高产木聚糖酶细菌的筛选、鉴定及其部分酶学特性

细菌木聚糖酶具有优良的酶学特性,发掘和研究高产菌株资源对促进木聚糖酶工业生产具有十分重要的意义.采用刚果红透明圈法从采集的土样样品中筛选分离得到1株高产细菌木聚糖酶的菌株SD4-4,通过形态特征及16S r DNA序列分析进行鉴定,并以本实验室保存的细菌木聚糖酶工业生产用菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SL作为对照,对比研究SD4-4的产酶水平及酶学性质.结果表明,SD4-4为短小芽孢杆菌(B.pumilus),利用小麦麸皮摇瓶发酵,其上清酶活可达1 166.0 U/m L,而SL上清酶活为281.0 U/m L.SD4-4所产木聚糖酶作用最适温度约为50℃,最适p H约为5.0.粗酶液在30-50℃的环境下处理10 min,相对酶活均保持在90%以上;在p H 4.0的条件下处理30 min,相对酶活仍有76%,酸性环境下稳定性较好.因此,菌株SD4-4产酶水平高于对照菌株SL,酶学特性更为优良,工业应用前景良好,尤其在饲料添加剂行业具有较大的开发潜力.     

一种白腐真菌的分离、鉴定、培养及产漆酶条件

白腐真菌是一类降解木质素使木材形成白色腐朽的担子菌,往往具有高产胞外漆酶的活性.从北京农学院校园内分离到一株高温型、高产漆酶白腐真菌菌株,编号为BUA-01.结合形态学特征与ITS序列分析,确定其分类学地位;进一步研究其菌丝生长的最适碳源、氮源、碳氮比(C/N)、生长因子、最适温度和最适p H值;利用不同浓度Cu~(2+)(Cu SO4)的诱导,探讨液体发酵条件下对胞外漆酶产量的影响;通过向发酵液中加入3种偶氮染料(依文思蓝、甲基橙和铬黑T),研究菌株对染料的降解效果.结果表明,该菌株与毛栓菌(Trametes hirsuta)的同源性最高,为100%,遗传距离为0,确定BUA-01菌株为栓菌属(Trametes)真菌.菌丝体生长的最适碳源为淀粉,最适氮源为黄豆粉、酵母浸粉,最适C/N值为40/1和10/1,最适温度为37℃,最适p H为6.0-7.0,供试生长因子对菌丝生长无显著促进作用.0.25m mol/L的Cu~(2+)对胞外漆酶产量有极显著的促进作用,在96 h时,发酵液的活性达到最高,为1081.33±6.3 U/m L,是对照组的26倍.BUA-01菌株对偶氮染料降解效果显著,12 h对依文思蓝、甲基橙和铬黑T的脱色率分别为93.31%±0.16%、92.37%±0.42%和79.25%±0.64%.本研究表明菌株BUA-01在产胞外漆酶和染料降解方面具有潜在应用价值.     

碱性β-聚糖酶产生菌选育及产酶条件优化

从碱性土样中分离到数十株产碱性β聚糖酶类的细菌,经摇瓶反复筛选后,得到一株碱性β聚糖酶产量较高的耐碱性细菌．经初步鉴定,属短小芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）．其纤维素酶作用的最适ｐＨ为７．６,最适θ为６０℃,木聚糖酶的作用最适ｐＨ为９．０,最适θ为５５℃．该菌的最适生长ｐＨ为８．０,最适产酶θ为２８～３２℃．木聚糖与山梨糖分别是木聚糖酶和纤维素酶的良好诱导物．以麸皮为碳源,产酶的最适浓度为５％．添加尿素和（ＮＨ４）２ＳＯ４为氮源可提高纤维素酶酶活２倍,木聚糖酶酶活１倍．发酵周期为６０ｈ,纤维素酶酶活最高可达１．２１ＩＵｍＬ－１,木聚糖酶酶活可达４３ＩＵｍＬ－１．     

产冷适应复合酶菌株Pseudomonas sp.NJ197的选育、发酵条件及酶学性质

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株同时产多种冷适应酶的菌株NJ197,细菌学形态鉴定及16S rDNA序列分析表明,该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas).生长特性研究表明,该菌株属于耐冷菌,其最适生长温度为5~15℃.NJ197菌株能利用多种单一的碳、氮源产酶,最适产酶温度为20℃,最高产酶温度为30℃.粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE cellulose-52柱层析初步分离纯化后进行酶学性质的研究.该菌株所分泌复合酶中脂肪酶和淀粉酶的活力最高,它们的最适作用温度分别为30℃和35℃,最适pH值分别为9.0和9.5,对热敏感,是典型的碱性冷适应复合酶.Ca2 、Mn2 、Cu2 、Co2 、Fe3 对该复合酶有较为明显的激活作用,而Zn2 、Hg2 、Rb2 、Cd2 、EDTA则能抑制酶活.其中脂肪酶能在高浓度的SDS、CHAPS等变性剂中表现出较好的稳定性.图5表2参21     

一株碱性果胶酶高产细菌的分离、系统发育分析和产酶条件的初步优化

从腐烂的苹果表皮筛选到一株碱性果胶酶的高产菌株,命名为WSHB04-02.分离菌株为革兰氏阳性细菌,有芽孢,菌落颜色为乳白色.分离菌株WSHB04-02的16SrDNA全序列分析表明,该菌株与Bacillussubtilus具有99%的相似性,并与其他13株产碱性果胶酶菌株的16SrDNA结果进行同源性分析,并构建系统发育树.发现菌株WSHB04-02在不含果胶类物质与Mg2 的培养基上能高产碱性果胶酶,在优化的培养条件下,碱性果胶酶的酶活达到34U/mL,在国内还未见报道.图6表2参15     

纤维素酶产生菌HS-F9的筛选鉴定和产酶条件优化

为了选育高产纤维素酶菌株,通过刚果红鉴别培养基以及滤纸条崩解实验测定,从牛粪堆肥中筛选到一株产纤维素酶的真菌HS-F9,根据菌株形态特性和18SrRNA基因序列分析,初步鉴定该菌为绿色木霉(Trichoderma viride).利用液体发酵培养产生纤维素酶,研究了碳源、氮源、培养时间、培养温度、培养基起始pH、接种量对菌株HS-F9产酶的影响.结果表明:产EG、CBH和FPA的最适碳源均为CMC-Na;EG和CBH在以蛋白胨为唯一氮源时酶活最高,FPase则在以黄豆粉为唯一氮源时酶活最高;产生EG、CBH和FPA的最适温度分别为30℃、30℃、33℃;最适起始pH为3.0、3.0和4.0;EG和FPase的最适接种量为2%,CBH最适接种量达到了8%;培养时间均以5～6d为宜.在最适条件下培养,该菌株EG、CBH和FPase的酶活分别达到了5275.3U/mL、8502.1U/mL和3619.1U/mL,是未优化前的1.42、1.35和1.32倍.图6表2参23     

一种田头菇属真菌新记录种的生物学与产酶特性

田头菇是重要的经济食用菌类型,目前我国报道种仅有10个.为驯化栽培和开发利用新的田头菇属食用菌种质资源,以采集自北京延庆的我国新记录种菌核田头菇(Agrocybe tuberosa)GSM-12菌株为材料,研究了菌丝生长的最适碳源、氮源、C/N比、最适温度、最适pH值等生物学特性,以及菌丝体液体发酵产漆酶、蛋白酶、植酸酶和核糖核酸酶的特性.结果显示,菌丝生长的最适碳源为蔗糖,最适氮源为黄豆粉,最适C/N比为20/1-30/1,最适温度为24℃,最适pH为7.0.产酶特性研究显示,GSM-12菌株具有漆酶、植酸酶和核糖核酸酶活性,菌丝体中酶活较高,分别为(77.28±10.44)U/mg、(61.01±2.71)U/mg和(21.13±0.60)U/mg.本研究表明菌株GSM-12可以利用常规营养元素实现营养生长,同时菌丝体液体发酵具有良好的产酶特性.     

不同生境产脂肪酶菌株的筛选及多样性

为发掘不同特性脂肪酶微生物资源,采用纯培养方法从青海高寒草地、雅安山区、成都平原分离得到产脂肪酶菌株54株.通过对菌株的DNA进行ERIC-PCR指纹图谱分析,按聚类树划分为5个操作分类单元.16S rDNA序列测定和聚类分析显示,分离菌株分布于芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠杆菌属(Enterobacter).多样性分析表明,与青海高寒草地、雅安山区相比,成都平原产脂肪酶菌株遗传多样性更为丰富.在54株菌中都出现了300 bp和1 300 bp两个特异且稳定出现的条带,这两个特异条带可能是产脂肪酶菌株的SCAR标记条带.     

螺孢菌ZG9901的筛选及其产碱性果胶酶发酵条件研究

用筛选培养基从芦苇土壤中筛选到７株碱性果胶酶产生菌株，经初筛选和复筛得到产酶活性较高的一株菌株ＺＧ９９０１，初步鉴定为螺孢菌属Ｓｐｉｒｉｌｌｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．最适摇瓶产酶条件是：果胶２０ｇ／Ｌ，乳糖２０ｇ／Ｌ，蛋白胨３ｇ／Ｌ，酵母膏４ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ０．０４ｇ／Ｌ，ＭｇＣｌ２０．２ｇ／Ｌ，ｐＨ９．０，３２℃培养３６ｈ达到产酶高峰。     

若尔盖高原湿地纤维素降解菌组成及产酶特性

以青藏高原湿地若尔盖地区不同生境土壤为材料,通过富集,计算降解圈个数,分析该地区纤维素降解菌的含量.分离得到15株具有纤维素降解能力的菌株,从中复筛得到一株降解能力较强的菌株3C-6.12,经16S rRNA和Biolog鉴定为野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris).该菌株在以质量比例3:2的麸皮与玉米芯为发酵培养基时,酶活最高为66.44U/mL,最适pH值为6～8,最佳生长温度为30℃.该菌株的成功选育为后续高效、充分利用纤维素类物质生产生物能源提供了很好的菌种来源.     

碱性β—聚糖酶产生菌选育及产酶条件优化

从碱性土样中分离到数十株产碱性β－聚糖酶类的细菌经摇瓶反复筛选后,得到一株碱性β－聚产产量较高的耐碱细菌经初步鉴定,属短小芽孢杆菌,其纤维素酶作用的最适ＰＨ为７．６,最适θ为６０℃,木聚糖酶的作用最适ＰＨＪ为９．０,最适θ为５５℃,该菌的最适生长ＰＨ为８．０,最适产酶θ为２８－３２℃,木聚糖与山梨糖分别是木聚糖酶和纤维素酶的良好诱导物,以麸皮为碳源,产酶的最适浓度为５％,添加尿素和（ＮＨ４）２ＳＯ     

一株嗜酸性产纤维素酶真菌的特性及产酶条件优化

从四川海螺沟原始森林腐土中分离到一株嗜酸性产纤维素酶的真菌X-13,其主要特点是产纤维素酶的最适pH及其纤维素酶最适反应pH均为2.0.在PDA培养基上培养时菌落呈浅黄色至肉桂色,反面呈黄色至棕褐色,产黄色色素;菌丝体透明有隔膜,分生孢子呈球形或近球形.根据菌株的形态特征以及ITS序列同源性和系统发育分析结果,鉴定该菌株为土曲霉(Aspergillus terreus Thom).该菌最佳产酶培养时间为8～10 d;最适产酶温度为30℃,纤维素酶最适反应温度为50℃;最佳碳源、氮源分别为纤维素粉和硫酸铵.通过响应面法对菌株产纤维素酶条件进行优化,使菌株X-13纤维素酶活从1.39 IU/mL提高到2.94 IU/mL,提高了111.5%.     

一株耐冷菌所产降解酶的特性及应用

从我国寒冷地区筛选到一株能产低温降解酶的菌株.细菌学形态及16S rDNA鉴定表明,该菌株属希瓦氏菌属(Shewanella),最适生长温度为5～15℃,属耐冷菌,并暂命名为Shewanella sp.J5.菌株J5分泌的降解酶中蛋白酶和淀粉酶所表现的活力较高,在0℃下分别仍能保持20%和40%的酶活性,最适温度分别为40℃和30℃,最适pH分别为8.0和7.0～10.0,且对热敏感,属于碱性低温酶;金属离子中Mn2+、Fe2+对蛋白酶有明显的促进作用,而淀粉酶对金属依赖性较小;HPSEC结果表明,低温蛋白酶在水解酪蛋白过程中,对相对分子质量10 000的大分子肽水解能力很强.脱氢酶酶活测定结果表明,低温下菌株活性显著高于常温活性污泥,5℃下,添加菌株J5到活性污泥中可使废水COD去除率提高33%.因此,该菌株在低温污水处理上具有一定的应用前景.     

低温纤维素降解菌的分离与鉴定

对内蒙古部分地区土壤中低温降解纤维素的微生物进行研究,以期获得一些高酶活的低温纤维素酶产生菌.采用纯培养的方法,在10℃下培养获得纯培养物.以细菌16S rDNA通用引物PCR扩增后进行序列同源性比对确定种属.以DNS法测定纤维素酶活性,并对酶活较高的菌株进行产酶条件的优化.结果共分离得到55株可低温降解纤维素的菌株,16S rDNA序列分析表明它们分别属于γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及β-变形菌纲(β-Proteobacteria).该55株菌的纤维素酶活性均在22℃下最高.其中菌株CF11在10℃下的酶活在分离得到的55株细菌中最高.通过优化,菌株CF11产纤维素酶的最佳条件初步确定为pH值为6.5,培养时间为10 d,并且是以酵母提取物作为氮源,其纤维素酶活为58.091 IU.因此菌株CF11是一株极具开发潜力的低温纤维素酶产生菌.     

果胶寡糖生产菌的构建与筛选

生物酶解法是新兴益生元果胶寡糖(Pectin oligosaccharides,POS)生产的主要途径.通过构建黑曲霉来源的多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PGA)基因pga A表达载体p PIC9K-PGA,电转毕赤酵母GS115,筛选能够表达用于制备POS重组果胶酶的工程菌.利用SDS-PAGE检测诱导表达上清,TLC分析其水解产物成分,筛选得到一株特定降解果胶生成寡糖的酵母工程菌GS-12.该重组多聚半乳糖醛酸酶(Recombinant polygalacturonase,re PGA)相对分子量(Mr)为86×10~3,发酵液酶活水平24.8 U/m L;GS-12经30次传代后目的基因pga A仍能稳定遗传,水解产物成分未发生改变;酶促反应得出该酶最适温度50℃,最适p H 5.5,50℃保温5 h相对酶活保持50%以上.综上,所构建酵母工程菌GS-12遗传稳定性高,耐热性提升,作用果胶可得大分子量多糖产物,对POS的工业规模化生产具有重要价值.     

高产脂肪酶菌株的筛选鉴定及酶学、转酯特性

从自然环境中筛选水解酶活高且酶学、转酯特性优良的产脂肪酶菌株,对脂肪酶工业化发酵生产及生物柴油制备的研究具有重要意义.采用罗丹明B平板初筛和摇瓶发酵复筛法,从70份含油脂丰富的样品中筛选产脂肪酶酶活较高的菌株进行16S rRNA鉴定,研究其酶学性质;用大孔树脂固定酶,在无溶剂体系中催化橄榄油制备生物柴油,研究其转酯特性.结果筛选到一株高产脂肪酶的菌株WZ10-3,通过p-NPP法测得其初始酶活为78.68 U/mL,经16S rRNA鉴定属于伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.),与B.stabilis同源性达到99%.该菌在发酵48 h时达到产酶高峰,所产脂肪酶的最适作用温度为50℃,最适作用pH为7.0,70℃下的半衰期可达1 h,pH为7-9时稳定性良好.以大孔树脂NKA-9和HPD600为载体制备的2种固定化脂肪酶,催化橄榄油生产生物柴油的转酯率均可达到97%.综合表明,菌株WZ10-3脂肪酶的初始水解酶活高于大多数野生脂肪酶,热稳定性好且转酯特性优良,有很好的后续研究价值.图7表3参25     

从油田分离的两株嗜热产孢子硫酸盐还原菌系统进化分析

为了寻找极端微生物资源,将来自油田环境的微生物作为研究对象,分离得到两株硫酸盐还原菌.菌株CW02来自于油田联合污水处理站里的地面污水,兼性厌氧,能在pH为2.8的酸性培养基中生长,耐受最高矿化度为30.0g/L,最高生长温度为48℃,可利用苯环化合物为唯一碳源生长.菌株CW03取自于4000多米深原油井的原油分离水中,严格厌氧,不耐酸,能够在68℃的温度下生长,可利用较短碳链的有机化合物.两株菌都是直或弯的杆状,革兰氏阳性,有极生鞭毛,产孢子.通过16SrDNA测序以及在线的Blast系列比对分析:两株菌均属于细菌界(Bacteria),厚壁菌门(Firmicutes),梭菌纲(Clostridia),梭菌目(Clostridiales),蛋白胨链球菌科Peptococcaceae,脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum),与该属中的种Desulfotomaculumnigrificans和Desulfotomaculumaeronauticumd相似性达到98%.但是通过多重序列比对构建进化树的方法分析发现,菌株CW03属于古细菌界,与古细菌界的古生球菌属进化距离较近.图5表2参32     

一株产木聚糖酶的耐冷皮壳正青霉菌鉴定与酶谱分析

从青海冻土中分离得到1株产木聚糖酶的青霉菌QH11,通过菌落特征观察、显微特征观察和18S rDNA同源性序列分析,鉴定该菌为皮壳正青霉,其最适生长温度为20℃.该菌以玉米芯水不溶木聚糖为碳源,于20℃摇瓶培养,d 4木聚糖酶达到高峰,酶活为28.13 U/mL,比酶活为9.73 U/mg,粗酶液的最适温度为47.5℃.SDS-PAGE和酶谱分析表明,该菌可产生3种木聚糖酶,其亚基相埘分子质量(Mr)分别为20.5×103、23.0×103和35.0×103.图6参15     

一株产木聚糖酶嗜热真菌樟绒枝霉的鉴定及其产纤维质降解酶系分析

对分离得到的一株产耐热木聚糖酶的真菌CAU521进行鉴定,并对其产纤维质降解酶系进行研究.通过菌落形态、显微镜产孢结构以及18S rDNA序列同源性比对等分析,鉴定该菌为樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea),其最适生长温度为45℃,为一株嗜热真菌.该菌能以农业废弃物玉米芯为碳源液体发酵产耐热木聚糖酶,50℃下培养7 d,木聚糖酶的最高酶活力达到173 U/mL.SDS-PAGE和酶谱分析表明该菌株能同时分泌多种纤维质降解酶:4种木聚糖酶、2种纤维素酶、3种葡聚糖酶和1种甘露聚糖酶.结果表明樟绒枝霉CAU521在降解和利用纤维质材料方面具有潜在的应用价值.     

产碱性果胶酶的枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备与再生条件

原生质体融合技术是一种重要的微生物育种方法.以能产碱性果胶酶的枯草芽孢杆菌ZGL14为出发菌株,探讨影响其原生质体制备和再生的主要因素.通过研究菌龄、溶菌酶浓度、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂的p H值、再生培养基类型和培养方式等对枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备与再生的影响,确定其最优化条件.结果显示:枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备的最优条件为菌龄9 h,溶菌酶浓度0.2 mg/m L,酶解时间10 min,酶解温度32℃,渗透压稳定剂的p H值7.0.在此条件下,枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体的形成率为98%,再生率达30%.枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体再生培养基以琥珀酸钠作为渗透压稳定剂并结合Ca~(2+)再生效果较好,再生方式以单层培养较好.本研究获得了枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备和再生的最佳条件,可为实现其融合育种提供技术支持.