一种新的中温酸性α-淀粉酶的分离纯化及酶学性质

从Bacillus sp.中分离纯化了一种新的中温酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究.粗酶经硫酸铵沉淀、 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、 Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤后获得电泳均一的α-淀粉酶,其分子量(Mr)约为56×103.该酶最适反应pH为5.0,在pH 5.0～11.0范围内稳定,具有较好的耐酸特性.该酶最适反应温度为40～50 ℃,在40～60 ℃范围内稳定.在60 ℃、 pH 4.5时,该酶能快速有效水解可溶性淀粉;在pH 5.0时该酶对多种生淀粉底物也具有良好的水解作用.因此,该酶有助于解决中温条件淀粉加工行业中,液化酶和糖化酶由于适用pH值的差异而无法联用的难题,是一种具有研究价值和应用前景的中温酸性α-淀粉酶.经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中两个肽段的氨基酸序列,通过比对发现,该酶与NCBI中已报道的α-淀粉酶序列具有一定的同源性,同时,在氨基酸水平上也存在着差异.     

耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

高温α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现高温α-淀粉酶基因的高效表达,本研究比较了不同启动子对地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的影响.分别用强启动子P43和地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子构建了表达载体pP43NMK-amy和pUBCl9-amy,并在枯草芽孢杆菌BacillussubtilislA752S中进行表达.结果表明,与地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基闪自身启动子相比,采用P43启动子的耐高温α-淀粉酶其表达水平提高了8.9倍.而且在枯草芽孢杆菌B.subtilislA752S中分泌表达的α-淀粉酶仍具有耐高温的特性,酶反应的最适温度为90℃,表明酶的热稳定性南蛋白质本身的氨基酸序列决定的.     

极端嗜热厌氧纤维素菌的分离鉴定、系统发育分析及其酶学性质的研究

从云南高温温泉、油井等热源地区采集的大量样品中,获得了一株特殊的极端嗜热厌氧纤维素分解菌B2.分离菌株直杆,革兰氏阴性(G-),未观察到孢子,细胞单个或成对出现.菌体大小为0.4μm×(2-4)μm,严格厌氧,生长温度范围50-70℃,最适生长温度65℃.pH范围4-8,最适pH 7.0.在纤维素粉琼脂上菌落直径2-4 mm,乳白色.分离菌株能利用纤维二糖、葡萄糖、蔗糖、松子糖、淀粉、覃糖等作为碳源,分离菌株还可利用纤维素滤纸、纤维素粉、微晶纤维素、纤维素粉MN300和甘蔗渣、水稻秸杆.发酵纤维素产生乙醇、乙酸.在菌株B2的纤维素酶系中,C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶的最适温度分别为80℃、80℃和70℃,其比值为1:9:10,同时发现Cx酶具有较高的热稳定性.部分长度的16S rDNA序列分析表明,分离菌株B2与Thermoanaerobacter ethanalicus具有99.8％相似性.分离菌株B2为Thermoanaerobacter属.图5表3参21     

产冷适应复合酶菌株Pseudomonas sp.NJ197的选育、发酵条件及酶学性质

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株同时产多种冷适应酶的菌株NJ197,细菌学形态鉴定及16S rDNA序列分析表明,该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas).生长特性研究表明,该菌株属于耐冷菌,其最适生长温度为5~15℃.NJ197菌株能利用多种单一的碳、氮源产酶,最适产酶温度为20℃,最高产酶温度为30℃.粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE cellulose-52柱层析初步分离纯化后进行酶学性质的研究.该菌株所分泌复合酶中脂肪酶和淀粉酶的活力最高,它们的最适作用温度分别为30℃和35℃,最适pH值分别为9.0和9.5,对热敏感,是典型的碱性冷适应复合酶.Ca2 、Mn2 、Cu2 、Co2 、Fe3 对该复合酶有较为明显的激活作用,而Zn2 、Hg2 、Rb2 、Cd2 、EDTA则能抑制酶活.其中脂肪酶能在高浓度的SDS、CHAPS等变性剂中表现出较好的稳定性.图5表2参21     

运动发酵单胞菌共表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶发酵甘薯生产乙醇

运动发酵单胞菌是乙醇发酵的极佳菌种,但其所能利用的发酵底物范围狭窄,不能利用淀粉作为发酵底物.为增加其利用底物的范围使其能够水解淀粉,本研究构建了3种表达淀粉酶的运动发酵单胞菌菌株:1)Zymomonas mobilis(pAmyE)表达α-淀粉酶;2)Z.mobilis(pGA)表达葡萄糖淀粉酶;3)Z.mobilis(pAmyGA)共同表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶.DNS法测定淀粉酶活显示,每种转化菌株的胞外淀粉酶活性均高于胞内,且两种淀粉酶共表达的酶活高于这两种淀粉酶单独表达的酶活之和,说明这两种淀粉酶能够协同作用降解淀粉.对于重组菌株Z.mobilis(pAmyGA),约59.3%的淀粉酶活性都在胞外检测到.用淀粉含量高且耐贮存的徐薯18匀浆加少量葡萄糖作为培养基直接用上述3个菌株发酵生产乙醇.结果显示,共表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的重组菌株Z.mobilis(pAmyGA)的乙醇产量为54.7 g/L,达到了理论值的83.2%,表明本研究得到了能够直接高效利用淀粉生产乙醇的运动发酵单胞菌的菌株.     

一株耐冷菌所产降解酶的特性及应用

从我国寒冷地区筛选到一株能产低温降解酶的菌株.细菌学形态及16S rDNA鉴定表明,该菌株属希瓦氏菌属(Shewanella),最适生长温度为5～15℃,属耐冷菌,并暂命名为Shewanella sp.J5.菌株J5分泌的降解酶中蛋白酶和淀粉酶所表现的活力较高,在0℃下分别仍能保持20%和40%的酶活性,最适温度分别为40℃和30℃,最适pH分别为8.0和7.0～10.0,且对热敏感,属于碱性低温酶;金属离子中Mn2+、Fe2+对蛋白酶有明显的促进作用,而淀粉酶对金属依赖性较小;HPSEC结果表明,低温蛋白酶在水解酪蛋白过程中,对相对分子质量10 000的大分子肽水解能力很强.脱氢酶酶活测定结果表明,低温下菌株活性显著高于常温活性污泥,5℃下,添加菌株J5到活性污泥中可使废水COD去除率提高33%.因此,该菌株在低温污水处理上具有一定的应用前景.     

污泥减量菌剂及其水解污泥条件优化

为获取高效降解污泥胞外聚合物的优势菌种以用于最大程度使污泥减量化,从合肥望塘污水厂活性污泥中筛选3株具有高效代谢淀粉酶和蛋白酶的菌株SL~(-1)0、SL~(-1)1和SL~(-1)6.通过形态特征、16S rRNA gene序列分析和系统发育分析,菌株SL~(-1)0、SL~(-1)1和SL~(-1)6分别鉴定为枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌属(Bacillus amyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌属(Bacillus megaterium).以污泥SCOD为指标,通过正交实验确定污泥减量菌剂各菌株最佳配比为SL~(-1)0∶SL~(-1)1∶SL~(-1)6=3∶2∶1,菌剂培养条件优化实验确定最佳培养时间为32 h,最佳培养温度为35℃,发酵培养基最适初始p H值为6.0,发酵最适装液量为80 m L/250 m L.优化污泥减量菌剂培养条件后用于处理污泥,确定处理时间为150 min,此时SCOD为841.19 mg·L~(-1),VSS为2316.54 mg·L~(-1),VSS溶解率为24.51%.     

地衣芽孢杆菌生麦芽糖α-淀粉酶的基因克隆与鉴定

以地衣芽孢杆菌ATCC14580基因组DNA为模板,PCR扩增出1.7 kb大小的麦芽糖淀粉酶基因amyM,克隆入表达载体pET-28a(+),转化Escherichia.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,测定麦芽糖淀粉酶酶活性.结果表明,麦芽糖淀粉酶基因amyM获得了活性表达,酶活力为3.797 U/mL,SDS-1PAGE电泳结果显示出相对分子质量约为67×103的特异性蛋白质条带.酶学性质分析表明,重组麦芽糖淀粉酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH为6.5,在45℃以下的中低温环境保持稳定,且能在比较宽的pH范围内(pH 4.5～8.5)稳定.图3表1参16     

Rhizopus microsporus var. chinensis生淀粉糖化酶的分离纯化及酶学性质

从Rhizopus microsporus var.chinensis CICIM F0088菌株中分离纯化一种新的具有生淀粉降解能力的糖化酶,并研究其酶学性质.经硫酸铵沉淀、双水相交换、DEAE-650M阴离子层析、Bio-Rad制备电泳等步骤后获得电泳均一的糖化酶,其相对分子质量约为52×103.该酶最适反应pH为4.5,在pH3.5～6.5范围内稳定;最适反应温度为75℃,具有较宽的pH耐受范围和较高的温度耐受性.经飞行质谱分析得到酶蛋白中3个肽段的氨基酸序列,通过比对发现,该酶与NCBI中已报道的糖化酶序列具有一定的同源性.     

成熟小麦种子中残留的α-淀粉酶对小麦馒头品质的影响

α-淀粉酶通过降解淀粉产生发酵糖,并改变淀粉的物化特性,进而影响小麦制品的品质,其影响与α-淀粉酶来源、含量及小麦制品种类有关.成熟小麦籽粒中残留的α-淀粉酶活性存在极大差异,为了解迟熟α-淀粉酶对馒头品质的影响,以重组自交系群体中α-淀粉酶活性极端的小麦品系为材料,比较高低酶活材料制作的馒头品质之间的差异;并依据小麦材料α-淀粉酶活性的分布范围,设定不同的外源α-淀粉酶浓度,研究外源α-淀粉酶对小麦馒头质构、感官品质及微观结构的影响.结果显示,过高的内源α-淀粉酶含量(降落值小于300 s)会导致馒头的高径比及质构参数下降,这种变化趋势与添加过多外源α-淀粉酶的效果类似;α-淀粉酶含量过高,造成淀粉糊化过度,产气过多,馒头内部结构被破坏,持气能力降低,馒头塌陷;降落值不低于300 s的材料制作的馒头品质较好.本研究表明成熟种子中残留的α-淀粉酶对馒头品质有显著影响,优质馒头品种选育时应关注小麦α-淀粉酶活性的差异.(图4表11参35)     

一株大熊猫肠道厌氧纤维素菌的分离鉴定、系统发育分析及生物学特性的研究

从成都动物园健康大熊猫的肠道采集样品,富集分离获得一株典型的厌氧纤维素分解菌PD.分离菌是杆状,革兰氏阳性(G ),菌体大小为0.5μm×(3～5)μm,严格厌氧;生长温度为25～40℃,最适生长温度为38℃;pH范围5.0～9.0,最适pH7.2;在纤维素粉作碳源的琼脂培养基上菌落直径为1～3mm,白色透明斑;分离菌株不仅能利用纤维二糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、松三糖、覃糖等多种可溶性碳源,而且可以利用纤维素粉等不溶性碳源.同时,对菌株PD进行了16SrDNA的PCR扩增,并对扩增产物测序.对16SrDNA部分序列进行了分析,并构建了系统发育树,表明菌株PD属于梭菌属,与Clostridiumlentocellum(T)的16SrDNA序列具有92.2%相似性.图5表1参18     

β-甘露聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达

从Bacillus subtilis JNA 3-10中克隆出β-甘露聚糖酶基因成熟肽链编码序列manA1和含信号肽的β-甘露聚糖酶基因manA2,在B.subtilis 168中克隆表达,分别筛选获得高效分泌表达β-甘露聚糖酶的重组菌株BPM1001(pMA5-manA1/B.subtilis 168)和BPM1002(pMA5-manA2/B.subtilis 168),结果表明菌株BPM1002总酶活力是菌株BPM1001的9.65倍,是原始菌株的13.1倍.在基因manA2下游引入His序列克隆出β-甘露聚糖酶基因manA3,获得枯草芽孢杆菌168重组菌株BPM1003.采用Ni-NTA柱纯化重组菌株BPM1003分泌表达的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质,该酶促反应的最适pH为6.5,最适温度为65℃,在37℃条件下保存一个月酶活力依然保留有77.8%.5 L发酵罐放大实验结果表明魔芋粉对于产β-甘露聚糖酶具有明显的诱导作用,酶活力最高可达2 748.82 U/mL.图9表3参19     

3株高温蛋白酶产生菌的分离与鉴定

从云南温泉的污泥样品中分离到3株产蛋白酶的高温菌SB11、SB31和SC5,通过其形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列比对分析等,初步鉴定这3株菌都属于土芽孢杆菌属(Geobacillus),其最适生长温度为60℃,最适pH为6.三者的蛋白酶活力分别可达35.6、26.1和26.6UmL-1,最适酶反应温度都在70℃以上,其中菌株SB31的蛋白酶其最适酶反应温度高达80℃,远高于一般动植物来源的蛋白酶.图4表1参11     

嗜碱菌A4-10碱性纤维素酶产生条件及性质的初步研究

从４８ 份土壤和天然碱湖样品分离出能产生胞外碱性纤维素酶的嗜碱细菌１３５ 株,其中７ 株菌产酶活力大于３ Ｕ／ｍＬ,菌株Ａ４１０ 经条件试验后酶活力达２１ Ｕ／ｍＬ,该菌产生碱性纤维素酶最适培养温度为３４ ℃,最适碳源为ＣＭＣＮａ,最适氮源为复合蛋白胨和酵母粉,该酶的最适反应温度５５ ℃,最适反应ｐＨ９．０ ．     

米曲霉产氨基酰化酶条件及部分酶学性质研究

通过单因子和多因子摇瓶正交优化试验,确定了米曲霉液态发酵产氨基酰化酶的最佳发酵条件.优化发酵培养基组成(ρ/gL-1):葡萄糖40,蔗糖10,可溶性淀粉20,蛋白胨2.5,马铃薯液1000mL,pH自然.培养基装量50mL/250mL三角瓶,接种量4%.培养温度30℃,转速100r/min,发酵时间42h.每50mL培养物的总酶活由优化前的2627u提高到7338u,是优化前的2.79倍.研究了米曲霉氨基酰化酶的部分酶学性质.该酶催化反应的最适pH为7.0,最适温度为40℃,低浓度的Co2 (5×10-4mol/L)对酶活激活作用显著.图5表2参8     

嗜碱菌A4—10碱性纤维素酶产生及性质的初步研究

从４８份土壤和天然碱湖榈分离出能产生胞外碱性纤维素酶的嗜碱细菌１３５株,其中７株菌产酶活力大于３Ｕ／ｍＬ,菌株Ａ４－１０经条件试验后酶活力达２１Ｕ／ｍＬ,该菌产生碱性纤维素酶最适培养温度为３４℃,最适碳源为ＣＭＣ－Ｎａ,最适氮源为复合蛋白胨和酵母粉,该酶的最适反应温度５５℃,最适反应ｐＨ９．０。     

降解植物甾醇为甾体9α-OH-AD菌株的筛选与鉴定

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是重要的甾体药物中间体,多用于生产糖皮质激素类药物.通过微生物法转化植物甾醇生成9α-OH-AD,将为工业化生产提供极大便利.从榨油厂、油菜花田等多处土壤中筛选出1株高效转化植物甾醇为9α-OH-AD的菌株,根据16S r DNA序列比对并结合菌株的形态特征、生理生化特征分析,鉴定其为分枝杆菌属,并将其命名为Mycobacterium sp.LY-1.该菌在往复式摇床中培养,当培养条件为温度30℃、转速120 r/min、转化时间7 d、底物添加浓度为5 g/L时,9α-OH-AD产物得率达到16.2%.为解决底物植物甾醇在水中溶解性较差的问题,考察了助溶剂(吐温80、β-环糊精)对植物甾醇转化产甾药中间体9α-OH-AD效率的影响.经过筛选,最终确定最适助溶剂为0.1%的吐温80.在此条件下,当底物投料浓度为15 g/L时,9α-OH-AD的浓度达到3.9 g/L,产物摩尔得率提高至35.1%.本研究表明菌株LY-1转化效率好,可为后续的代谢工程改造提供便利并为后期用于工业化生产奠定基础.     

纤维素酶产生菌HS-F9的筛选鉴定和产酶条件优化

为了选育高产纤维素酶菌株,通过刚果红鉴别培养基以及滤纸条崩解实验测定,从牛粪堆肥中筛选到一株产纤维素酶的真菌HS-F9,根据菌株形态特性和18SrRNA基因序列分析,初步鉴定该菌为绿色木霉(Trichoderma viride).利用液体发酵培养产生纤维素酶,研究了碳源、氮源、培养时间、培养温度、培养基起始pH、接种量对菌株HS-F9产酶的影响.结果表明:产EG、CBH和FPA的最适碳源均为CMC-Na;EG和CBH在以蛋白胨为唯一氮源时酶活最高,FPase则在以黄豆粉为唯一氮源时酶活最高;产生EG、CBH和FPA的最适温度分别为30℃、30℃、33℃;最适起始pH为3.0、3.0和4.0;EG和FPase的最适接种量为2%,CBH最适接种量达到了8%;培养时间均以5～6d为宜.在最适条件下培养,该菌株EG、CBH和FPase的酶活分别达到了5275.3U/mL、8502.1U/mL和3619.1U/mL,是未优化前的1.42、1.35和1.32倍.图6表2参23     

一种野生多孔菌的分离、鉴定、培养条件及抗氧化活性

多孔菌是一类子实体呈孔状且质地为革质至木质的大型担子菌,其中一部分具有较高的药用价值.对一株野生多孔菌子实体进行分离纯化获得纯培养BJ菌株,并对其分类、最适培养条件和液体发酵产物抗氧化活性进行分析.采用形态学和ITS分类学鉴定菌株的分类学地位;通过测定菌株在不同碳源、氮源等培养基中的生长状况,研究菌丝最适培养条件;使用2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)法测定菌株发酵液总抗氧化活性;使用总超氧化物歧化酶(T-SOD)法、1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基(DPPH)法测定菌株发酵液菌体的总超氧化物歧化酶活力和自由基清除能力.结果显示:经鉴定BJ菌株为石榴嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia punicata).菌丝体最适培养碳源为葡萄糖、麦芽糖和淀粉,最适氮源为酵母浸粉,最适C/N比为10/1,最适温度为28℃,最适pH为7.0.发酵液总抗氧化活性为0.517 mmol/L(维生素E),菌体的总超氧化物歧化酶活力为770.37 U/g,DPPH自由基清除力的IC_(50)为2.14 mg/mL.本研究从野外获取了一株高抗氧化活性的药用多孔菌资源,可为野生药用真菌的开发利用提供理论依据.     

具脂肪酶和酯酶活性酵母菌的选育和酶学性质初步研究

从济南市区得到的含油土壤中筛选得到一株酵母Ｓ９ 菌株,它可以同时产生较高酶活的脂肪酶和酯酶．对影响Ｓ９ 产脂肪酶和酯酶的各种因素进行了研究,确定２ ％ 的黄豆粉为最佳氮源,１ ％ 的可溶性淀粉为最佳碳源,最适的初始培养ｐＨ和温度分别为ｐＨ６ ．５ 和２８℃,另外不同的表面活性剂对产酶也有不同的影响．对Ｓ９脂肪酶和酯酶的各种酶学性质进行的研究表明,脂肪酶和酯酶的最适作用温度都为３０℃,最适作用ｐＨ 分别为７ ．０ 和８．０,两者都属于常温酶,在３０℃～４０ ℃范围内比较稳定,前者在中性偏碱的ｐＨ 环境中比较稳定,后者属于碱性酶,在ｐＨ７ ．５～１０ ．５ 范围内相当稳定．