灵芝TR6号漆酶的分离纯化及性质研究

采用硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和Sephadex G100凝胶柱层析对灵芝TR6号漆酶发酵液进行分离纯化,得到电泳纯漆酶.SDS-PAGE电泳结果显示,该漆酶表观分子量为62×103.Native-PAGE鉴定该漆酶由一种同工酶组成,为单体酶.试验结果表明,该漆酶的最适反应温度为60℃,与ABTS的最适反应pH为4.5,Km为0.188 mmol/L,在pH 6.0～8.0之间较稳定.Fe2 、SDS和Tris对该漆酶活性具有抑制作用,EDTA和Tween80则对该漆酶活性具有促进作用.图8表2参10     

一种新的中温酸性α-淀粉酶的分离纯化及酶学性质

从Bacillus sp.中分离纯化了一种新的中温酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究.粗酶经硫酸铵沉淀、 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、 Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤后获得电泳均一的α-淀粉酶,其分子量(Mr)约为56×103.该酶最适反应pH为5.0,在pH 5.0～11.0范围内稳定,具有较好的耐酸特性.该酶最适反应温度为40～50 ℃,在40～60 ℃范围内稳定.在60 ℃、 pH 4.5时,该酶能快速有效水解可溶性淀粉;在pH 5.0时该酶对多种生淀粉底物也具有良好的水解作用.因此,该酶有助于解决中温条件淀粉加工行业中,液化酶和糖化酶由于适用pH值的差异而无法联用的难题,是一种具有研究价值和应用前景的中温酸性α-淀粉酶.经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中两个肽段的氨基酸序列,通过比对发现,该酶与NCBI中已报道的α-淀粉酶序列具有一定的同源性,同时,在氨基酸水平上也存在着差异.     

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)几丁质酶的分离纯化及酶学性质

以苏云金芽胞杆菌为材料 ,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE - 32离子交换柱层析初步纯化 ,获得比活力为15 0 .5Umg-1的酶制剂 .研究酶催化胶体几丁质水解的反应时间和酶量对酶活力的关系 ,探讨酶催化胶体几丁质的最适条件 .温度和 pH对酶活力的影响和酶的热稳定性及酸碱稳定性的结果表明 :酶催化胶体几丁质水解的的最适pH为 5 .6、最适温度为 5 8℃ .该酶在pH 4 .5～ 6 .5区域稳定 ,而在pH >8能很快失活 ;在 5 5℃以下处理 30min ,酶活力保持不变 ;高于 5 5℃ ,酶快速失活 .图 5参 11     

Rhizopus microsporus var. chinensis生淀粉糖化酶的分离纯化及酶学性质

从Rhizopus microsporus var.chinensis CICIM F0088菌株中分离纯化一种新的具有生淀粉降解能力的糖化酶,并研究其酶学性质.经硫酸铵沉淀、双水相交换、DEAE-650M阴离子层析、Bio-Rad制备电泳等步骤后获得电泳均一的糖化酶,其相对分子质量约为52×103.该酶最适反应pH为4.5,在pH3.5～6.5范围内稳定;最适反应温度为75℃,具有较宽的pH耐受范围和较高的温度耐受性.经飞行质谱分析得到酶蛋白中3个肽段的氨基酸序列,通过比对发现,该酶与NCBI中已报道的糖化酶序列具有一定的同源性.     

产碱杆菌DN25中降氰酶的分离纯化及生化特性

以一株可降氰的产碱杆菌DN25为酶来源,通过超滤、30 mg/mL硫酸鱼精蛋白沉淀、30%～70%硫酸铵盐析和Phenyl-Toyopearl 650M疏水层析等步骤,获得比活力为44 U/mg的纯化酶制剂.在确定酶浓度、反应时间等氰降解活力测定条件后开展酶学性质研究,试图为将来氰降解代谢机理的深入研究和菌株的基因工程改造提供理论基础.研究结果表明,此纯化酶催化氰化物水解的最适pH值为8.0,最适温度为30℃.该酶在pH 7.0～8.0区域稳定,而在pH>9时会很快失活;在30℃保存10 h,酶活力保持稳定,高于60℃,酶快速失活.加入甘氨酸稳定剂,在60℃下保存20 min酶活仍可保留19.6%.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为3.11 mmol/L,最大反应速率Vmax为0.23 mmolL-1min-1.     

大肠杆菌植酸酶的原核表达及酶学性质

将大肠杆菌植酸酶appA摹因重组于表达载体pET32a中,导人大肠杆菌Origami(DE3)构建工程菌Origami(DE3)-pET32aappA.对表达的appA重组植酸酶经Ni柱亲和纯化、SDS-PAGE分析表明,纯化后条带单一,酶的纯度较高.对其酶学性质的研究表明,该酶反应的比活力为3.36×106 U/mg;最适pH为4.5;最适温度为60℃ ;在80℃和85℃的耐干热能力超过耐湿热能力;在37℃下,Mg2+、Ca2+、Mn2+对酶活性有促进作用,CO2+、Cu2+、K+对酶活性有不同程度的抑制作用,而Fe3+和Zn2+对酶活性有强烈的抑制作用;此外,该酶还具有非常好的抗胃蛋白酶水解的能力和部分抗胰蛋白酶水解的能力.图8表1参21     

黑曲霉Aspergillus niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25柱脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法,从黑曲霉菌株Aspergillus niger SL2-111的发酵曲中提取了一种酸性蛋白酶,经SDS-PAGE验证,该酶纯化水平已达到电泳纯.该酶的表观分子量(Mr)约为47×103,最适pH值为3.0,pH稳定性范围为2.5～6.0,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30～60℃;Gu2+、Mn2+对其有激活作用,Hg2+、Ag+对其则有轻度的抑制作用;该酶的氨基酸组成为中极性酸性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.50%,极性中性氨基酸占38.50%,其它为非极性氨基酸;N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,经序列同源性比对,表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性.图4表5参15     

黑曲霉Aspergillsu niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25柱脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法,从黑曲霉菌株Aspergillus niger SL2-111的发酵曲中提取了一种酸性蛋白酶,经SDS-PAGE验证,该酶纯化水平已达到电泳纯.该酶的表观分子量(Mr)约为47×103,最适pH值为3.0,pH稳定性范围为2.5～6.0,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30～60℃;Gu2+、Mn2+对其有激活作用,Hg2+、Ag+对其则有轻度的抑制作用;该酶的氨基酸组成为:中极性酸性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.50%,极性中性氨基酸占38.50%,其它为非极性氨基酸;N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,经序列同源性比对,表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有极高的同源性.图4表5参15     

一株产酸性α-淀粉酶菌株的筛选、纯化及酶学性质

从南宁酒厂附近土壤中筛选到一株产淀粉酶的野生菌株GXBA-4,经革兰氏染色、芽孢染色以及16SrDNA鉴定,初步确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacien).将该菌株发酵液经过硫酸铵沉淀和凝胶过滤纯化出一种α-淀粉酶,该酶相对分子质量约为57×103;反应最适温度为40~45℃,适应温度范围广,30℃时仍具有80%以上的相对活力;最适pH为5.0,为低温酸性淀粉酶.该酶水解可溶性淀粉的产物,经HPLC检测主要是以葡萄糖,麦芽糖以及麦芽三糖为主的低聚糖,分别以α-环糊精、β-环糊精、可溶性淀粉、玉米生淀粉为底物,还原糖产物比为0:0:99:3.4,表明该酶为典型的α-淀粉酶.     

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶初步纯化及部分性质

以日本沼虾内脏为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32离子交换柱层析和SephadexG-100分子筛柱层析纯化,获得比活力为3000Umg-1、纯化倍数为8.88倍的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂(NAGase).以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学,结果表明,酶的最适pH为6.0,最适温度为53℃.该酶在pH4.5~9.3区域较稳定,当pH>9.3很快失活;在50℃以下处理30min,酶活力保持稳定,高于50℃,酶稳定性较差,75℃酶完全失活.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.165mmolL-1,最大反应速度Vm为6.55μmolL-1min-1.酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为63.55kJmol-1.图5表1参16     

温度两阶段控制策略发酵生产重组角质酶

为进一步提高重组Bacillus subtilis WSHB06-07发酵生产角质酶的产量和生产强度,在pH两阶段控制策略的基础上,考察了温度(27～40℃)对菌体生长和产酶的影响.研究发现,37℃适于菌体生长而30℃适于菌体产酶.通过分析发酵过程中菌体比生长速率及产物比合成速率的变化,确定了温度两阶段控制策略,即0～4 h时控制温度37℃,4 h后将温度调至30℃.通过采用这一优化策略,角质酶酶活和生产强度分别可达312.5 U/mL和13.02 kU L-1 h-1,相比恒定温度37℃控制模式下分别提高了83.4%和10.9%.图6表2参13     

一株产耐热纤维素酶菌株的筛选及酶学性质

采用纤维素刚果红平板法从大田蘑菇种植场建堆的稻草样中分离得到了1株能产具有较好温度耐受性和pH稳定性的纤维素酶的放线菌DY3.综合形态、生理生化特征以及16S rDNA序列分析,将其初步鉴定为嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca).对该菌所产纤维素酶的性质研究表明:最适催化温度为65℃,在70℃保温60 min后仍有75%以上的活力;最适催化pH为7.5,在pH 5.5～10.0之间该酶的稳定性较好,pH 10.0的条件下仍有80%的活力;最适作用底物是羧甲基纤维素钠.研究可为木质纤维素的生物预处理提供一定参考价值.     

猪精液酸性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的纯化及性质水

以杜洛克猪精液为材料,采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-32阴离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛柱层析纯化,获得纯化倍数为27.64、比活力为1 773.25 U mg~(-1)的酸性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶纯酶制剂.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定,纯酶两种亚基相对分子质量分别为129.13×10~3和62.24×10~3.对其酶学性质的研究结果表明,酶的等电点为5.10,最适pH值为5.5,最适温度为60℃.酶在pH 3.6~9.2、温度10℃～55 ℃的范围内较稳定.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨罐葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,测得米氏常数K_m为0.455 mmol L~(-1),最大反应速度V_m为17.34μmol L~(-1)min~(-1),活化能为41.70 kJ mol~(-1).图8表1参15     

降解菌djl-6多菌灵水解酶的提取及性质

以往对多菌灵降解菌Rhodococcus qingshengii sp.nov.djl-6的降解途径研究显示,该菌株首先通过多菌灵水解酶将多菌灵水解成二氨基苯并咪唑,从而对多菌灵进行脱毒.为开发酶制剂并有效应用于环境中残留污染物多菌灵的降解,比较了不同提取方法(高压细胞破碎、超声波破碎和添加溶菌酶破碎)对多菌灵水解酶提取效率的影响,并对其酶学特性进行了初步研究.结果表明,djl-6菌株在LB培养基中培养72~84 h,生长量和产酶量均达到最大值.采用超声波破碎提取酶的效率较高(蛋白浓度为7.92 mg/mL),但酶活损失较大(比酶活只有1.2 U/μg protein).多菌灵水解酶属于一种胞内组成型酶.该酶水解多菌灵的最适pH值为7.0,最适温度为30℃,Zn2+和K+对酶活有一定的抑制作用.     

邻苯二甲酸二丁酯的酶促降解性的研究

测定了Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦＳ１的邻苯二甲酸酯降解酶对邻苯二甲酸二丁酯的降解特性；提出了邻苯二甲酸二丁酯酶促降解的途径，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦＳ１细胞中的颗粒部分、溶液部分对邻苯二甲酸二丁酯都具有降解作用，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦＳ１的邻苯二甲酸酯降解酶尾胞内酶；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＦＳ１     

β-甘露聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达

从Bacillus subtilis JNA 3-10中克隆出β-甘露聚糖酶基因成熟肽链编码序列manA1和含信号肽的β-甘露聚糖酶基因manA2,在B.subtilis 168中克隆表达,分别筛选获得高效分泌表达β-甘露聚糖酶的重组菌株BPM1001(pMA5-manA1/B.subtilis 168)和BPM1002(pMA5-manA2/B.subtilis 168),结果表明菌株BPM1002总酶活力是菌株BPM1001的9.65倍,是原始菌株的13.1倍.在基因manA2下游引入His序列克隆出β-甘露聚糖酶基因manA3,获得枯草芽孢杆菌168重组菌株BPM1003.采用Ni-NTA柱纯化重组菌株BPM1003分泌表达的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质,该酶促反应的最适pH为6.5,最适温度为65℃,在37℃条件下保存一个月酶活力依然保留有77.8%.5 L发酵罐放大实验结果表明魔芋粉对于产β-甘露聚糖酶具有明显的诱导作用,酶活力最高可达2 748.82 U/mL.图9表3参19     

影响甜菜黑腐丝囊霉的几种生态学和生物学因子

通过对河西灌区甜菜(Beta vulgaris L.)黑腐病(Sugar Beet Black Rot)为期3a的研究，探讨了甜菜栽培品种与病害发病率及病原菌黑腐丝囊霉（Aphanomyces cochlioides)分离频率的关系以及3种环境因子即温度、pH值、不同天然培养基与甜菜黑腐丝囊霉的关系。结果表明：各栽培品种在田间的发病率与室内病原分离频率不同，其中工农2号田间发病率为1．3％，室内分离频率为93％，工农5号分别为1％和7．2％，宁甜301分别为2％和6．1％，工农2号具有更大的耐病性；甜菜黑腐丝囊霉的生长温度范围为5—30℃，最适温度为25—27℃，对高温敏感，33℃为其致死温度；甜菜黑腐丝囊霉可在pH3．5—11范围内生长，最适pH为5—9．9；甜菜黑腐丝囊霉在PDA、玉米粉琼脂、甜菜汁、麦芽糖—胨、麦芽糖酵母汁及燕麦琼脂培养基上均可生长，其中在甜菜汁培养基上生长最好．图4表3参11     

Preparation and assay of C-glucosyltransferase from roots of Pueraria lobata

C-glucosyltransferase (EC 2.4.1.X) is one of the key enzymes for the biosynthesis of puerarin. This paper describes the methodology in purification and assay of the enzyme for the first time in Puerarin lobata (Wild.) Ohwi. C-glucosyltransferase from roots of P. lobata was extracted and partially purified by (NH4)2SO4 saturation. The effects of pH, temperature, and substrate concentration on the activity of the enzyme were investigated. The properties of the puerarin produced by C-glucosyltransferase were studied by thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). The peak activity of C-glucosyltransferase was detected in fraction of by 80% saturation of (NH4)2SO4 and the optimal conditions for enzymatic reaction were 35.5 micromol l(-1) of isoliquiritigenin and 560 micromol l(-1) of UDP-G at pH 8.1, 28 degrees C for 1 h. Mn2+ at 1 mmol l(-1) and Al3+ at 1 mmol l(-1) increased the enzyme activity, while Mg2+ inhibited its activity. The enzyme activity in Nicotiana tabacum and P. lobata were detected under the above assay conditions. Higher activity was found in roots than in leaves and stems of P. lobata, while no enzyme activity was detected in leaves of N. tabacum. It was the first time that activity of C-glucosyltransferase, which transforms isoliquiritigenin to puerarin, was detected in P. lobata.     

硫酸盐还原菌对酸性废水中重金属的生物沉淀作用研究

在小型连续搅拌槽式反应器（CSTR）中,研究了持续低pH条件下,硫酸盐还原菌的生物沉淀作用对人工配制酸性重金属废水的处理效果。试验设置反应器进水pH值依次为4-3,3．5和2．6三个处理,进水中Cu^2＋、Zn^2＋和Cr^3＋含量分别为65、36和10mg·L^-1,SO4^2-含量约为6200mg·L^-1,接种物为经耐酸驯化的混合硫酸盐还原菌,试验时控制水力停留时间为36h,通过定期测定反应器出水pH、氧化还原电位（ORP）、碱度、SO4^2、S^2-以及重金属含量变化等指标来考察废水生物沉淀的处理效果。研究结果表明：对于进水pH值为2．6～4.3的酸性重金属废水,硫酸盐还原菌的生物沉淀作用均有较好的处理效果。处理后,反应器出水pH值大幅升至6．5～8．0,碱度由起始的300～2000mg·L^-1增至7500-4600mg·L^-1,废水中S041-还原率达72％～80％,Cu^2＋和Zn^2＋的去除（沉淀）率达99．9％,Cr^3＋去除率达99．1％。此外,随着进水pH值由413降至2．6,反应器出水pH和碱度均呈现逐步下降的趋势,而S04}的生物还原和重金属的去除效果变化不大。从反应器运行稳定性考虑,控制酸性重金属废水的进水pH值为3．5较适宜今后的实际应用。