产冷适应复合酶菌株Pseudomonas sp.NJ197的选育、发酵条件及酶学性质

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株同时产多种冷适应酶的菌株NJ197,细菌学形态鉴定及16S rDNA序列分析表明,该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas).生长特性研究表明,该菌株属于耐冷菌,其最适生长温度为5~15℃.NJ197菌株能利用多种单一的碳、氮源产酶,最适产酶温度为20℃,最高产酶温度为30℃.粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE cellulose-52柱层析初步分离纯化后进行酶学性质的研究.该菌株所分泌复合酶中脂肪酶和淀粉酶的活力最高,它们的最适作用温度分别为30℃和35℃,最适pH值分别为9.0和9.5,对热敏感,是典型的碱性冷适应复合酶.Ca2 、Mn2 、Cu2 、Co2 、Fe3 对该复合酶有较为明显的激活作用,而Zn2 、Hg2 、Rb2 、Cd2 、EDTA则能抑制酶活.其中脂肪酶能在高浓度的SDS、CHAPS等变性剂中表现出较好的稳定性.图5表2参21     

产蛋白酶北极海洋耐冷菌ArcB82306的筛选及其蛋白酶性质

从北极加拿大海盆海水中分离到一株产蛋白酶耐冷菌株ArcB82306.16S rDNA基因序列的同源性分析表明,该菌株属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas).蛋白酶酶谱显示该菌株分泌多种胞外蛋白酶.胞外蛋白酶的最适作用温度和最适pH分别为45℃和9.菌株ArcB82306所产蛋白酶受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF抑制,金属蛋白酶抑制剂EDTA以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64对蛋白酶活性无影响,结果提示该蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶.金属离子Ni2+、Zn2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Ca2+和Mg2+可部分抑制酶的活性,而DTT和巯基乙醇等还原剂及Triton X-100和吐温-80等表面活性剂对酶活性无显著影响.     

低温条件下苯酚降解菌的分离鉴定及降解特性

在15℃低温的条件下,从本溪钢铁集团公司焦化厂曝气池活性污泥中分离、筛选得到1株高效苯酚降解菌,即Bb-2,它对起始质量浓度为400 mg·L-1的苯酚降解率为74.8%.经形态观察和生理生化实验,初步鉴定为假单胞菌属.该菌株能在4～40℃的温度条件下生长繁殖,因此为耐冷菌.当醋酸钠和葡萄糖作为第二碳源存在时,促进了低温下Bb-2对苯酚的生物降解.采用反应动力学方程拟合其降解过程,初始苯酚质量浓度较低时,遵循Monod方程;初始质量浓度较高时,其降解过程以基质抑制型的Haldane方程为主.     

一株高浓度苯胺、苯酚降解菌的分离鉴定及降解特性

从某生活污水厂活性污泥中分离到一株能够以苯胺或苯酚为唯一碳源、能源生长的高效降解菌菌株ANP.经形态特征、生理生化及16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为Delftia sp.进一步研究表明,该菌株利用苯胺生长的最适温度和pH分别为30℃和6.0,最适降解浓度为2000mgL-1;利用苯酚生长的最适温度和pH分别为35℃和8.0,最适降解浓度为1500mgL-1.苯胺、苯酚混合培养时该菌株对苯酚的降解过程要滞后于对苯胺的降解过程,但经过42h均能彻底降解.研究了ANP降解苯胺和苯酚的开环途径,苯胺芳环通过间位途径裂解,苯酚芳环则是通过邻位途径裂解.图4表1参18     

一株产酸性α-淀粉酶菌株的筛选、纯化及酶学性质

从南宁酒厂附近土壤中筛选到一株产淀粉酶的野生菌株GXBA-4,经革兰氏染色、芽孢染色以及16SrDNA鉴定,初步确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacien).将该菌株发酵液经过硫酸铵沉淀和凝胶过滤纯化出一种α-淀粉酶,该酶相对分子质量约为57×103;反应最适温度为40~45℃,适应温度范围广,30℃时仍具有80%以上的相对活力;最适pH为5.0,为低温酸性淀粉酶.该酶水解可溶性淀粉的产物,经HPLC检测主要是以葡萄糖,麦芽糖以及麦芽三糖为主的低聚糖,分别以α-环糊精、β-环糊精、可溶性淀粉、玉米生淀粉为底物,还原糖产物比为0:0:99:3.4,表明该酶为典型的α-淀粉酶.     

降解菌djl-6多菌灵水解酶的提取及性质

以往对多菌灵降解菌Rhodococcus qingshengii sp.nov.djl-6的降解途径研究显示,该菌株首先通过多菌灵水解酶将多菌灵水解成二氨基苯并咪唑,从而对多菌灵进行脱毒.为开发酶制剂并有效应用于环境中残留污染物多菌灵的降解,比较了不同提取方法(高压细胞破碎、超声波破碎和添加溶菌酶破碎)对多菌灵水解酶提取效率的影响,并对其酶学特性进行了初步研究.结果表明,djl-6菌株在LB培养基中培养72~84 h,生长量和产酶量均达到最大值.采用超声波破碎提取酶的效率较高(蛋白浓度为7.92 mg/mL),但酶活损失较大(比酶活只有1.2 U/μg protein).多菌灵水解酶属于一种胞内组成型酶.该酶水解多菌灵的最适pH值为7.0,最适温度为30℃,Zn2+和K+对酶活有一定的抑制作用.     

3株高温蛋白酶产生菌的分离与鉴定

从云南温泉的污泥样品中分离到3株产蛋白酶的高温菌SB11、SB31和SC5,通过其形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列比对分析等,初步鉴定这3株菌都属于土芽孢杆菌属(Geobacillus),其最适生长温度为60℃,最适pH为6.三者的蛋白酶活力分别可达35.6、26.1和26.6UmL-1,最适酶反应温度都在70℃以上,其中菌株SB31的蛋白酶其最适酶反应温度高达80℃,远高于一般动植物来源的蛋白酶.图4表1参11     

一种白腐真菌的分离、鉴定、培养及产漆酶条件

白腐真菌是一类降解木质素使木材形成白色腐朽的担子菌,往往具有高产胞外漆酶的活性.从北京农学院校园内分离到一株高温型、高产漆酶白腐真菌菌株,编号为BUA-01.结合形态学特征与ITS序列分析,确定其分类学地位;进一步研究其菌丝生长的最适碳源、氮源、碳氮比(C/N)、生长因子、最适温度和最适p H值;利用不同浓度Cu~(2+)(Cu SO4)的诱导,探讨液体发酵条件下对胞外漆酶产量的影响;通过向发酵液中加入3种偶氮染料(依文思蓝、甲基橙和铬黑T),研究菌株对染料的降解效果.结果表明,该菌株与毛栓菌(Trametes hirsuta)的同源性最高,为100%,遗传距离为0,确定BUA-01菌株为栓菌属(Trametes)真菌.菌丝体生长的最适碳源为淀粉,最适氮源为黄豆粉、酵母浸粉,最适C/N值为40/1和10/1,最适温度为37℃,最适p H为6.0-7.0,供试生长因子对菌丝生长无显著促进作用.0.25m mol/L的Cu~(2+)对胞外漆酶产量有极显著的促进作用,在96 h时,发酵液的活性达到最高,为1081.33±6.3 U/m L,是对照组的26倍.BUA-01菌株对偶氮染料降解效果显著,12 h对依文思蓝、甲基橙和铬黑T的脱色率分别为93.31%±0.16%、92.37%±0.42%和79.25%±0.64%.本研究表明菌株BUA-01在产胞外漆酶和染料降解方面具有潜在应用价值.     

深海沉积物宏基因组文库中产蛋白酶克隆的筛选及性质分析

提取东太平洋深海沉积物宏基因组DNA,构建了未培养微生物宏基因组文库.该文库平均插入片段30 kb以上,含有7 000个克隆,含外源DNA总长度约为210 Mb.从文库中筛选到18个产胞外蛋白酶的克隆,16S rRNA分析表明,它们分别来源于假单胞菌(Pseudomonas)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)和弧菌(Vibrio)3个菌属.根据活性大小及来源菌株的16S rRNA序列比较,选择10个蛋白酶进行酶学性质分析,结果表明,它们的最适作用pH值在7～10之间,最适作用温度在10～40℃之间.其中Pro20蛋白酶最适作用温度最低,为10℃;Pro1蛋白酶具有最适作用温度低(20℃)、pH耐受性好、热稳定性较好等特性,具有良好的应用开发潜力.图6参16     

苯甲酰脲类杀虫剂降解菌的分离鉴定及其降解特性

从农药厂活性污泥中分离筛选到一株可降解灭幼脲、除虫脲、氟铃脲的菌株,命名为M6.经生理生化特征和16S rRNA基因序列分析,将其鉴定为无色杆菌属(Achromobacter sp.).菌株M6可在48 h内降解91%以上初始浓度为100mg/L的灭幼脲、除虫脲、氟铃脲;且可在不添加其他碳源的情况下,以这3种杀虫剂为唯一碳源生长.选取菌株降解效果较好的灭幼脲为底物,研究其降解特性.菌株M6降解灭幼脲时,对温度、pH值等培养条件适应范围较宽,降解灭幼脲的最适温度为30℃,最适pH为7.0;可耐受400 mg/L的灭幼脲.通过对乙酰氨基酚变色和芳基酰胺酶基因克隆试验,初步确定菌株M6通过水解酰胺键降解灭幼脲、除虫脲、氟铃脲.本研究得到了苯甲酰脲类杀虫剂的高效降解菌,可为其污染修复的开展提供资源和理论基础.     

干扰素废水菌种的筛选与产酶特性

针对干扰素废水具有抑制性导致活性污泥驯化培养难的问题,利用稀释涂布、富集培养的方法从干扰素废水中筛选出5株高效菌株,分别为IFN1~IFN5。观察5株高效菌种的菌落形态,经16S rDNA测序鉴定其中2株菌株为假单胞菌,2株菌株为索氏菌,1株为不动杆菌。完成了5株高效菌种的生理生化实验,分析其酶代谢系统:IFN1可产生蛋白酶和色氨酸酶;IFN2可产生过氧化氢酶、色氨酸酶和蛋白酶;IFN3可产生过氧化氢酶、色氨酸酶、蛋白酶和淀粉水解酶;IFN4可产生过氧化氢酶、蛋白酶和淀粉水解酶;IFN5可产生过氧化氢酶、蛋白酶。本研究为后续针对降解干扰素废水诱导酶的提取奠定基础。     

大熊猫肠道产果胶酶细菌的多样性及产酶特性

为探究大熊猫肠道微生物与消化的相互关系,利用果胶筛选培养基,从大熊猫新鲜粪便中分离具有产果胶酶活性的细菌,对获得的菌株采用生理生化特征和16S r DNA进行鉴定分类,探讨产果胶酶细菌多样性,并研究菌株的最适生长特性及产酶特性.共分离得到产果胶酶的细菌31株,属于志贺菌属(Shigella)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsilla)3个属,其中最高酶活为334.44 U/m L,最低酶活为15.6 U/m L.PF-4菌株具有最高的酶活,鉴定为肺炎克雷伯氏菌,生长温度范围为16-45℃,生长p H范围是5-8,最适产酶时间为24 h,最适产酶温度为37℃,最适产酶p H为6.结果为研究大熊猫消化系统中微生物果胶酶的来源及性质提供了参考.     

冰川环境耐冷菌的冷适蛋白酶分离纯化及酶学性质

采用离交和凝胶层析对“中国冰川1号”耐冷菌BacilluscereusSYPA23所产的蛋白酶进行分离纯化,并进行酶学性质研究.与中温酶相比,该蛋白酶具有较高的低温催化活力,其最适催化温度为42℃,适宜pH为7.0～8.5,SDSPAGE测定的分子量(Mr)为34.2×103.金属离子Mn2 、Ca2 对该酶有激活作用,Cu2 、Hg2 、Pb2 、Co2 对其活性有一定抑制作用.该酶属金属蛋白酶,其活性受EDTA强烈抑制,不受PMSF抑制.该蛋白酶具有低温酶典型的热不稳定性,0℃下半衰期24h,但Ca2 和一些低分子醇类物质能提高其稳定性.动力学数据分析表明,该蛋白酶在低温下对底物亲和能力高,在较宽温度范围内(25～45℃)均保持着较高的催化效能.图7表3参17     

高效处理草甘膦废水菌株的筛选

通过选择性富集、驯化培养、划线分离纯化,从三峡大学求索溪及宜昌某化工集团污水处理厂次生池、终生池和排污口4处活性污泥中分离得到菌株XF100,其中排污口的活性污泥中菌株XF100含量最大,其降解能力最强.经APT鉴定,菌株XF100为水生棒状杆菌(Corynebacterricus aquaticum).由单因子优化法实验得出菌株XF100降解草甘膦废水的最适条件:温度为30℃,pH为9.0,底物浓度为300 ml·1-1.最适条件下草甘膦废水降解率可达79.46%,其矿化程度较高.     

一株菲降解菌的特性及相关降解基因的克隆

从石油污染土壤中分离到一株菲降解菌2F5-2.根据该菌株生理生化特征和16S rDNA序列相似性分析,将其初步鉴定为鞘氨醇杆菌属(Sphingobium sp.).该菌株在10 h内对100 mg/L的菲的降解率为100%.降解菲的最适温度为30℃,最适pH为7.对降解途径的初步研究显示,该菌株通过水杨酸途径降解菲.克隆了编码芳香烃双加氧酶α亚基的基因phdA,它与菌株Sphingomonas sp.P2、Sphingobium yanoikuyae B1、Sphingomonas sp.ZP1中phdA的同源性分别为97.9%、98%和100%,表明该基因具有保守性.图6参16     

一株氰氟草酯降解新菌株Sphingopyxis sp.WP9的分离鉴定及降解特性

氰氟草酯是应用于稻田的一种除草剂,其广泛使用给水生生态带来了一定威胁.利用连续富集培养的方法,从农药厂活性污泥中筛选出一株氰氟草酯高效降解菌WP9.采用16S rRNA基因序列分析并结合菌落菌体形态和生理生化特性,将菌株WP9鉴定为鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis).在以100 mg/L氰氟草酯为唯一碳源的无机盐培养基中,菌株WP9在120 h内可将其降解97.03%.菌株WP9降解炔草酯的最适温度和pH分别为30℃和7.0;当菌株WP9的接种量≥5%时,其对100 mg/L氰氟草酯的降解效果较好;当氰氟草酯浓度≤100 mg/L时,菌株WP9对氰氟草酯的平均降解速率随着底物浓度的增加而呈指数增长.通过超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS)鉴定降解产物为氰氟草酸和氰氟草酚,推测氰氟草酯首先通过酯键水解生成氰氟草酸,然后氰氟草酸通过醚键水解生成氰氟草酚.本研究关于鞘氨醇盒菌对氰氟草酯降解的报道结果,可为开展氰氟草酯污染环境的生物修复提供新菌种和理论基础.(图8参30)     

孔雀石绿降解菌M3的分离鉴定及降解特性研究

从鱼塘底泥中筛选分离出1株能高效降解低含量孔雀石绿(MG)的细菌M3.经16S rDNA同源性序列分析,鉴定为泛菌属(Pantoea sp.).30 ℃静止培养条件下,该菌株对0.5、1.0、2.0和5.0 mg·L-1孔雀石绿5 d的降解率分别为97.54%、97.1%、100%和77.8%.菌株M3不能以MG为唯一碳源进行生长和代谢.葡萄糖、NH4NO3、KH2PO4/K2HPO4均能影响菌株M3对MG的降解.20～30 ℃温度范围内菌株M3对MG有明显降解效果,且降解速率随温度上升而提高.     

甲苯降解菌JB-1的分离、鉴定与降解特性

从南京石化废水处理池的活性污泥中分离到1株能以甲苯为唯一碳源生长的细菌,命名为JB-1.根据其生理生化特征和16SrDNA(GenBank Accession No. EU869278)序列相似性分析,将该菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.).该菌株在18h内能完全降解346.4mg/L的甲苯.降解甲苯的最适温度为30℃,pH为7.0,降解速率与初始接种量呈正相关.甲苯降解途径是通过甲苯双加氧酶形成顺甲苯二氢二醇,再经邻苯二酚2,3双加氧酶开环降解.     

高效异养硝化-好氧反硝化菌株TS-1筛选及降解特性

从实验室定向驯化的活性污泥中分离筛选出一株具有异养硝化-好氧反硝化功能的菌株TS-1.通过生理生化及16S r RNA基因序列鉴定其为脱氮副球菌,通过单因素和正交实验对其去除NH_4~+-N的最佳条件进行优化,并通过对比进一步探究其在不同氮源条件下对各形态无机氮的去除规律.结果表明该菌株最适碳源为丁二酸钠,最佳C/N为15,最佳接种量为5%,最适温度为30℃、p H为8.0.以初始浓度约为100 mg/L的NH_4~+-N、NO_3~--N和NO_2~--N分别为单一氮源时,菌株TS-1对各形态氮的去除率为97.49%、100%和95.94%;维持各形态氮初始浓度不变,将其两两混合时发现混合氮源中若包含NO_2~--N会使菌株OD_(600)值达到最大值所用时间延长,氮源中含有NH_4~+-N会降低菌株对其他形态氮源的去除率,以及NO_3~--N的添加会使菌株对NH_4~+-N的去除能力降低;3种形态氮源同时存在的条件下,该菌对各氮源去除能力由强至弱为NO_2~--NNH_4~+-NNO_3~--N.本研究从活性污泥中分离筛选出一株具有高效异养硝化-好氧反硝化功能的菌株TS-1,通过研究碳源、氮源、温度、p H得到了最佳降解条件,可为废水短程脱氮提供参考.(图9表4参37)     

病死猪堆肥高效降解复合菌系的构建及应用效果

为了缩短堆肥时间、提高堆肥产品质量,从病死猪好氧堆肥样品中筛选能高效降解蛋白质和脂肪的安全菌株,经拮抗验证后构建出病死猪堆肥高效降解复合菌系并进行现场堆肥试验.结果显示通过分离纯化共获得36株具有尸体降解能力的安全菌株,经酶活性测定复筛出10株具有较高蛋白酶及脂肪酶活性的菌株,对其进行菌种鉴定及菌株间拮抗研究后,混合构建为5组复合菌系,分别为A、B、C、D和E.通过比较复合菌系的蛋白酶及脂肪酶活性大小,进一步选择优选复合菌系E进行现场堆肥试验,结果表明堆肥期间对照组和接菌各组(2%和4%)最高温度分别达到约56.3、60.8和61.2℃;低剂量和高剂量接菌组堆肥温度达到55.0℃以上的高温天数均持续约7 d,显著高于对照组的3 d(P 0.01);堆肥结束时,对照组和接菌各组(2%和4%)降解率分别达到78.7%、97.7%和98.0%.本研究构建的复合菌系E可有效提高堆肥温度并延长高温维持时间,加速病死猪的降解.(图5表2参30)