树状多节孢原生质体的制备和再生

研究了酶系组成、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂、PH值，培养基成分、培养方式，预处理、保护剂等因素对紫杉醇产生菌树状多孔孢原生质体制备和再生的影响。结果表明：将树状多节孢在PDA液体培养其中静止培养2－3d，离心收集菌体，用PH5．5－6．0的0．7mol/L的NaCl配制成的含有3％纤维素酶、2％蜗牛酶和1％溶菌酶的复合酶，30℃恒温酶解9h，原生质体制备率最高。但是考虑到原生质体的再生，参酶解7h左右为宜，获得的原生质体经过纯化，用0.7mol/LNaCl配制的PDA再生培养基进行双层平板培养法再生，原生质体的再生率最高。本研究为以后通过原生质体诱变、转化、融合构建紫杉醇工程菌株奠定了基础，图3表9参16     

红豆杉内生真菌发酵培养基和原生质体制备酶系统的筛选

在对红豆杉内生真菌(Ozoniumsp.)适生碳源、氮源和生长情况研究的基础上,通过正交试验筛选了其发酵培养基和原生质体制备的酶系统;用L9(34)安排了四因素三水平并考虑交互作用的正交试验,对实验结果进行了分析.结果表明,最优的发酵培养基为果糖1%、蔗糖1%、蛋白胨0.2%、酵母粉0.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O0.3%、VB10.001%;分离原生质体的最优酶系统为1.5%溶壁酶 0.5%蜗牛酶 1.5%纤维素酶 1.0%溶菌酶;用此酶系统在30℃条件下酶解3h,原生质体的产量达6.55×107个/mL酶液;经荧光素二醋酸酯(FDA)染色评估原生质体活力,表明该条件下分离的原生质体活力较高,原生质体的再生率为2.56%.该研究为利用生物技术手段改良紫杉醇生产菌奠定了基础.图6表4参32     

利用原生质体诱变技术筛选脱落酸高产菌株

以葡萄孢属TB-3菌株为出发菌株制备其原生质体．在纤维素酶浓度为20g／L,蜗牛酶浓度为3g／L的酶解系统中,25℃酶解3h,其原生质体制备数可达67×105mL-1,在KYM上的再生率为46．1％,在KPDA上的再生率为33．6％,经过3轮原生质体紫外线诱变后回复再生,及对大量再生突变株进行发酵筛选,获得高产稳定株TB－3H8,其发酵液中ABA的质量浓度可达1．4g／L     

平菇原生质体的高效制备及再生优化条件

以杂优1号平菇为出发菌株,对其原生质体制备、再生的各关键因子及条件进行比较研究,结果表明,其原生质体制备的优化条件为:以0.6 mol/L MgSO4为稳渗剂配制浓度为15 mg/mL新鲜溶壁酶液,菌丝与酶液比w/V=1mg:8μL,取培养6 d的菌丝200 mg,自然pH下28℃小平板酶解6 h,原生质体得率可达2.80×107个/mL.原生质体再生实验结果表明,50 U/mL链霉素能有效控制平菇原生质体再生的杂菌污染.孟加拉红对平菇原生质体再生具强抑制作用,抑制率达93%.进一步研究证实,0.6 mol/L的MsSO4、KCI等无机盐稳渗剂对原生质体制备的得率较高,而0.6 mol/L的蔗糖作为稳渗剂的平菇原生质体再生率较高.图4表3参23     

利用枯草芽孢杆菌株间原生质体融合进行差异表型遗传重组分析的研究

枯草芽孢杆菌D100和枯草芽孢菌TN179同为枯草芽孢杆菌Ki－2－132的两个不同菌株，具有明显的表型差异．它们的融合子D279兼有两亲本的遗传性状，能够在常规培养条件下稳定遗传．但经过EMS处理后，即产生形状与各自亲本相似，且伴随菌落颜色、菌体形状和一些生理变化的分离物．从这些分离物的表型改变，得出了基因及连锁的一些遗传值息．     

一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1是课题组前期通过基因工程改造得到的一株核黄素高产菌,为了进一步提高核黄素的产量,需要对该菌株进行进一步的基因工程改造.本研究首先将编码的链丝菌素乙酰基转移酶基因sat克隆到p MA5质粒上,构建具有诺瓦丝菌素Norseothricin(NTC)抗性的重组质粒p MA5-sat,实验证实该重组质粒能够用于B.subtilis RF1的抗性筛选.随后将核黄素合成相关的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf克隆到重组质粒p MA5-sat上,获得重组质粒p MA5-sat-zwf,并成功构建重组菌B.subtilis RF1/p MA5-sat-zwf.结果显示,重组菌胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力比原始菌提高了近50倍,说明葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在重组菌中成功过量表达;根据发酵特性分析,重组菌B.subtilis RF1/p MA5-sat-zwf最终核黄素产量达到12.01 g/L,比原始菌B.subtilis RF1提高了30.3%.综上,本研究构建的新型抗性质粒能够成功运用于核黄素生产菌枯草芽孢杆菌的基因工程改造.     

高产木聚糖酶细菌的筛选、鉴定及其部分酶学特性

细菌木聚糖酶具有优良的酶学特性,发掘和研究高产菌株资源对促进木聚糖酶工业生产具有十分重要的意义.采用刚果红透明圈法从采集的土样样品中筛选分离得到1株高产细菌木聚糖酶的菌株SD4-4,通过形态特征及16S r DNA序列分析进行鉴定,并以本实验室保存的细菌木聚糖酶工业生产用菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SL作为对照,对比研究SD4-4的产酶水平及酶学性质.结果表明,SD4-4为短小芽孢杆菌(B.pumilus),利用小麦麸皮摇瓶发酵,其上清酶活可达1 166.0 U/m L,而SL上清酶活为281.0 U/m L.SD4-4所产木聚糖酶作用最适温度约为50℃,最适p H约为5.0.粗酶液在30-50℃的环境下处理10 min,相对酶活均保持在90%以上;在p H 4.0的条件下处理30 min,相对酶活仍有76%,酸性环境下稳定性较好.因此,菌株SD4-4产酶水平高于对照菌株SL,酶学特性更为优良,工业应用前景良好,尤其在饲料添加剂行业具有较大的开发潜力.     

基于饲料酵母二次发酵啤酒糟条件响应面优化研究

为提高发酵啤酒糟高蛋白产量,以一次发酵的黑曲霉和木霉双菌发酵的啤酒糟为原料,粗蛋白含量为指标,对饲料酵母和枯草芽孢杆菌进行二次混菌发酵,其对应的最佳条件为温度33.73℃,接种量16.51%,酵母菌和枯草芽孢杆菌接种量比为5∶1,添加硫酸铵5.00%,尿素添加量2.00%,发酵时间4 d,理论粗蛋白质含量43.38%.表明通过二次混菌发酵能显著提高啤酒糟粗蛋白含量.     

枯草芽孢杆菌H110对苹果梨采后青霉病和黑斑病的抑制效果

将具有广谱拮抗作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H110作为生防菌株,研究了该菌的培养液、滤液、菌悬液及蛋白粗提液对苹果梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)青霉病(Penicillium expansum Link)和黑斑病(Alternaria alternate)的抑制效果.H110的蛋白粗提液的抑制作用最好,青霉病和黑斑病的发病率分别比对照低92.7%和86.6%,病斑直径也显著小于对照;其次为菌培养液和菌悬液,滤液的抑制效果相对较差,但4种处理均显著好于对照.4种处理对病原菌孢子萌发的抑制效果与in vivo试验的效果一致.实验结果表明,枯草芽孢杆菌通过产生抗菌蛋白和竞争作用抑制病原菌生长.图1表2参17     

耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

高温α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现高温α-淀粉酶基因的高效表达,本研究比较了不同启动子对地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的影响.分别用强启动子P43和地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子构建了表达载体pP43NMK-amy和pUBCl9-amy,并在枯草芽孢杆菌BacillussubtilislA752S中进行表达.结果表明,与地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基闪自身启动子相比,采用P43启动子的耐高温α-淀粉酶其表达水平提高了8.9倍.而且在枯草芽孢杆菌B.subtilislA752S中分泌表达的α-淀粉酶仍具有耐高温的特性,酶反应的最适温度为90℃,表明酶的热稳定性南蛋白质本身的氨基酸序列决定的.     

黄酮醇类化合物的合成与抗菌活性

以邻羟基苯乙酮和苯甲醛为原料,采用Algar-Flynn-Oyamada(AFO)反应,通过一锅法和分步法合成化合物;进一步用牛津杯法以甲氧西林为细菌阳性试验对照、DMSO为阴性对照,检测合成化合物对枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、黑曲霉菌的抑菌能力.共合成20种黄酮醇类化合物,其中包括1个新化合物;合成化合物对酿酒酵母菌和黑曲霉菌并无明显抑制效果(d9 mm),而对枯草芽孢杆菌具有不同程度的抑制作用,其中含卤素取代的黄酮醇对枯草芽孢杆菌具有显著的抑制作用(d15 mm).构效关系研究表明,黄酮醇类化合物能有效对枯草芽孢杆菌形成抑制作用,且黄酮醇骨架上含有卤素取代(化合物7、8、17、19、20)表现出较好的抑菌作用;5-甲氧基取代黄酮醇(11、12、13、14)类化合物尽管不是活性最好的,但与相应的5位无取代的黄酮醇比较,如12 vs 2、13 vs 3、14 vs 1,活性有所提高.本研究获得了一些具有较好抗菌活性的黄酮醇化合物,可为药物发现和合成提供结构依据.     

降解菌djl-6多菌灵水解酶的提取及性质

以往对多菌灵降解菌Rhodococcus qingshengii sp.nov.djl-6的降解途径研究显示,该菌株首先通过多菌灵水解酶将多菌灵水解成二氨基苯并咪唑,从而对多菌灵进行脱毒.为开发酶制剂并有效应用于环境中残留污染物多菌灵的降解,比较了不同提取方法(高压细胞破碎、超声波破碎和添加溶菌酶破碎)对多菌灵水解酶提取效率的影响,并对其酶学特性进行了初步研究.结果表明,djl-6菌株在LB培养基中培养72~84 h,生长量和产酶量均达到最大值.采用超声波破碎提取酶的效率较高(蛋白浓度为7.92 mg/mL),但酶活损失较大(比酶活只有1.2 U/μg protein).多菌灵水解酶属于一种胞内组成型酶.该酶水解多菌灵的最适pH值为7.0,最适温度为30℃,Zn2+和K+对酶活有一定的抑制作用.     

一株多菌灵降解菌NY97-1的分子鉴定及GFP标记

用PCR方法扩增的多菌灵降解菌NY97-1的16SrDNA片段经TA克隆后,进行序列测定和BLAST同源序列比较分析,确定了其分类地位为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus,B.p).经BamHⅠ酶切的启动子探针载体pUC19-gfp与NY97-1基因组DNA的Sau3AⅠ酶切片段酶连,酶连产物转化E.coliDH5a,建立B.p的启动子基因文库.挑选其中的两个强阳性克隆,亚克隆来自短小芽孢杆菌总基因组的启动子活性片段F4、F5,构建大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pNW33N-F4-gfp、pNW33N-F5-gfp.通过电转化得到gfp在B.p中的两株标记菌株.在荧光显微镜下,观察到了明亮的绿色荧光,证明活性片段F4、F5均具有组成型启动子的功能,实现了gfp基因在B.p中组成型表达,且遗传稳定,为今后研究多菌灵降解菌B.p在自然环境中的定殖、分布及动态变化打下了基础.图3表2参20     

吸水链霉菌井冈变种JG5008转化系统的初建

吸水链霉菌井冈变种ＪＧ５００８的最佳转化条件是：ＪＧ５００８在添加ＭｇＣｌ２（ｃｆ＝０．００５ｍｏｌ／Ｌ）和甘氨酸（ρｆ＝０．５ｇ／Ｌ）的含１０％蔗糖的ＹＥＭＥ培养基中接种浓度ｎ≈１０＾８ｍＬ＾－１的ＪＧ５００８孢子悬液，３７℃摇床培养１２ｈ，收获菌丝体。在３２℃、溶菌酶浓度ρ＝２ｍｇ／ｍＬ的条件下溶菌１ｈ后制备原生质体，用Ｔ缓冲液在Ｒ２ＹＥ培养基上进行转化。本文初步建立了ＪＧ５００８的质粒载体系     

绿色荧光蛋白基因标记内生枯草芽孢杆菌

用枯草芽孢杆菌168菌株rpsD基因的启动子替换质粒pGFP4412中蜡状芽孢杆菌4412启动子,从而构建了能在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白基因gfpmut3a的载体pS4GFP,将其导入具有内生、防病、促生作用的野生型枯草芽孢杆菌BS-2菌株中,筛选获得遗传稳定性好且具有良好发光表型的标记菌株BS-2-gfp.该标记菌株在小白菜体内的定殖研究结果表明,该菌株能够在小白菜根际及根、茎、叶内定殖和传导,接菌50d后仍能在其体内分离到标记菌株.图5参17     

蓝藻发酵生产微生物农药的影响因素研究

采用摇瓶发酵试验探讨了蓝藻为原料制备苏云金杆菌生物杀虫剂的可行性,并考察了不同培养条件（蓝藻含固率、种龄、接种量、初始pH、摇床转速、发酵温度）对苏云金杆菌生长增殖、产孢与产毒效果的影响。研究结果表明,无需任何预处理工序,Btk 130菌株能在蓝藻为唯一原料的培养基中正常生长发育,并且产孢产毒。发酵48 h后,芽孢产率达到86.7%,远高于常规培养基;生物毒效为282 IU.mL-1,与常规培养基相当。培养条件优化结果表明,在蓝藻含固率为2%、初始pH为7.0、接种物种龄为9 h、接种量为2%、培养温度为30℃、摇瓶转速为200 r.min-1的条件下培养48 h,Btk 130可达到较好的发酵效果,活菌数及抗热芽孢数可达7.32 CFU.mL-1和6.38 CFU.mL-1,生物毒效为528 IU.mL-1。该研究不仅为蓝藻提供了高附加值的处置新途径,而且可显著降低生物杀虫剂的生产成本,具有广阔的应用前景。     

常温氢氧化钠预处理芦苇酶解发酵产油

在室温(28℃)下对氢氧化钠预处理芦苇(Phragmites australis)条件进行单因素和响应面设计优化,对酶解的条件进行单因素优化,对酶解液成分进行HPLC分析,利用未经任何脱毒处理的酶解液发酵产油并与配制培养基对比,通过GC-MS对油脂脂肪酸组成进行分析.结果表明:最佳预处理条件为氢氧化钠质量分数3.4%,预处理时间16h,液固比20:1 m L/g,在初始酶解条件下酶解得到酶解液还原糖浓度为26.32 g/L;最佳酶解的条件为p H=4.5,温度45℃,液固比10:1 m L/g,酶解时间48 h,纤维素酶和纤维二糖酶酶液添加量均为30μL/g,得到酶解液还原糖浓度为40.01g/L;经HPLC分析,酶解液中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖比例分别为70.27%、19.83%、5.08%和4.82%;通过隐球酵母(Cryptococcus podzolicus)ZWY-2-3发酵产油,其生物量、油脂产量和油脂含量在4 d时达到最大,分别为8.63 g/L、2.56 g/L和29.68%,其与同等糖浓度的对照组配制作培养基相当.本研究表明,芦苇是生产微生物油脂的潜在生物质原料,具有广阔的应用前景.     

嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶基因perA在大肠杆菌中的高效表达

利用PCR技术得到嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillusstearothermophilus)过氧化氢酶基因 perA ,将该基因与表达载体 pKK2 2 3 3连接构建重组质粒pK perA ,转化大肠杆菌过氧化氢酶HPⅠ和HPⅡ双缺突变株UM 2 ,得到重组大肠杆菌UM 2 1.酶活测定结果表明 ,表达产物具有正常的生物学活性 .SDS PAGE电泳结果显示出明显的特异性表达条带 ,单体Mr =86× 10 3 ,与嗜热脂肪芽孢杆菌所产酶相同 .实验表明 ,重组质粒在宿主UM 2中有较好的稳定性 ,在无选择压力条件下传代 6 0次基本保持稳定 ,传代 10 0次重组质粒保留 80 %以上 .摇瓶实验确定重组菌的最佳表达条件为 :IPTG浓度 ,0 .75mmol/L ;诱导时间 3h ;培养基起始 pH 6 .5 ;诱导温度 37℃ ;装液量 5 0mL/ 2 5 0mL .在优化条件下 ,重组菌产生的过氧化氢酶占菌体总蛋白的 8% ,酶活力可达 35U/mL ,是原始菌株BacillusstearothermophilusIAM110 0 1的 11.7倍 .图 2表 1参 10     

气相色谱及气相色谱-质谱联用研究窖泥微生物

通过传统分离方法从浓香型白酒窖泥中筛选出5株芽孢杆菌,经气相色谱结合MIDI-Sherlock系统分析,分别为地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、泛酸枝芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌.采用固相萃取技术结合GC-MS技术分析其发酵产物,发现5株菌产风味物质能力都较强且种类丰富,主要有醇类、酮类等化合物,其中3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)含量较高,而其代谢产物中的醇类、酮类及愈创木酚等物质对白酒风味的形成起着助香的作用.     

原生质体转化构建有机磷农药降解工程菌

降解有机磷农药甲胺磷、敌敌畏和对硫磷的菌株地衣芽孢杆菌 Ｐ１２（ Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ） 经溶菌酶处理获得原生质体,加入降解乐果的供体菌 Ｇ１ Ｄ Ｎ Ａ,经ρ（ Ｐ Ｅ Ｇ６ ０００） ＝ ３００ ｇ Ｌ－ １ 诱导,在液体再生培养基中振荡培养ｔ＝ ２０ ｈ ,使其恢复细胞壁后,离心收集菌体,涂布于含乐果的基础培养基上,经筛选得一转化子 Ｊ Ｐ Ｚ．其菌落形态明显不同于出发菌株,乐果平板连续传代１０ 次,性状保持稳定．在θ＝ ３０ ℃,１００ ｒ／ｍｉｎ 的培养条件下,３ ｄ 内对ρ（ 甲胺磷） ＝ ０ ．５ ｇ Ｌ－ １ ,ρ（ 敌敌畏） ＝ ０ ．２ ｇ Ｌ－ １ ,ρ（ 对硫磷） ＝ ０ ．１ ｇ Ｌ－ １ ,ρ（ 乐果） ＝ ０ ．３ ｇ Ｌ－ １ 的降解率分别为 Ｒｄ ＝ ７９ ．１ ％ ,４６ ．７ ％ ,２９ ．４ ％ 和４６ ．４ ％ ．