.072 +/- 0.001 IU ml(-1)) and coir powder (0.046 +/- 0.003 IU ml(-1)). At varying temperatures and pH the high level of enzyme production was obtained at 35 degrees C and pH 6 by using both the substrates, respectively. However among the two substrates used for the production of cellulases by Aspergillus niger banana peel powder showed maximum enzymatic activity than coir powder as substrate.     

生物硫铁生成菌的选育及其在重金属废水处理中的应用

为开发高效经济、环境友好的重金属废水处理技术,采用亨盖特(Hungate)厌氧技术分离出一株产生物硫铁复合材料的硫酸盐还原菌(Sulfate reducing bacteria,SRB),命名为SRB2,并对该菌株进行了生理特性、培养工艺和废水处理研究.菌体杆状稍有弯曲,革兰氏阴性菌,最佳碳源为乳酸钠.pH范围5.0～9.0,最适pH 7.0,最适温度为35℃,培养3 d生物硫铁量和硫化物含量能达最大值,分别为2.85 g L-1、358.048 mg L-1.正交试验结果表明,乳酸钠9.0 g L-1+组合氮源1.5 g L-1+硫酸亚铁10.0 g L-1时生物硫铁产量最高.16S rDNA序列分析表明,菌株与脱硫弧菌属Desulfovibriodesulfuricans strain 734同源性为99%.采用生物硫铁处理重金属Cu2+、Pb2+、Cd2+废水,结果表明生物硫铁能快速处理含Cu2+、Pb2+、Cd2+废水,2 min去除率达99.8%以上.因此,生物硫铁在各类重金属废水处理与重金属废水污染事故应急处理中具有较好的应用前景.     

一种嗜热细菌来源角质酶的分离纯化及酶学性质

通过跟踪发酵液中pNPB水解酶活性,对角质诱导的Thermobifida fusca 口发酵液进行分离纯化.采用活性炭脱色、硫铵沉淀、Phenyl HP疏水色谱、DEAE sephamse阴离子交换色谱等方法,分离纯化得到电泳纯PNPB水解酶.该酶水解角质可得到角质单体,是一种角质酶.SDS-PAGE电泳结果显示,角质酶表观分子量约为29×10~3.该酶的最适温度为60℃.在40℃和60℃下均具有良好的热稳定性.最适pH为8.0,pH稳定范围为6.0～9.0.该角质酶的生化性质适合在纺织工业中应用.图8表2参17     

添加剂对绿色木霉JQF-04纤维素酶热稳定性的影响

如何提高酶蛋白的热稳定性是分子生物学、微生物学、生化工程学等学科长期所关注的重要研究课题之一.本文研究了多种添加剂对绿色木霉纤维素酶热稳定性的影响.在60℃的溶液中,多元醇(乙二醇、甘油、赤藓糖醇、木糖醇和山梨糖醇)能提高该酶的热稳定性,随着浓度的增加,赤藓糖醇、木糖醇和山梨糖醇促进酶的热稳定性呈线性增高;适当的多元醇分子长度对该酶的热稳定性有最优的保护效应;不同浓度和不同分子量的聚乙二醇对该酶的热稳定性具有明显的影响;在无机盐中,单价金属阳离子比二价金属阳离子更能显著地提高该酶的热稳定性;酶液溶剂的改变直接影响着该酶的热稳定性,该酶在D2O溶液中比在水溶液中稳定,其酶活半衰期延长了2.6倍.研究表明,热环境使酶蛋白分子的螺旋结构发生变化而失活,但某些溶质和溶剂的存在可能通过作用于蛋白质分子的三维结构而影响该酶的热稳定性.图7参15     

降解菌djl-6多菌灵水解酶的提取及性质

以往对多菌灵降解菌Rhodococcus qingshengii sp.nov.djl-6的降解途径研究显示,该菌株首先通过多菌灵水解酶将多菌灵水解成二氨基苯并咪唑,从而对多菌灵进行脱毒.为开发酶制剂并有效应用于环境中残留污染物多菌灵的降解,比较了不同提取方法(高压细胞破碎、超声波破碎和添加溶菌酶破碎)对多菌灵水解酶提取效率的影响,并对其酶学特性进行了初步研究.结果表明,djl-6菌株在LB培养基中培养72~84 h,生长量和产酶量均达到最大值.采用超声波破碎提取酶的效率较高(蛋白浓度为7.92 mg/mL),但酶活损失较大(比酶活只有1.2 U/μg protein).多菌灵水解酶属于一种胞内组成型酶.该酶水解多菌灵的最适pH值为7.0,最适温度为30℃,Zn2+和K+对酶活有一定的抑制作用.     

Advances in the study of directed evolution for cellulases

If cellulose can be effectively hydrolyzed into glucose by cellulase, the production costs of hydrogen, ethanol or other chemicals from cellulosic materials will be greatly decreased, and economically viable production of biohydrogen and bioethanol will become feasible. Cellulose is degraded into glucoses by multi-component enzyme systems. Nowadays cellulases are widely used in brewing, food, bioenergy, fodder, textiles, paper, pharmaceuticals, environmental protection and other industries. However, existing cellulases have several problems that limit their wider applications, including the low turnover number for solid cellulosic materials, and low stability in adapting to various application conditions. For example, high temperature, low pH, and so on. Application of directed evolution technology may be one of the most effective ways for improving the characteristics of cellulases. This paper presents a brief review of the cellulose hydrolysis mechanism by cellulase, advances in cellulases (endoglucanase and β-glucosidase) improvement by directed evolution for several characteristics (for instance, thermal stability, pH adaptability and enzyme activity), limitations of directed evolution for cellulases, and the outlook for directed evolution for cellulase.     

新疆罗布泊外围地区极端环境嗜碱放线菌生物学特性及活性物质筛选

2006～2007年从新疆罗布泊外嗣地区的泥土样品中分离了117株放线菌,初步筛选后对其中47株嗜碱放线菌进行了形态学鉴定,不同生长条件(pH值,盐NaCl、KCl、MgCl_2,碱性物质Na_2 CO_3、K_2CO_3、Mg_2CO_3、NaOH、KOH,温度)对菌株生长的影响,拮抗性、产酶活性检测及菌株LA4的分子进化鉴定等研究.结果发现,47株放线菌的15%属于诺卡氏菌属,70%属于链霉菌属,10%属于游动放线菌属,其中嗜碱链霉菌属占优势.在pH 7～11范围内,47株嗜碱放线菌均能生长.生长率为92%～95%.NaCl、KCl、MgCl,对嗜碱放线菌均具有抑制作用,NaCl、KCl的抑制作用高于MgCl_2,NaCl、KCl浓度超过10%时而MgCl_2 浓度超过15%时嗜碱放线菌完全停止生长.47株嗜碱放线菌对Na_2CO_3、K_2CO_3、MgCO_3、KOH、NaOH等碱性物质没有选择性,生长良好.47株嗜碱放线菌的最适生长温度为28～30℃.超过55℃后均不能生长.从47株嗜碱放线菌中筛选出了30株具有抗菌活性的菌株,其中对大肠杆菌有抑制作用的有11株,占36.7%,对金黄色葡萄球菌有抑制作用的有20株,占66.7%,对枯草杆菌有抑制作用的有16株,占53.3%;其中4株嗜碱放线菌LA4、LA24、LA33和LA19对3种指示菌均表现出抑制作用.在47株嗜碱放线菌中,74%具有淀粉酶活性,81%具有纤维素酶活性,43%具有蛋白酶活性,49%具有脂肪酶活性.通过分子鉴定,发现LA4为链霉菌中尚未报道的一个新亚种,其16S序列GenBank登录号为FJ182229.本研究结果表明新疆罗布泊外围地区存在大量的产纤维素酶、淀粉酶的嗜碱放线菌,并且潜藏着新的放线菌资源,为该地区嗜碱放线菌的种质资源开发和新药筛选有效菌源提供了参考.图5表4参20     

β-甘露聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达

从Bacillus subtilis JNA 3-10中克隆出β-甘露聚糖酶基因成熟肽链编码序列manA1和含信号肽的β-甘露聚糖酶基因manA2,在B.subtilis 168中克隆表达,分别筛选获得高效分泌表达β-甘露聚糖酶的重组菌株BPM1001(pMA5-manA1/B.subtilis 168)和BPM1002(pMA5-manA2/B.subtilis 168),结果表明菌株BPM1002总酶活力是菌株BPM1001的9.65倍,是原始菌株的13.1倍.在基因manA2下游引入His序列克隆出β-甘露聚糖酶基因manA3,获得枯草芽孢杆菌168重组菌株BPM1003.采用Ni-NTA柱纯化重组菌株BPM1003分泌表达的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质,该酶促反应的最适pH为6.5,最适温度为65℃,在37℃条件下保存一个月酶活力依然保留有77.8%.5 L发酵罐放大实验结果表明魔芋粉对于产β-甘露聚糖酶具有明显的诱导作用,酶活力最高可达2 748.82 U/mL.图9表3参19