土壤宏蛋白质组学蛋白质提取方法及其应用

土壤宏蛋白质组学在揭示土壤微生物功能、代谢与环境相互作用方面具有广阔的应用前景,但由于土壤样品的特殊性,土壤蛋白质提取步骤是限制土壤宏蛋白质组学大规模应用的瓶颈之一.本文从样品制备、提取方法、影响因素等方面综述了土壤蛋白提取方面的研究进展.一般来说,根据实验目的、蛋白种类及后续研究方法设计相应的分组成收集策略才能取得较好的提取效果.土壤总蛋白、胞内蛋白与胞外蛋白分别有不同的提取方法.总蛋白提取一般采用直接提取法;胞外蛋白不需要裂解;胞内蛋白提取方法有直接提取法和间接提取法等.裂解、浓缩、去除腐殖质的方法以及提取液、pH值的选择等也会影响提取效果.此外,简单介绍了土壤宏蛋白质组学的应用,并对今后的研究工作提出展望.表1参36     

活性污泥总DNA不同提取方法的比较

为了快速、简便和经济地获得活性污泥的总DNA,以用于分子生物学研究,采用5种不同的DNA提取方法提取活性污泥的总DNA,并通过提取的核酸总量、纯度、是否含有聚合酶链反应抑制剂等指标综合分析不同的提取方法对活性污泥总DNA提取效果的影响.结果表明:蛋白酶K-SDS-酚氯仿法和柱提取DNA试剂盒法提取活性污泥总DNA效果最好,提取DNA总量多,纯度高,可不经纯化直接进行PCR扩增反应。     

真菌核酸的一种快速提取方法

在总结多种真菌DNA和RNA提取方法的基础上，发展了一种提取真菌核酸新方法，与其它方法相比，该方法具有快速、操作简便等特点，而且提取DNA和RNA步骤基本一致，用该方法提取的DNA完整、纯度高，可用于PR、限制性内切酶酶切和Southern杂交等分子生物学操作；提取RNA产量高，RNA无降解，纯度高，适用Northern和cDNA合成等分子生物学操作。     

一种提取富含油脂植物组织总RNA的改良SDS酸酚法

采用常规的方法提取富含油脂的植物组织总RNA常难以取得满意的结果.对林莎两次裂解法进行了改良,即将SDS的浓度降低至1%,所用酸酚的pH值降低至4.0,去掉提取液Ⅱ处理步骤,获得的总RNA效果较好:得率高,RNA产量可达74.7 μg(100 mg)-1;没有DNA污染,A260 nm/A280 nm/2.026,A260 nm/A230 nm值为2.082,说明蛋白质及其它污染非常低,通过RT-PCR成功地扩增出了麻疯树curcin基因长为927 bp的特异条带.相比林莎的方法,改良SDS酸酚法具有经济、简便、适用性广的特点.图5表1参13     

西藏米拉山高寒草甸土壤微生物DNA提取及宏基因组Fosmid文库构建

青藏高原土壤中富含特殊的微生物资源,因大多数未能得到培养而无法利用.提取微生物总DNA及构建宏基因组文库的方法是研究未培养微生物的重要方法(免培养法).两藏米拉山高寒草甸土壤中腐植酸、有机质含量非常高,DNA提取非常困难,本研究表明卣接法提取该样品的DNA片段小,杂质含量高,不能满足构建大插入片段文库的要求;结合低速离心和Nycodenz密度梯度离心先分离出微生物细胞的间接法虽然DNA产率降低,但是纯度高,片段长,多样性丰富,更适合于构建大插入片段文库.在间接法提取高质量西藏高寒草甸土壤微生物DNA的基础上,成功构建了一个包含30 624个克隆、库容量超过1 Gb、稳定性好的宏基因组Fosmid文库,为从西藏高原土壤中挖掘和利用新的功能基因研究奠定了基础.图7表3参27     

从麻疯树胚乳中提取总RNA的快速方法

以麻疯树胚乳为材料,建立了一种适合于提取富含油脂、蛋白及多酚、多糖等次生物质的植物总RNA的方法.其中,提取液Ⅰ在1.5%SDS和400 mmol/L NaCl盐溶液条件下能快速有效破壁,酸酚/氯仿促进了细胞裂解以及油脂、蛋白的分离.而基于异硫氧酸胍法的提取液Ⅱ进一步强烈抑制Rnase的活性,确保RNA不被降解,并以5 mol/L高浓度NaCl溶液除去植物组织提取液中的多糖、多酚等次生物质,得到质量较好的总RNA样品.     

宿根甘蔗根际土壤细菌多样性分析中培养法与非培养法比较研究

采用培养法和非培养法提取甘蔗根际土壤微生物的总DNA,基于通用引物PCR扩增构建两种方法的细菌16SrDNA文库,并进行核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA),通过部分克隆序列测定构建细菌克隆文库的系统发育树,进而对基于传统的细菌平板培养法和直接提取总细菌DNA的非培养法进行比较分析.结果显示,非培养法文库的香侬–威纳指数、辛普森指数、丰富度分别为4.94、0.998、28.91,均高于培养法文库中相应的多样性参数(分别为4.27、0.996、16.79),均一度数值都>0.95.结合统计学数据和序列测定信息,反映出甘蔗根际土壤存在着丰富的细菌多样性,但平板培养法所展现的多样性低于直接提取法,表明前者存在着很大的局限性,而非培养法文库中主要是未培养微生物的16S rDNA序列,这从一个侧面反映了土壤样品中未培养微生物占很大比例.因此,在土壤微生物群落研究中,必须结合新的分子生态学技术手段,如采用直接提取总DNA的方法进行研究,才能比较全面地认识土壤微生物多样性.图3表3参18     

二乙烯三胺五乙酸(DTPA)提取ICP-AES法测定土壤中有效态元素

本文参考《土壤有效态元素的测定二乙烯三胺五乙酸提取/电感耦合等离子体原子发射光谱法》最新环境验证标准和《ISO 14870—2001》方法标准,采用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)作为提取剂,提取土壤中有效态铜、铁、锰、锌、镉、铬、镍和铅等元素并使用ICP-AES法进行了测定.该前处理方法不同于传统的元素全量消解方法,无需添加高腐蚀性、高氧化性的强酸.实验结果表明,方法线性相关系数良好,r0.9999,精密度RSD0.7%,测定结果与土壤标准物质GBW07414a中的有效态元素标准值吻合.     

除草剂对土壤微生物生物量碳、氮及呼吸的影响

通过室内培养试验,分别在不同时间取样分析,采用熏蒸-提取法测定土壤微生物生物量碳,提取液中的有机碳采用总有机碳分析仪测定,提取液中的氮采用凯氏消煮法测定;采用直接吸收法滴定测定土壤呼吸作用.研究了阿特拉津、甲磺隆、丁草胺3种除草剂对土壤微生物生物量碳、氮及呼吸强度的影响,揭示了3种除草剂污染的土壤中微生物生物量碳、氮的消长过程及土壤呼吸的动态变化.研究结果显示在较高使用浓度胁迫条件下,培养前20 d 3种除草剂都明显减少土壤微生物生物量碳、氮及抑制土壤呼吸.但这种抑制效应是随着时间而变化的,20 d以后,它们对这些能表征土壤环境生态效应的生物学指标的影响随之降低.甲磺隆对微生物生物量碳、氮及呼吸作用等生物学指标的影响大于阿特拉津和丁草胺也可能与它们在土壤中的降解速率有关.     

土壤中铍的存在形态及提取研究

本文对三种不同类型土壤中铍的存在形态及提取进行了研究,并做了原土铍和外加铍形态提取对照试验,选择了各形态合适的提取剂,建立了土壤铍形态连续提取方法,对提取机理和形态分布规律进行了探讨。此外,还对土壤提取的有效铍与盆栽植物吸收铍量的相关性进行了初步研究。     

微生物研究在土壤质量评估中的应用

为了防止土壤退化,实现资源的持续利用,必须对土壤质量进行评估.传统的理化指标已难满足需要,寻找能够全面反映土壤质量动态变化和判别胁迫环境或人为干扰下土壤质量变化的灵敏指标,已成为土壤生态学的研究热点.土壤微生物是土壤生态系统的重要组分,在生物地球化学循环过程中有重要的作用,对土壤环境变化和胁迫的反应十分灵敏.但由于土壤微生物种类繁多且难以培养,限制了其在土壤质量评价中的应用.近年来围绕土壤微生物总量、活性和组成的测定发展出了很多新的技术,如微生物生物量测定、土壤酶活件测定、土壤诱导呼吸强度测定、Biolog微量分析、纯培养、磷脂脂肪酸谱图分析和分子生物学技术等,极大地促进了微生物指标在土壤质量评价中的应用.本文就这3个方面的土壤微生物研究技术及其在土壤质量评价中的应用进行评述.表1参70.     

Müllverbrennungs-Schlacke als Baumaterial

In order to determine the possible depreciation of its quality as a building material, solid waste residues from a municipal solid waste incinerator were analysed in a case study for its contents of various organic fractions with special emphasis on fractions which can be utilised by microbes as carbon sources. Furthermore, microbial concentrations in ashes, microbial fermentation and pH dependent viability of soil microbes in extracts of ashes were determined. Results demonstrate a low content of organic fractions in the solid waste, especially of those which can serve as C-sources for soil microbes. Microbial concentrations and rates of fermation in the ash are extremely low. The former is not only limited by the availability of suitable C-sources, but also by the alkaline pH of and the heavy metal concentration in the soil solution. Model calculations confirm that the maximal possible gas formation is extremely low and therefore does not diminish the quality of the incinerator ash as a potential building material.     

纤维素分解混合菌群腐解稻草的使用技术研究

为了得到具有较强纤维素分解能力的复合微生物组合用于秸秆还田,从不同生态环境来源的土壤中用培养基进行了纤维素分解混合菌群的富集筛选,得到了酶活性较高的以兼性厌气性细菌为主的纤维素分解混合菌群。该菌群腐解稻草粉的效果要比稻草秆好,施用氮肥时分次施用或者施用缓控释肥较好。使用该菌剂时,先喷洒在稻草堆上,当菌吸附在稻草上后再撒开,这样有利于菌发挥作用。模拟稻田试验结果表明,处理的失重率与对照的失重率差异达到极显著水平,说明该菌剂在土壤中仍然能够加快稻草的腐解,稻草还田少耕与免耕条件下,该菌剂同样有效果。     

超积累植物和化学改良剂联合修复锌镉污染土壤后的微生物特征

通过盆栽试验,观察分析不同的土壤改良配方对重金属超积累植物东南景天盆栽土壤中细菌、真菌和放线菌数量、Cmic及Nmic的影响,以此来筛选出最优的促进东南景天修复锌镉污染土壤的改良剂配方。结果显示:细菌、真菌和放线菌数量,与土壤Zn、Cd的去除率、东南景天植株干质量、Cmic及Cmic/Nmic两两之间都呈现极显著正相关关系(但Cmic/Nmic与真菌数量仅呈显著相关)。添加了土壤改良剂后,细菌、放线菌、真菌的数量都有不同程度的增加,其中以细菌数量的增加最为显著,放线菌次之,真菌则对各种土壤处理相对较不敏感;在各种土壤配方中,添加了6 g赤泥、15 g污泥和15 g沸石的T7处理最有利于各类土壤微生物的生长,微生物量碳达到345.64 mg.kg-1,与其它处理之间都达到显著差异。因此,可以利用土壤微生物作为污染土壤改良情况的生物指标。该研究为下阶段研究化学改良剂-植物-微生物修复技术奠定了基础。     

典型纳米材料的土壤微生物效应研究进展

纳米材料的大量生产和广泛应用使其不可避免地进入环境中,而土壤是人工纳米材料释放到环境的主要的汇。土壤中的微生物群落能敏感地反映土壤环境质量的变化,其对物质循环与能量转换具有极重要的生态学意义,然而纳米材料因其独特的物理化学特性,对土壤微生物群落及其功能的影响尚不明确。在参考纳米材料对微生物影响相关研究的基础上,总结了土壤中纳米材料的主要类型及来源,综述了典型纳米材料对土壤微生物群落结构、丰度、功能的影响及可能的影响机制,探讨了环境因子对人工纳米材料土壤生物效应的调控作用,对需要深入研究的方向进行了展望。     

Effects of sepiolite and biochar on microbial diversity in acid red soil from southern China

Sepiolite and biochar can immobilize heavy metals and organic pollutants in soil effectively, but their impact on the soil microbial community and diversity is still unclear. High-throughput Illumina MiSeq method was used to study the effects of sepiolite and biochar on the diversity of microbial communities in acid red soil amended with cadmium and atrazine. A total of 47,472 microbiological Operational Taxonomic Units (OTUs) were found in all the treated soil samples. Sepiolite and biochar enriched the diversity of soil microbes at different classification levels and OTUs, but the effect of biochar was stronger than that of sepiolite. A Venn diagram showed that compared with other treatments, adding 2% biochar could promote the growth of specific microbes, which is better than the case for 5% biochar. The heat map of species abundance cluster showed that the dominant microbes in soil were different for different treatment doses of sepiolite and biochar. Among all the soil treatments, the top ten dominant bacterial phyla (from high to low dominance) were: Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Acidobacteria, Gemmatimonadetes, Chloroflexi, Planctomycetes, Cyanobacteria­, and Verrucomicrobia. The addition of sepiolite and biochar promoted the restoration of the microbial community diversity in contaminated soil.     

Behavioral acquisition of the hindgut fermentation system by hatchling Iguana iguana

Summary Hatchling green iguanas (Iguana iguana) spend the first month of life obtaining their hindgut fermentation systems before settling into their characteristic habitat. Newly hatched iguanas consume soil within the nest chamber, establishing populations of soil microbes in the hindgut, before digestive activity begins in the stomach. Hatchlings dig their way out of the nest chamber during the first week after hatching; once on the surface, they may eat both soil and plant materials. The rudimentary microbial fermentation system acquired through soil consumption supports faster growth, and presumably more effective degradation of plant materials, than microbes obtained without contact with soil. During the second and third weeks of life, hatchling iguanas disperse away from the nesting area. They travel into the forest canopy, associate with older consepcifics, and obtain a more complex and effective microbe community by consuming the feces of their seniors. Approximately a month after hatching, iguanas settle into low vegetation in open habitats, and may continue to associate in groups.     

川西植被恢复过程中的土壤微生物评价及与土壤因子的关系

较系统地评价了川西植被恢复过程中的土壤微生物以及土壤因子对土壤微生物恢复的制约作用。结果表明:在自然恢复的前50 a,40 a群落的微生物数量恢复最佳,40~50 a会逐渐减少,其中微生物的生理类群数量在30 a到达最好,而微生物数量(细菌、真菌和放线菌)在40 a达到最好;采用桦木、刺楸和杉木对微生物及其生理类群群落的恢复效果差,建议恢复川西中亚热带森林生态系统重新选用合适的豆科植物;人工抚育可显著地促进微生物生理类群数量;土壤中的速效K和阳离子交换量是促进土壤微生物和3种生理类群恢复的主要决定因子,而pH、有机质、全K必须通过速效K或阳离子交换量才能对土壤微生物和生理类群起到较大的作用,速效N对微生物及其生理类群没有明显的作用。     

Cu2＋胁迫下湿地微生物热代谢活性及Cu2＋的固定/转化率

应用微量热法结合常规分析方法,研究了桂林会仙湿地沼泽底泥和水稻田微生物在800 - 4 000 μg·g-1 Cu2＋胁迫下的热代谢活性及Cu2＋的固定/转化率。结果表明,在w（Cu2＋）为800 μg·g-1条件下,水稻田和沼泽底泥土壤微生物对Cu2＋的固定/转化率分别为44.93%和34.59%,但在w（Cu2＋）为4 000 μg·g-1 时则分别是93.16%和85.13%;Cu2＋对水稻田和沼泽底泥土壤微生物代谢活性的半抑制浓度分别为2 043和2 325 μg·g-1;水稻田土壤微生物代谢活性低于沼泽底泥,在土壤及其微生物共同作用下Cu2＋的固定/转化率随Cu2＋浓度递增而升高;在相同条件下,水稻田和沼泽底泥土壤微生物的代谢速率在α = 0.05或α = 0.01水平上显著相关。湿地土壤用途发生改变后,土壤微生物在固定/转化Cu2＋的作用上发生了明显变化。     

鱼腥草对土壤中镉的富集及根系微生物的促进作用

通过采集自然条件的鱼腥草和未受污染的土壤,在实验室条件下培育,以及利用镉的筛选,培养出土壤菌悬液,研究了鱼腥草Huttuynia cordata对土壤中镉的富集作用,以及经过根系微生物处理后放线菌对富集后转移的促进作用。结果表明,根部经过微生物处理的鱼腥草地上部（土壤含镉200 mg·kg^-1）有最高的含镉浓度和最大的富集量,分别是是对照组的20倍和50倍。土壤含镉50 mg·kg^-1时,鱼腥草地上部与地下部镉富集量的比例是2.5,高于对照组（1.5）。而当土壤含镉200 mg.kg^-1时,经过处理的鱼腥草地上部与地下部镉含量之比是未经处理的2倍。所以,鱼腥草对土壤中的镉有很强的富集作用,且在根系微生物的促进下,地下部的镉能更有效地转移到地上部,大大加强植物的修复效率;且与其他的诸如添加化学螯合剂等方法相比,土壤根系微生物能更好地适应植物根系环境,更不会对土壤本身的微生态系统造成二次污染。所以研究根系环境中微生物、根系、土壤酶、金属离子等的相互影响关系,将是土壤重金属植物修复的另一重要领域。