六价铬还原细菌Bacillus cereus S5.4还原机理及酶学性质研究

从宝钢电镀污泥中分离得到1株六价铬还原细菌Bacillus cereus S5.4,在液体LB培养基中培养72　h完全还原2　mmol/L Cr⁶⁺.测定该菌株六价铬还原后细胞内外六价铬和总铬浓度,检测细胞各组分六价铬还原能力,并结合扫描电镜分析六价铬还原前后细胞形态的变化.结果表明,细菌的细胞壁膜能阻止六价铬进入细胞,是六价铬发生还原的主要场所,其通透性的改变将影响六价铬还原酶的作用;该菌株六价铬还原酶为非分泌型,在细菌细胞内侧发生作用.测定六价铬还原酶活性和稳定性：其最适温度范围25～37℃,最适pH 7,Cu2＋有增强六价铬还原酶活性的作用;在37℃,该菌株六价铬还原酶K_m为125.61 μmol/L,V_max为7.68 nmol/(min·mg).     

红豆杉内生真菌发酵培养基和原生质体制备酶系统的筛选

在对红豆杉内生真菌(Ozoniumsp.)适生碳源、氮源和生长情况研究的基础上,通过正交试验筛选了其发酵培养基和原生质体制备的酶系统;用L9(34)安排了四因素三水平并考虑交互作用的正交试验,对实验结果进行了分析.结果表明,最优的发酵培养基为果糖1%、蔗糖1%、蛋白胨0.2%、酵母粉0.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O0.3%、VB10.001%;分离原生质体的最优酶系统为1.5%溶壁酶 0.5%蜗牛酶 1.5%纤维素酶 1.0%溶菌酶;用此酶系统在30℃条件下酶解3h,原生质体的产量达6.55×107个/mL酶液;经荧光素二醋酸酯(FDA)染色评估原生质体活力,表明该条件下分离的原生质体活力较高,原生质体的再生率为2.56%.该研究为利用生物技术手段改良紫杉醇生产菌奠定了基础.图6表4参32     

废弃重组质粒DNA热处理效率的环境影响因素

为了解环境因素对质粒DNA热处理效率的影响以及热处理过程的有效性和安全性,以pET-28b质粒为材料,采用定量PCR技术结合质粒转化等方法分析了pH、NaCl、牛血清白蛋白(BSA)及EDTA浓度等因素对质粒DNA热处理的影响.结果表明,NaCl、BSA及EDTA的存在对热处理过程中的质粒DNA具有保护作用,且保护作用依次增强.在纯水中热处理30min后的质粒DNA可扩增的片段数仅是在0.1%的EDTA中热处理30min后质粒DNA可扩增片段数目的1.7%.由于生物实验室废水中通常含有上述有机或无机物质,因此,实际热处理过程中质粒DNA的降解半衰期可能远长于先前报道的2.7～4min,残留的转化活性也可能更高,这必须引起我们高度关注.但是,研究结果也表明,酸性条件下的热处理能加速质粒DNA的失活和降解,因此建议热处理过程可在弱酸性条件下完成,以强化其处理效果.     

重组质粒DNA在热处理过程中的降解/变性规律研究

生物实验室产生的废弃重组基因片段的排放是造成.基因污染"的途径之一.热处理是目前生物实验室处置废弃重组基因片段、核酸等物质的主要手段.以pET-28b质粒为材料,采用定量PCR技术结合电泳和质粒转化等手段分析了重组基因片段在热处理过程中的降解与失活规律,以及不同离子强度对重组质粒热降解的影响.结果显示,100℃热处理过程中质粒 pET28b 的降解随时间变化较为明显,降解半衰期约为2.7min;处理30min后仍存在具有转化活性的质粒;实验结果表明,100℃热处理后的废弃重组基因片段排入自然生态系统后仍存在基因转移的可能性.     

热处理重组质粒DNA的复性及其在水环境中的降解特性

为了考察热处理后的重组DNA进入水环境后可能存在的环境风险,以pET-28b质粒为材料,以质粒相对转化效率为指标,考察了热变性重组质粒DNA的复性可能性,并在此基础上构建了人工模拟水环境系统,研究了热变性质粒DNA在水环境中的降解速率和影响因素.结果表明,热变性pET-28b质粒经过30min后,其转移活性可以得到恢复,在4～37℃之间,温度越高越有利于热变性质粒的复性.热处理过程中未被降解的质粒DNA进入水环境后,在pH值为7、8时降解速率相对较慢,在pH值为5、6、9的条件下,降解较快,但在任何pH下,1.0h后仍存在未降解的质粒DNA.水环境中的NaCl对热处理质粒DNA有一定的保护作用,而且这种作用是随着NaCl质量分数的提高而增强.进入水环境中的热变性DNA有足够的时间复性,从而可能发生基因转移.因此,这些热处理的质粒DNA进入环境后理论上存在一定的生态风险.