气相色谱及气相色谱-质谱联用研究窖泥微生物

通过传统分离方法从浓香型白酒窖泥中筛选出5株芽孢杆菌,经气相色谱结合MIDI-Sherlock系统分析,分别为地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、泛酸枝芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌.采用固相萃取技术结合GC-MS技术分析其发酵产物,发现5株菌产风味物质能力都较强且种类丰富,主要有醇类、酮类等化合物,其中3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)含量较高,而其代谢产物中的醇类、酮类及愈创木酚等物质对白酒风味的形成起着助香的作用.     

产碱性果胶酶的枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备与再生条件

原生质体融合技术是一种重要的微生物育种方法.以能产碱性果胶酶的枯草芽孢杆菌ZGL14为出发菌株,探讨影响其原生质体制备和再生的主要因素.通过研究菌龄、溶菌酶浓度、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂的p H值、再生培养基类型和培养方式等对枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备与再生的影响,确定其最优化条件.结果显示:枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备的最优条件为菌龄9 h,溶菌酶浓度0.2 mg/m L,酶解时间10 min,酶解温度32℃,渗透压稳定剂的p H值7.0.在此条件下,枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体的形成率为98%,再生率达30%.枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体再生培养基以琥珀酸钠作为渗透压稳定剂并结合Ca~(2+)再生效果较好,再生方式以单层培养较好.本研究获得了枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备和再生的最佳条件,可为实现其融合育种提供技术支持.     

枯草芽孢杆菌H110对苹果梨采后青霉病和黑斑病的抑制效果

将具有广谱拮抗作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H110作为生防菌株,研究了该菌的培养液、滤液、菌悬液及蛋白粗提液对苹果梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)青霉病(Penicillium expansum Link)和黑斑病(Alternaria alternate)的抑制效果.H110的蛋白粗提液的抑制作用最好,青霉病和黑斑病的发病率分别比对照低92.7%和86.6%,病斑直径也显著小于对照;其次为菌培养液和菌悬液,滤液的抑制效果相对较差,但4种处理均显著好于对照.4种处理对病原菌孢子萌发的抑制效果与in vivo试验的效果一致.实验结果表明,枯草芽孢杆菌通过产生抗菌蛋白和竞争作用抑制病原菌生长.图1表2参17     

喹诺酮类与磺胺类药物对枯草芽孢杆菌与大肠杆菌的联合毒性及其机制初探

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)与大肠杆菌(Escherichia coli K12 MG-1655)为实验材料,以3种喹诺酮类药物及典型磺胺类药物为研究对象,分别测定了喹诺酮类药物与磺胺类药物对枯草芽孢杆菌与大肠杆菌的单一毒性及两类药物的联合效应,并对其毒性机制进行初步探讨.研究结果表示,磺胺类药物与喹诺酮类药物对枯草芽孢杆菌的毒性比对大肠杆菌的毒性小,可能是因为枯草芽孢杆菌的细胞壁较厚且富含肽聚糖,导致磺胺类药物与喹诺酮类药物较难进入枯草芽孢杆菌,毒性较低;同时大部分磺胺类药物与枯草芽孢杆菌的靶蛋白的结合能力低于其与大肠杆菌的靶蛋白的结合能力也是磺胺类药物对枯草芽孢杆菌的毒性比对大肠杆菌的毒性小的另一原因.喹诺酮类药物与磺胺类药物对枯草芽孢杆菌的联合效应表现为拮抗,而对大肠杆菌的联合效应则表现为相加.这两类药物有不同的联合效应,可能是由于枯草芽孢杆菌能够在磺胺类药物的作用下产生芽孢这一抗逆性构造,减弱喹诺酮类药物的杀菌作用.     

华重楼内生菌Iun35的分离及其抗菌蛋白的性质

从华重楼(Paris polyphylla Smith var.chinensis)块茎中分离纯化得到一株具有较强抑菌活性的内生细菌Iun35,经形态特征、生理生化特性及16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).将分离得到的Iun35菌株发酵培养,培养液上清经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-75凝胶柱层析和DEAE-32纤维素柱层析分离纯化出一种抗菌蛋白UD35.用该蛋白对多种植物病原菌进行拮抗测定,结果显示,UD35对玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani Kuha)、小麦赤霉病菌[Gibberelle zeae(Schw.)]等多种菌有强烈抑制作用.测定其相对分子质量约为55 000,氨基酸分析结果表明其由17种氨基酸组成.图3表4参16     

绿色荧光蛋白基因标记内生枯草芽孢杆菌

用枯草芽孢杆菌168菌株rpsD基因的启动子替换质粒pGFP4412中蜡状芽孢杆菌4412启动子,从而构建了能在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白基因gfpmut3a的载体pS4GFP,将其导入具有内生、防病、促生作用的野生型枯草芽孢杆菌BS-2菌株中,筛选获得遗传稳定性好且具有良好发光表型的标记菌株BS-2-gfp.该标记菌株在小白菜体内的定殖研究结果表明,该菌株能够在小白菜根际及根、茎、叶内定殖和传导,接菌50d后仍能在其体内分离到标记菌株.图5参17     

基于饲料酵母二次发酵啤酒糟条件响应面优化研究

为提高发酵啤酒糟高蛋白产量,以一次发酵的黑曲霉和木霉双菌发酵的啤酒糟为原料,粗蛋白含量为指标,对饲料酵母和枯草芽孢杆菌进行二次混菌发酵,其对应的最佳条件为温度33.73℃,接种量16.51%,酵母菌和枯草芽孢杆菌接种量比为5∶1,添加硫酸铵5.00%,尿素添加量2.00%,发酵时间4 d,理论粗蛋白质含量43.38%.表明通过二次混菌发酵能显著提高啤酒糟粗蛋白含量.     

4种浮萍提取物的抗菌活性和黄酮含量

浮萍(Lemnaceae)生长在微生物丰富的污水表面,为了研究浮萍抗菌机制,为浮萍抗菌物质活性筛选以及动植物病原菌和人类致病微生物感染机制研究提供依据,用不同极性的溶剂对浮萍进行提取,牛津杯法(Oxford Cup)及最小抑菌浓度(MIC)测定比较绿萍zh0018、少根紫萍zh0224以及多根紫萍zh0003、zh0225四种浮萍提取物的体外抗菌活性,并用分光光度法结合高效液相色谱(HPLC)测定分析提取物总黄酮含量以及成分差异.结果表明:浮萍甲醇提取物、95%乙醇提取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、农杆菌均有不同程度的抗菌活性,其中多根紫萍zh0225甲醇提取物抗菌活性最强(MIC:6.25 mg/mL),其次为绿萍;各萃取物中乙酸乙酯相活性最强(MIC:0.78 mg/mL),其次为正丁醇相.分光光度法测得绿萍甲醇提取物总黄酮含量较高,为提取物的9.8%,其次为少根紫萍甲醇提取物,为8.1%,其中多根紫萍zh0225乙酸乙酯相含量最高,为萃取物的22.46%,其次为正丁醇相,为17.2%.HPLC测得不同浮萍提取物黄酮成分差异较大,两株多根紫萍成分相似而含量不同.研究表明,结合浮萍自身的特性和提取物抗菌活性的大小及黄酮含量,筛选多根紫萍zh0225乙酸乙酯萃取相作为优良浮萍品种提取活性物质以及开展药物生产具有巨大潜力.     

粘细菌的活性检测及与环境因子的相关性

为筛选具有抗菌活性的粘细菌,利用兔粪诱导、大肠杆菌划线诱导和滤纸诱导3种方法从内蒙古凉城地区采集的20种土样中分离粘细菌,结合形态观察、生理生化特征和分子鉴定方法确定这些菌株的分类地位,通过平板对峙法分析抗菌活性,并采用统计学方法分析其与环境因子的相关性.共分离得到140株菌,包括39株纯粘细菌,经鉴定分别为黄色粘球菌(17株)、橙色粘球菌(13株)、变绿粘球菌(5株),还有4株只鉴定到粘球菌属(Myxococcus sp.).抗菌结果显示:39株纯菌均表现出可以对一种甚至多种指示菌产生抗性,其中37株抑制大肠杆菌的生长,35株抑制马铃薯晚疫病菌的生长,26株抑制金黄色葡萄球菌的生长,20株抑制酿酒酵母菌的生长,19株抑制枯草芽孢杆菌的生长.在分析环境因子与粘细菌分布情况的关系时发现,分离出的溶细菌类群的菌株数、溶纤维素类群的菌株数及总的菌株数与土壤p H和速效钾的含量呈正相关,与含水量呈负相关,与其它参数无明显相关性.综上,内蒙古凉城地区粘细菌的优势菌群为粘球菌属,且绝大多数都有不同程度的抗菌活性;结果可为丰富内蒙古地区粘细菌资源及抗马铃薯晚疫病农药研发奠定基础.     

细丽毛壳霉次级代谢产物的分离鉴定及其抗菌活性（英文）

活性筛选显示细丽毛壳霉(Chaetomium gracile)的大米固态发酵乙酸乙酯提取物具有显著的抗菌活性,为阐明其抗菌活性物质基础,利用各种色谱分离技术以及综合运用化学分析和波谱分析进行分离鉴定.从中分离获得9个化合物,分别将其鉴定为麦角甾醇(1)、(22E,24R)-麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇(2)、棕榈酸单甘油酯(3)、eugenitol(4)、对羟基苯甲醛(5)、chaetochromin A(6)、3-吲哚甲酸(7)、腺苷(8)和chetoquadrin F(9).其中化合物6为主要次级代谢产物,该化合物在浓度为0.95μg/m L时对大肠杆菌、金色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌具有显著抗菌活性.研究表明chaetochromin A是细丽毛壳霉的抗菌活性物质基础.     

一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1是课题组前期通过基因工程改造得到的一株核黄素高产菌,为了进一步提高核黄素的产量,需要对该菌株进行进一步的基因工程改造.本研究首先将编码的链丝菌素乙酰基转移酶基因sat克隆到p MA5质粒上,构建具有诺瓦丝菌素Norseothricin(NTC)抗性的重组质粒p MA5-sat,实验证实该重组质粒能够用于B.subtilis RF1的抗性筛选.随后将核黄素合成相关的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf克隆到重组质粒p MA5-sat上,获得重组质粒p MA5-sat-zwf,并成功构建重组菌B.subtilis RF1/p MA5-sat-zwf.结果显示,重组菌胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力比原始菌提高了近50倍,说明葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在重组菌中成功过量表达;根据发酵特性分析,重组菌B.subtilis RF1/p MA5-sat-zwf最终核黄素产量达到12.01 g/L,比原始菌B.subtilis RF1提高了30.3%.综上,本研究构建的新型抗性质粒能够成功运用于核黄素生产菌枯草芽孢杆菌的基因工程改造.     

利用味精废水培养枯草芽孢杆菌产γ-聚谷氨酸及初步表征

味精废水是一种高浓度有机废水,具有酸性强、高COD、高BOD、高硫酸根、高菌体含量和低温等特点,其中含有大量的L-谷氨酸、还原糖与氨氮,如果任其排放不仅浪费了宝贵资源,而且会造成严重的环境污染。实验利用味精废水作为培养基,培养枯草芽孢杆菌168得到产物γ-聚谷氨酸,对于探索味精废水的资源化利用途径和降低微生物法合成γ-聚谷氨酸的生产成本具有积极意义。单因素实验研究了培养条件对枯草芽孢杆菌168生长和γ-聚谷氨酸产量的影响,结果表明,味精废水浓度、初始pH、接种量和培养时间对枯草芽孢杆菌168生长和γ-PGA产量具有重要的影响。通过Box-Behnken响应面法进一步优化了枯草芽孢杆菌168的培养条件,优化后的培养条件为:味精废水稀释倍数3.88,培养初始pH 5.84,50 mL味精废水接种量10.55 mL,在37℃、180 r·min~(-1)条件下培养48 h,γ-聚谷氨酸的产量达到(53.51±0.92) g?L~(-1)。茚三酮比色法确定粗产品中γ-聚谷氨酸含量为78.24%(质量分数)。紫外扫描光谱分析显示检测样品中氨基和羧基的特点符合γ-PGA标准图谱特征,γ-聚谷氨酸的聚合键与蛋白质的肽键结构有明显区别,γ-聚谷氨酸是由γ-酰胺键聚合而成。傅立叶红外光谱和核磁共振分析显示,样品中含有酰胺基、羧基、羰基-CH、-CH_2等基团。对紫外光谱、红外光谱和核磁共振结果进行综合分析,可以初步确定样品中存在酰胺键连接的多聚体结构,即γ-聚谷氨酸的结构。研究结果显示,利用味精废水培养枯草芽孢杆菌168得到产物γ-聚谷氨酸在技术上是可行的,为味精废水资源化利用探索出一条可能的途径,且具有降低微生物法合成γ-聚谷氨酸成本的潜力。     

变绿毛壳霉CIB608次级代谢产物及抗菌活性

抗菌活性筛选表明变绿毛壳霉(Chaetomium virescens CIB608)大米固态发酵乙酸乙酯提取物具有显著的抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)活性.为阐明抗菌活性物质基础,利用硅胶柱层析、反相C-18硅胶柱层析、高效液相色谱等分离技术以及核磁共振、质谱及液质联谱波谱分析手段对该菌的化学成分进行分离、分析和鉴定,并采用管碟法对部分化合物的抗菌活性进行评价.结果显示,变绿毛壳霉次级代谢产物种类丰富,共分离鉴定14个化合物,分别为7-methoxy-eugenitol(1)、eugenitol(2)、2,4-二羟基-3,6-二甲基-苯甲酸(3)、甲氧基柄曲霉素(4)、柄曲霉素(5)、二氢柄曲霉素(6)、奥佛尼红素(7)、nidurufin(8)、腺苷(9)、2′-甲氧基腺苷(10)、对羟基苯甲酸(11)、毛壳霉素(12)、毛壳霉素B(13)和毛壳霉素C(14).化合物12具有显著的抗菌活性,在浓度1.0μg/mL时对金黄色葡萄球菌仍具有显著抗菌活性.化合物13和14中的含有3个硫的硫桥键不稳定,分离纯化过程中会逐步脱掉1个硫,进而转化为化合物12.本研究表明变绿毛壳霉次级代谢产物种类丰富,化合物1为新的色原酮天然产物,化合物12为该菌的抗金黄色葡萄球菌物质基础;变绿毛壳霉CIB608可作为毛壳霉素类活性物质的重要来源.(图5表2参30)     

两株芽孢杆菌降解羽毛比较及抗氧化肽分离

枯草芽孢杆菌UMU4和短小芽孢杆菌SCU11是四川省分子生物学及生物技术重点实验室分离的野生菌株经诱变获得的胞外蛋白酶高产菌株,其分泌的蛋白酶在蛋白废弃物处理方面具有良好的应用前景.为了从这两株芽孢杆菌中筛选出高效利用羽毛的最优菌株,将UMU4和SCU11分别接种到羽毛培养基中并持续发酵6 d,通过每天测试羽毛降解率、可溶性多肽含量、氨基酸含量、蛋白酶活及抗氧化活性等指标来评价这两株菌对羽毛的降解能力.结果发现SCU11能更高效地利用羽毛,其羽毛降解率是UMU4的1.2倍,第5天时约有65%的羽毛转化为可溶性肽和氨基酸;SCU11发酵液的ABTS自由基清除率和还原力均在第3天达到最大值,且显著高于UMU4羽毛发酵液的抗氧化活性;SCU11在第5天所产角蛋白酶和碱性蛋白酶的活性分别是UMU4的1.6和1.2倍.在此基础上,将来自于SCU11的羽毛降解产物经HCl沉淀和疏水层析获得了4个抗氧化肽组分,其中组分F3的抗氧化活性最高.本研究表明芽孢杆菌SCU11较之UMU4具有更高的产酶活性及更强的羽毛降解能力,结果可为家禽羽毛的资源化应用奠定基础.     

微生物对土壤和沉积物吸附多环芳烃动力学的影响

以枯草芽孢杆菌为接种微生物,研究微生物对沉积物和湿地土壤吸附菲和苯并[a]芘(BaP)吸附动力学的影响.结果表明:枯草芽孢杆菌对菲与BaP都可进行生物降解,对菲的利用率明显要大于BaP;接种微生物的土壤与沉积物对菲和BaP的吸附动力曲线与仅有微生物吸附的结果相近似,表明多环芳烃的降低主要是由于微生物的利用造成的;接种微生物后沉积物与土壤对菲的吸附量明显增大,而对BaP的吸附却降低.     

动水条件下沉积物-水界面微生物与铬的相互作用机理

通过沉积物-水相互作用的室内水槽模拟实验,在上覆水Cr(Ⅵ)不断更新条件下,分析了沉积物中Cr(Ⅵ)的吸附还原能力和微生物的生长特征,探讨了微生物作用下沉积物-水界面重金属铬的迁移转化机理。结果表明,在上覆水Cr(Ⅵ)浓度不断增加条件下,沉积物微生物菌落经历了初步适应期、快速增长期、竞争生长期和稳定期4个阶段。在高铬(Cr(Ⅵ)0.1mg·L~(-1))条件下,沉积物表层微生物群落主要是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus annularis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilison)。在微生物作用下,Cr(Ⅵ)还原率稳定于47.56%左右;由于微生物作用,沉积物对铬的吸附率明显升高,可达53.63%。微生物蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌释放的还原性酶和还原性离子将沉积物-水界面的六价铬不断还原为三价铬,在弱碱性环境中形成Cr(OH)_3沉淀和络合沉淀,增大了表层沉积物中铬的含量,降低了水环境中铬的含量。研究成果对河流铬污染自净起到了理论指导和科学支撑作用。     

一株抗肿瘤放线菌的鉴定及生物活性

为开发青藏高原沙地生态系统放线菌资源,首次从位于青藏高原东北部的青海湖沙岛土壤样品中选择性分离培养出一株具明显抑菌及抗肿瘤活性放线菌Sd-31.通过生理生化特性、化学分类学以及16S rRNA序列分析鉴定,菌株为砖红链霉菌,命名为Streptomyces lateritius Sd-31;双层琼脂法检测菌株抑菌活性,表明菌株对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)有显著抑制作用;通过Hoechst染色荧光显微镜观察及MTT法细胞毒性试验,确定菌株发酵液有明显的诱导肿瘤细胞凋亡活性且与处理浓度成正相关;纸片法研究菌株发酵液活性稳定性,结果表明,20~80℃处理后发酵液抑菌活性稳定,100℃条件处理后发酵液抑菌活性降低;在酸性及中性条件下发酵液活性稳定,碱性条件下随着pH值的增加发酵液抑菌活性降低.以上结果为抗肿瘤药物的研究提供了理论数据.     

生防枯草芽孢杆菌胞外植酸酶对小麦耐盐性的影响

以产植酸酶的广谱拮抗生防枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T2为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)诱变,得到遗传特性稳定的一株植酸酶负突变株M3.采用有效磷限量、含NaCl 150 mmol L-1的植物生长水培液对小麦进行盐胁迫,在植酸存在的条件下,水培液中施加T2发酵液或植酸酶均可促进盐胁迫下小麦幼苗的生长,小麦株高、鲜重、叶片叶绿素含量和根系活力均得以增高,而植株丙二醛(MDA)含量降低.失去植酸酶活力的负突变株M3发酵液则不具有提高小麦株高鲜重和叶绿素含量的作用,对根系活力的提高和对MDA含量的降低程度也均低于T2发酵液处理.上述结果表明,生防枯草芽孢杆菌胞外植酸酶在增强小麦耐盐性方面起了重要作用.图6表2参13     

基于木质素生物降解的堆肥化接种剂开发

选取由农林废物堆肥中筛选出的木质素降解优势土著微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、黑曲霉(Aspergillus niger)、简青霉(Penicillium simplicissim)、栗褐链霉菌(Streptomyces badius),依据PLFA-PLS定量分析所得堆肥化2次发酵期有效的木质素降解微生物群落组成比例混合接种至稻草基质发酵瓶中,做1组L9(34)正交试验以优化混合比例,期望开发1种基于木质素降解的高效堆肥化接种剂.试验结果表明:混合菌剂具有较强的木质素降解能力,其对木质素的降解是木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维素酶和半纤维素酶共同作用的结果;当按照个数比细菌∶放线菌∶真菌为85∶5∶ 10,枯草芽孢杆菌∶铜绿假单孢菌为55∶25,黑曲霉∶简青霉为2∶1配比时,木质素、纤维素、半纤维素降解率最高,分别达到22.13%,48.97%和55.93%;在不灭菌前提下,按此配比接入菌剂,其木质素、纤维素、半纤维素降解率分别比不接菌剂发酵稻草提高19.16,38.25和46.30百分点.     

巨大芽孢杆菌对富营养化景观水体的净化效果

利用巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),在室内采用投菌法对富营养化景观水体进行预处理试验研究.通过不同的菌液投放量ψ=0.05×10-3、0.1×10-3、0.2×10-3,对水体进行处理,结果表明,巨大芽孢杆菌对富营养化水体中的总氮(TN)、总磷(TP)、CODcr均有一定的去除效果,其中在投菌量为0.1×10-3时处理效果最好.通过进一步的连续投菌净化试验,水体中的TN、TP、CODcr显著降低,处理后,藻类基本得到控制.由此可见,巨大芽孢杆菌能够有效地去除水体中的有机物、氮、磷,因此,具有净化富营养化水体的作用.