高效转化胆固醇菌株的筛选、鉴定及转化条件优化

胆固醇由甾体母核和侧链构成,是一种新的甾体资源.以胆固醇为唯一碳源的选择培养基,利用富集培养法从土壤中筛选出一株细菌,编号5901.该菌能够快速高效转化胆固醇,专一性生成4-胆甾烯-3-酮.经形态学观察和16S rDNA序列比对分析,该菌株为Rhodococcus sp.该菌株转化胆固醇的最优条件为:生长温度和转化温度均为30℃,初始pH 8.0.胆固醇质量浓度为5 g/L,反应24 h后,胆固醇转化率为95%.本研究表明,590 1菌株较之前报道的菌株,底物浓度高,转化速率快,也可以催化其它甾体化合物的3β-羟基氧化和5位双键位移反应,具有潜在的研究和应用价值.     

生物催化不对称还原制备(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇研究进展

(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇是合成药物阿瑞匹坦的关键中间体.以羰基还原酶生物催化前手性酮3,5-二(三氟甲基)苯乙酮的方法制备该中间体具有立体选择性优异、反应条件温和、对环境友好等优点,近年来受到广泛关注,目前已报道的高立体选择性酶源(产物ee 99%)有10余种.其中原始菌株生物催化体系能够转化底物的浓度普遍低于200 mmol/L,而利用重组Escherichia coli全细胞或者粗酶液则可催化1 mol/L以上的底物.通过添加离子液体、深共熔溶剂等辅溶剂,羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶融合表达以及酶固定化技术等方法优化反应体系可以有效提高底物转化效率.有些羰基还原酶,如LXCAR、KR01、Ch KRED20等,能够催化异丙醇脱氢实现辅酶自循环,其催化体系具有明显优势.未来利用蛋白质工程技术对野生型的潜力酶进行人工进化,可以进一步提高利于工业应用的酶学性能,同时稳定的生产工艺、规模放大、后处理等方面也需要深入开展研究.(图2表3参52)     

降解植物甾醇为甾体9α-OH-AD菌株的筛选与鉴定

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是重要的甾体药物中间体,多用于生产糖皮质激素类药物.通过微生物法转化植物甾醇生成9α-OH-AD,将为工业化生产提供极大便利.从榨油厂、油菜花田等多处土壤中筛选出1株高效转化植物甾醇为9α-OH-AD的菌株,根据16S r DNA序列比对并结合菌株的形态特征、生理生化特征分析,鉴定其为分枝杆菌属,并将其命名为Mycobacterium sp.LY-1.该菌在往复式摇床中培养,当培养条件为温度30℃、转速120 r/min、转化时间7 d、底物添加浓度为5 g/L时,9α-OH-AD产物得率达到16.2%.为解决底物植物甾醇在水中溶解性较差的问题,考察了助溶剂(吐温80、β-环糊精)对植物甾醇转化产甾药中间体9α-OH-AD效率的影响.经过筛选,最终确定最适助溶剂为0.1%的吐温80.在此条件下,当底物投料浓度为15 g/L时,9α-OH-AD的浓度达到3.9 g/L,产物摩尔得率提高至35.1%.本研究表明菌株LY-1转化效率好,可为后续的代谢工程改造提供便利并为后期用于工业化生产奠定基础.     

光炭轮菌菌丝体的化学成分

对光炭轮菌菌丝体乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位的化学成分进行研究.采用色谱方法进行分离纯化,并利用质谱、核磁共振等波谱方法对化合物进行结构鉴定;采用MTT法对部分化合物进行肿瘤细胞的细胞毒活性测定.共分离并鉴定了11个化合物:3β-羟基-5α,8α-过氧麦角甾-6,22-二烯(1)、9(11)-脱氢过氧麦角甾醇(2)、单花生酸甘油酯(3)、4,6,8(14),22-四烯-3-麦角甾酮(4)、丁香脂素(5)、3,5,3~′,5~′-四甲氧基-4,4~′-联苯二酚(6)、5-甲氧基香豆素(7)、5-羟基-2-甲基-4-色原酮(8)、(2R,4R)-3,4-二氢-5-甲氧基-2-甲基苯并二氢吡喃酮(9)、5-甲氧基-2-甲基二氢色原酮(10)、7β-caruilignan C(11).其中化合物4对肿瘤细胞H1299、H460、HGC-27、A549和MNK-45具有抑制作用,IC50值分别为25.2±2.9、32.3±4.2、29.2±1.2、33.9±3.7、18.0±7.0μmol/L.     

近平滑假丝酵母NAD(H)依赖型次级醇脱氢酶的分离纯化及酶学性质

从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC 203011)中分离得到了NAD(H)依赖型的次级醇脱氢酶.粗酶经乙醇沉淀、Blue Sepharose Fast Flow亲和层析、DEAE Sepharose离子交换层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带,其酶蛋白的亚基分子量(Mr)为37.5×103.该酶还原反应的最适pH为6.0,最适温度为45℃,是一个含Zn2 金属酶.该脱氢酶具有较高的底物的选择性,对2-酮具有较高的还原活力;同时,也能作用于醇类发生氧化反应,对次级醇的氧化活力最高.以β-羟基苯乙酮为底物,用纯化得到的酶催化反应后,还原产物为(R)-苯基乙二醇,因此该酶为(R)-专一性次级醇脱氢酶,是一种生产(R)-苯基乙二醇的有效的生物催化剂.经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中3个肽段的氨基酸序列,通过比对发现该酶与NCBI编号为BAA24528的次级醇脱氢酶具有较高的同源性.图4表3参17     

大环多胺镍配合物催化过氧化氢降解碱性品红催化性能与机理

以大环多胺镍配合物[NiL](ClO_4)_2为催化剂(L=1,8-二甲基-1,3,6,8,10,13六氮杂十四烷),H2O2为氧化剂,碱性品红为底物,研究了催化剂用量、氧化剂投入量、底物浓度、反应溶液pH值、反应温度、常见阴离子和天然有机物对催化反应效率的影响.结果表明,反应体系p H=6,催化剂浓度200μmol·L~(-1),碱性品红浓度15 mg·L~(-1),氧化剂投入量0.12 mol·L~(-1),在50℃下反应催化速率达最大值,10 min内碱性品红脱色率96.7%.通过自由基淬灭实验和电子顺磁共振测试发现[NiL](ClO_4)_2-H_2O_2反应体系中主要起氧化降解作用的自由基是O_2~-·,并推测反应机理为:过氧化氢与大环多胺镍配位化合物的中心离子镍配位,形成一个五配位的配位化合物,配位化合物在溶液中分解能给出超氧离子,超氧离子降解碱性品红.     

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶初步纯化及部分性质

以日本沼虾内脏为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32离子交换柱层析和SephadexG-100分子筛柱层析纯化,获得比活力为3000Umg-1、纯化倍数为8.88倍的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂(NAGase).以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学,结果表明,酶的最适pH为6.0,最适温度为53℃.该酶在pH4.5~9.3区域较稳定,当pH>9.3很快失活;在50℃以下处理30min,酶活力保持稳定,高于50℃,酶稳定性较差,75℃酶完全失活.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.165mmolL-1,最大反应速度Vm为6.55μmolL-1min-1.酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为63.55kJmol-1.图5表1参16     

几种典型羟基化多溴联苯醚和多溴联苯的合成、纯化及鉴定

通过耦合、氧化和溴化等基本有机化学反应,合成并纯化了几种典型羟基多溴联苯醚和多溴联苯.通过C18半制备高效液相色谱柱对反应粗成品进行分离与纯化,以气相色谱-质谱和氢谱核磁共振对产物进行结构鉴定与表征.结果表明,合成制备的产物与目标物一致,纯度达99%以上.     

冬虫夏草中一株内生菌次级代谢产物的化学成分

对一株冬虫夏草内生真菌Penicillium herquei发酵液次级代谢产物乙酸乙酯萃取部位的化学成分进行研究.利用柱色谱、制备色谱等手段进行分离纯化,并利用NMR、ESI-MS等波谱手段对化合物进行结构鉴定.分离了11个化合物,鉴定为2′,4′-二羟基-3′,5′-二甲基苯乙酮(1),香草醛(2),3-氧代-α-紫罗兰酮(3),3,3,5-三甲基-4-(3-氧代-1-丁烯基)-1-环己酮(4),对羟基苯甲醛(5),对羟基苯乙酮(6),对羟基苯乙酸甲酯(7),环(脯氨酸-异亮氨酸)(8),环(脯氨酸-缬氨酸)(9),4-甲氧基苯乙酸(10),环(4-甲基脯氨酸-缬氨酸)(11).本研究表明苯甲醛类、紫罗兰酮类和环二肽类化合物为冬虫夏草内生菌P. herquei的主要次级代谢产物.     

热解糖高温厌氧杆菌β-葡萄糖苷酶的重组表达与酶学性质

β-葡萄糖苷酶是纤维素分解酶系中的重要组成部分,为从嗜热微生物中挖掘酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶,解决β-葡萄糖苷酶在工业应用方面普遍存在的活力偏低、稳定性不足、易受产物抑制等问题,通过密码子优化、基因合成和分子克隆技术,从热解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷酶基因bglY,构建重组表达载体pET22b-bglY,并转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,经IPTG诱导获得可溶性表达,采用Ni-NTA亲和层析法获得纯酶,并探究其酶学性质.结果显示,BglY属于GH1家族成员,分子量为52 × 10~3,最适反应温度65℃,70℃的半衰期达 1 h;最适反应pH 6.5,在pH 5-10范围内稳定;p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG)为底物时比活为420.2 ± 5.6 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率V_(max)分别为2.1 ± 0.4 mmol/L和909.1 ± 6.2 μmol min~(-1) mg~(-1);该酶对β-1,4糖苷键的底物具有水解偏好性,也可以水解纤维二糖和乳糖;5 mmol/L Fe~(3+)、Fe~(2+)、Cr~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)和EDTA对酶有激活作用,1% SDS完全抑制其活性;该酶可以抵抗产物葡萄糖的反馈抑制,且0.1-0.6 mol/L浓度的葡萄糖对酶具有激活作用,其中0.4 mol/L葡萄糖可提升活性至1.3倍,当葡萄糖浓度超过0.6 mol/L时,酶的活性才开始出现抑制.本研究表明BglY是一个葡萄糖激活型β-葡萄糖苷酶,其酶学性质优异,反应pH和温度范围较广且稳定,同时能水解天然底物纤维二糖和乳糖,可在提高纤维素生物质向葡萄糖的酶促转化等方面发挥应用潜力.(图7表3参32)     

锥头麻的化学成分研究

从锥头麻枝叶中分离到10个化合物:熊果酸(1)、2α,3β,19α三羟基12烯28乌苏酸(2)、羽扇豆醇(3)、β谷甾醇(4)、β胡萝卜苷(5)、大黄素8OβD吡喃葡萄糖苷(6)、5α,8α表二氧(22E,24R)麦角甾6,22二烯3β醇(7)、(2S,3S,4R,8E)2[(2′R)2′羟基二十四烷酰氨基]1,3,4三羟基8十八烷烯(8)、1OβD吡喃葡萄糖(2S,3S,4R,8Z)2[(2′R)2′羟基二十四烷酰氨基]3,4二羟基8十八烷烯(9)、1OβD吡喃葡萄糖(2S,3S,4R,8E)2[(2′R)2′羟基二十四烷酰氨基]3,4二羟基8十八烷烯(10),其中化合物9、10以混合物形式分离得到.应用波谱方法及与已知品对照的手段鉴定了它们的结构.图1表1参9     

青霉菌发酵生产β-葡萄糖苷酶培养基优化及纤维素酶可溶性诱导物制备

在纤维素酶生产过程中,常用的固体诱导物存在着诱导效率低、传质阻力大和不易于流加培养等局限性,所以利用β-葡萄糖苷酶催化葡萄糖生产槐糖等可溶性诱导物进行纤维素酶发酵具有重要意义.为实现β-葡萄糖苷酶的低成本高效生产,首先利用本实验室分离的β-葡萄糖苷酶生产菌Penicillium sp.YH02为产酶菌株,利用响应面法对麸皮、麦草和微晶纤维素3个参数浓度进行优化,优化后β-葡萄糖苷酶酶活提高15.03%.其次,利用菌株YH02所产的β-葡萄糖苷酶,以高浓度葡萄糖为底物进行转糖苷反应,合成诱导里氏木霉(Trichodema reesei)产纤维素酶的可溶性诱导物.结果表明,以10 g/L该可溶诱导物为碳源时,里氏木霉Rut-C30在48 h时滤纸酶活比未进行催化反应的葡萄糖对照高24.9倍.离子色谱分析结果表明,高浓度葡萄糖经过菌株YH02分泌的β-葡萄糖苷酶催化后产生具有诱导能力的槐糖、龙胆二糖和纤维二糖.本研究实现了β-葡萄糖苷酶的高效生产并成功制备了可溶性诱导物,为降低纤维素酶生产成本提供了参考.(图4表1参22)     

环糊精的Fenton氧化特性及产物分析

环糊精因其具有包合增溶特性,单独或与高级氧化技术(如Fenton氧化)耦合可应用于有机污染物的土壤污染修复,然而环糊精的稳定性不清楚.本研究考察了环糊精在Fenton体系中的降解动力学及转化产物,评估了环糊精的稳定性.结果表明,β-环糊精(β-CD)在Fenton体系中反应速率随着过氧化氢浓度的升高而线性增加,符合二级动力学过程.环糊精与羟基自由基反应的绝对速率常数在酸性条件下(p H=3)分别为3.9×10~9L·(mol·s)~(-1)(β-CD和甲基β环糊精),6.5×10~9L·(mol·s)~(-1)(羟丙基β环糊精),7.2×10~9L·(mol·s)~(-1)(γ-环糊精),中性条件下(p H=7)为2.9×10~9L·(mol·s)~(-1)(β-CD),3.1×10~9L·(mol·s)~(-1)(MCD),3.2×10~9L·(mol·s)~(-1)(HPCD),3.3×10~9L·(mol·s)~(-1)(γ-CD),显示环糊精在酸性条件下降解加快,且绝对速率常数的种类差别较大,而在中性条件下比较稳定,且种类之间差别不大.产物质谱分析表明,环糊精空腔骨架上的羟基被氧化,生成了含有醛基和羧基氧化产物;反应前后总有机碳含量无明显差别,表明环糊精及产物的空腔结构稳定,未被开环破坏.     

大肠杆菌乙酰酯酶(AES)的酶学性质

以乙酸香叶酯为底物,对大肠杆菌乙酰酯酶(Acetyl esterase,AES)的酶学性质进行解析,实现将乙酸香叶酯生物转化为香叶醇.结果显示:大肠杆菌AES酶的最佳反应p H范围为6.0-7.5;最适反应温度为30℃;最佳催化时间为2 h;Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)对酶活没有太大影响,而Cu~(2+)、Zn~(2+)明显抑制酶的活性.对AES的动力学研究可知,其米氏常数Km、最大反应常数Vm分别为2.88 mmol/L、1.87 mmol/L.该酶同样可水解乙酸松油酯、乙酸薄荷酯、乙酸香茅酯,分别产生松油醇、薄荷醇和香茅醇.本研究得出了大肠杆菌乙酰酯酶的最适反应条件,可为后期香叶醇的生物合成优化和产量提高以及其他萜醇类化合物的生物合成提供参考依据.     

氧化微杆菌C3催化3,5-双三氟甲基苯乙酮的不对称反-Prelog还原(英文)

(R)-3,5-双三氟甲基-1-苯乙醇是合成神经激肽1受体拮抗剂阿瑞匹坦的关键手性醇中间体.通过筛选得到一株氧化微杆菌C3(Microbacterium oxydans C3),其能不对称还原底物3,5-双三氟甲基苯乙酮为(R)-3,5-双三氟甲基-1-苯乙醇.在底物浓度为5 g/L时,生物转化反应40 h,能达到>99%的ee值和95%的底物转化率.底物浓度提高到50 g/L时,生物转化的ee值依然保持99%,并能达到56%的底物转化率.利用该氧化微杆菌C3对其他含氟苯乙酮衍生物进行生物转化反应,同样得到了较高的立体选择性和底物转化率.     

不对称还原丙酮酸乙酯菌株的筛选及鉴定

以丙酮酸乙酯为底物,从成都某化工厂污水池及其附近土壤中分离到36株可将丙酮酸乙酯不对称还原成(S)-乳酸乙酯的菌株.经过多次复筛,最终获得了一株具有较高催化活性的酵母菌BTY18-6.在以该菌株静息细胞为催化剂,催化不对称还原丙酮酸乙酯合成(S)-乳酸乙酯的反应中,底物浓度为60 mmol/L时,底物转化率为86.9%,产物(S)-乳酸乙酯的ee值为88.7%.通过对其形态学、生理生化特征及其26S rDNA Dl/D2区域的分析表明,BTY18-6为胶红酵母.     

川芎内生菌Fusarium tricinctum的化学成分

采用糙米培养基对川芎内生菌Fusarium tricinctum菌种进行扩大培养,利用萃取、柱色谱、制备色谱等手段对其化学成分进行分离纯化,并通过NMR、ESI-MS等波谱手段对所得化合物进行结构鉴定;采用MTT法对部分化合物进行细胞毒活性测定.共分离得到13个化合物,分别鉴定为苯乙酸(1),3,6-二异丙基-1-甲基哌嗪-2,5-二酮(2),fusarpyroneA(3),fusagerinB(4),N-苯乙基乙酰胺(5),fungerin(6),callyspongidipeptideA(7),环-(S-脯氨酸-R-亮氨酸)(8),vomifolilol(9),环-(4-S-羟基-R-脯氨酸-R-异亮氨酸)(10),N-acetyl-β-oxotryptamine(11),烟酸(12),邻羟基苯乙酸(13).化合物6对OCI-LY10、HT29、MV4-11、Hela、SKOV3具有一定的抑制作用,IC50值分别为23.98±2.37、93.63±1.42、90.64±1.65、77.65±1.35、52.52±2.04μmol/L.上述结果可为该菌种的肿瘤细胞毒活性开发提供一定的研究依据.(表1参28)     

柳叶忍冬的化学成分研究

从柳叶忍冬95%乙醇提取物中首次分离并鉴定了20个化合物: ( )-cycloolivil (1)、( )-fraxiresinol (2)、prinsepiol(3)、软脂酸(4)、对甲基苯酚(5)、2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯(6)、洋芹素(7)、木犀草素(8)、5,7,4′-三羟基黄酮醇7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)、槲皮素(10)、染料木素(11)、5,4′-二羟基-7-甲氧基异黄酮(12)、染料木素5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(13)、5,4′-二羟基-7-甲氧基异黄酮5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(14)、5,7,4′-三羟基双氢黄酮7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(15)、丁二酸(16)、( )-儿茶素(17)、( -)-表儿茶素(18)、谷甾醇(19)和胡萝卜苷(20).应用波谱方法及与已知品对照进行结构鉴定.其中,化合物10、17和18是抑制血管紧张素转化酶的活性成分.表4参63     

芳香化合物羟基化酶研究进展

芳香族化合物的选择性羟基化是合成化学中最具挑战性的化学反应之一,特别是由于近年来羟基芳香族化合物在医学上作为前驱体使用,使其越来越受到重视.通过单一酶或者整个微生物细胞进行的生物催化氧传递,是完成芳香化合物选择性羟基化反应的一种有效方式,不仅在受污染环境的生物修复中作用重大,而且还可以替代并拓宽传统的化工合成工艺,广泛用于化工中间体的生产,这使得芳香化合物羟化酶成为重要的工业用酶之一.本文综述了芳香化合物羟基化酶的种类、作用机理及工业应用等方面的最新研究进展.图5表1参42     

变绿毛壳霉CIB608次级代谢产物及抗菌活性

抗菌活性筛选表明变绿毛壳霉(Chaetomium virescens CIB608)大米固态发酵乙酸乙酯提取物具有显著的抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)活性.为阐明抗菌活性物质基础,利用硅胶柱层析、反相C-18硅胶柱层析、高效液相色谱等分离技术以及核磁共振、质谱及液质联谱波谱分析手段对该菌的化学成分进行分离、分析和鉴定,并采用管碟法对部分化合物的抗菌活性进行评价.结果显示,变绿毛壳霉次级代谢产物种类丰富,共分离鉴定14个化合物,分别为7-methoxy-eugenitol(1)、eugenitol(2)、2,4-二羟基-3,6-二甲基-苯甲酸(3)、甲氧基柄曲霉素(4)、柄曲霉素(5)、二氢柄曲霉素(6)、奥佛尼红素(7)、nidurufin(8)、腺苷(9)、2′-甲氧基腺苷(10)、对羟基苯甲酸(11)、毛壳霉素(12)、毛壳霉素B(13)和毛壳霉素C(14).化合物12具有显著的抗菌活性,在浓度1.0μg/mL时对金黄色葡萄球菌仍具有显著抗菌活性.化合物13和14中的含有3个硫的硫桥键不稳定,分离纯化过程中会逐步脱掉1个硫,进而转化为化合物12.本研究表明变绿毛壳霉次级代谢产物种类丰富,化合物1为新的色原酮天然产物,化合物12为该菌的抗金黄色葡萄球菌物质基础;变绿毛壳霉CIB608可作为毛壳霉素类活性物质的重要来源.(图5表2参30)