废弃重组质粒DNA热处理效率的环境影响因素

为了解环境因素对质粒DNA热处理效率的影响以及热处理过程的有效性和安全性,以pET-28b质粒为材料,采用定量PCR技术结合质粒转化等方法分析了pH、NaCl、牛血清白蛋白(BSA)及EDTA浓度等因素对质粒DNA热处理的影响.结果表明,NaCl、BSA及EDTA的存在对热处理过程中的质粒DNA具有保护作用,且保护作用依次增强.在纯水中热处理30min后的质粒DNA可扩增的片段数仅是在0.1%的EDTA中热处理30min后质粒DNA可扩增片段数目的1.7%.由于生物实验室废水中通常含有上述有机或无机物质,因此,实际热处理过程中质粒DNA的降解半衰期可能远长于先前报道的2.7～4min,残留的转化活性也可能更高,这必须引起我们高度关注.但是,研究结果也表明,酸性条件下的热处理能加速质粒DNA的失活和降解,因此建议热处理过程可在弱酸性条件下完成,以强化其处理效果.     

重组质粒DNA在热处理过程中的降解/变性规律研究

生物实验室产生的废弃重组基因片段的排放是造成.基因污染"的途径之一.热处理是目前生物实验室处置废弃重组基因片段、核酸等物质的主要手段.以pET-28b质粒为材料,采用定量PCR技术结合电泳和质粒转化等手段分析了重组基因片段在热处理过程中的降解与失活规律,以及不同离子强度对重组质粒热降解的影响.结果显示,100℃热处理过程中质粒 pET28b 的降解随时间变化较为明显,降解半衰期约为2.7min;处理30min后仍存在具有转化活性的质粒;实验结果表明,100℃热处理后的废弃重组基因片段排入自然生态系统后仍存在基因转移的可能性.     

一种分离纯化降解性质粒DNA的简便方法

控制微生物对某些环境污染物降解的质粒——降解性质粒,分子量较大,难于和染色体DNA分离。超螺旋质粒DNA在热变性后冷却即快速复性方面与染色体DNA不同。根据此性质,作者改进了McMaster的和Kado的方法,获得了良好效果。实验证明。经此法纯化的质粒具有转化活性,是研究化学污染物的降解性质粒的简便方法。     

溶液pH对电助光催化氧化苯甲酰胺的影响研究

溶液pH是电助光催化氧化技术的重要影响因素.采用溶胶-凝胶法制备TiO2/Ti固定膜光催化剂,对苯甲酰胺进行电助光催化氧化降解,考察溶液pH对苯甲酰胺降解速率的作用规律及作用途径.结果表明,无论以Na2SO4还是以NaCl为支持电解质,苯甲酰胺降解的准一级反应速率常数(k)均先随初始pH增加而增加,达到最大值后,继续增加初始pH,k下降,即k随溶液初始pH的变化呈现"火山形"的曲线,存在最佳初始pH使k达到最大.在这2种支持电解质中,苯甲酰胺的准一级反应速率常数(k)达到最大值的溶液初始pH不同,以Na2SO4为支持电解质时最佳初始pH为5.6,以NaCl为支持电解质时最佳初始pH为9.8.分析表明,溶液pH对半导体的平带电位、半导体催化剂表面的物种吸附、以及羟基自由基的生成量等方面具有重要影响.综合考虑溶液pH对电助光催化氧化热力学和动力学过程的影响,可以合理解释溶液pH对苯甲酰胺降解速率的作用规律.     

热活化过硫酸钠处理水溶液及泥浆系统中1,1,1-三氯乙烷的研究

研究了热活化过硫酸钠技术氧化水溶液及泥浆系统中1,1,1-三氯乙烷(1,1,1-trichloroethane,TCA)的效果.考察了温度、溶液pH值、氯离子及碳酸氢根离子对水溶液中TCA降解过程的影响,并处理了实际TCA污染地下水.结果表明:TCA氧化降解过程符合准一级动力学反应方程,且温度越高TCA降解速率越大,50°C、过硫酸钠/TCA物质的量比=100/1时,TCA在2h内可完全降解;溶液pH值越高TCA去除效率越低,且碱性条件明显地抑制TCA降解;氯离子及碳酸氢根离子均会对反应起到抑制作用,其中碳酸氢根抑制作用强于氯离子;由于实际地下水水质较为复杂,TCA降解速率相对缓慢,7d后去除率达到90%以上.泥浆系统中TCA降解效率受土壤有机质含量影响较大,土壤去除有机质后降解速率明显加快.热活化过硫酸钠技术用于修复TCA污染地下水具有较大潜力,但实际应用过程中应充分考虑场地性质的影响.     

脱色酶TpmD在大肠杆菌中的高效表达及纯化

用PCR方法从嗜水气单胞菌DN322基因组中扩增出编码三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD的基因,与表达载体pET-22b(+)连接构建成重组质粒pET22-tpmD,转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组工程菌株.结果表明,经IPTG诱导,脱色酶基因可高效表达,粗酶液降解结晶紫、孔雀石绿、碱性品红、灿烂绿的比活力达到569.5,386.9,516.1,273.0U/g.表达产物经Ni-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度达94.05%.对4种染料的比活力分别达到1075.3,1042.8,903.9,484.3U/g,重组质粒稳定存在于工程菌中,便于规模化发酵生产.     

来自Bacillus circulans WZ-12的二氯甲烷脱卤酶基因dcmR的克隆和表达

通过PCR方法从Bacillus circulans WZ-12中分离到二氯甲烷脱卤酶基因dcmR,构建具T7强启动子的pET28b(+)-dcmR质粒,电击转化Escherichia.coli BL21(DE3),构建了二氯甲烷生物降解基因工程菌BL21[pET28b(+)-dcmR].重组菌经IPTG诱导后,表达蛋白占总蛋白的32%.表达蛋白的酶活最高可达25.78 U/mL,酶的比活(以蛋白计)为88.86 U/mg.重组菌周质中酶活2.92 U/mL,胞内酶活22.86 U/mL.重组菌产生的酶的活力和比活较原降解菌株高1~2倍.对工程菌的生长特性和降解特性的研究表明,工程菌在LB培养基中的生长特性与原始菌株没有差别,生长至对数期A600 nm值都可达2.4左右.重组菌株dcmR-1在25 h的降解率达90%以上,降解效率比原降解菌株有明显提高.该基因工程菌的构建对二氯甲烷生物降解机制研究以及复合污染环境的生物修复和工程应用具有实际意义.     

萘降解性质粒的筛选及其在炼油污水处理场中的转移

从炼油污水处理场活性污泥中分离到一株能以萘为唯一碳源的假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)S13。通过质粒接合转移、质粒消除以及分子杂交,证明假单胞杆菌S13降解萘的功能是由质粒编码的。应用膜扩散器在炼油污水处理场进行的现场试验证明,假单胞杆菌S13的萘降解性质粒,可在污水处理场里通过接合转移传递到另一个从同一环境分离的假单胞杆菌T9中去,并使后者获得利用萘的能力。这一结果表明,当条件合适时,降解性质粒可在自然环境里的细菌群体中扩散。     

BHC降解性质粒的研究

分离获得了一株对β-及γ-BHC均具有一定降解效果的Ⅱ_5-A菌株,该菌在好气条件下以BHC为唯一碳源。检测发现。它携带一个质粒。用丝裂霉素C进行的质粒消除试验表明,凡是消除了质粒的菌株,均丧失在以BHC为唯一碳源的无机盐培养基上的生长能力。该质粒经提取和纯化后,通过转化,成功地转移到大肠杆菌(Escherichia coli C600),使该转化子获得降解BHC的能力,并在转化子中检测出与原菌株电泳泳动度相同的质粒。因此,认为Ⅱ_5-A菌株降解BHC的基因是位于它所携带的质粒上。作者暂将此降解性质粒命名为BHC质粒,并编号为pWE1。     

接合子细胞强化对生物反应器降解2，4-D效应研究

研究了接合性质粒pJP4在2株纯菌E．coliDH5α、Alcaligenes sp．及好氧颗粒污泥混合菌群中的水平转移情况,并以获得pJP4质粒的接合子Alcaligenes sp．：：pJP4为强化菌种,考察了接合子细胞强化对好氧颗粒反应器和生物膜反应器中难降解有机物2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）的去除效应．结...     

鱼类虹彩病毒PCR快速检测试剂盒的准确度评价及其应用

虹彩病毒对鱼类等水生动物有广泛的感染性,给世界水产养殖业造成了巨大的经济损失.针对已研制成功的一种鱼类虹彩病毒PCR快速检测试剂盒,本文对反映其检测准确程度的灵敏性和特异性两个指标进行了检测,并在多个待测鱼样本中进行了试用.结果表明,该试剂盒的检测灵敏度相当于30个病毒粒子,无非特异性扩增反应,适用于多鱼种虹彩病毒病的早期快速诊断、苗种检疫以及水质环境的监测.     

水环境中铜离子有害性的DNA表征方法

利用琼脂糖凝胶电泳法研究了铜离子对超螺旋X174 RF DNA结构的影响. 铜离子浓度为10^-3 mol/L 和10^-4 mol/L 时,与DNA作用24h后,可直接使质粒DNA的超螺旋结构完全转化为其它结构. 低浓度铜溶液(10^-6 mol/L) 与DNA作用24h后,52%的超螺旋结构发生了转化. 48h时,69%的超螺旋结构转化为其它结构. 在铜离子浓度一定的条件下,随着二者相互作用时间的延长,DNA超螺旋结构逐渐开环,断裂直至完全消失. 作用时间一定的条件下,铜离子浓度越高,越容易开环断裂,形成其它结构. 铜离子浓度、铜离子与DNA作用的时间以及DNA各种结构百分含量之间具有一定的剂量-效应关系. 通过测定DNA超螺旋结构的这种变化有可能发展一种相对于同一标准的比较污染物环境有害性的方法.     

Effect of excessive cadmium chloride on the plasmids of E. coli HB 101 in vivo

１ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＣａｄｍｉｕｍｉｓｏｎｅｏｆｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｐｏｌｕｔａｎｔｓ．Ｉｔｉｓｖｅｒｙｔｏｘｉｃｔｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂａｒｂｅｒ，１９９４；Ｃｏｌａｒｄ，１９９０；Ｇｏｙｅｒ，１９９５；Ｎａｓｓｉｒｉ，...     

滇池和洱海湖滨带水生植被状况与水质的关系研究

在滇池和洱海的湖滨带各设置了6个具有不同水生植被状况的采样点,于2010年8月-2011年5月对水温、pH、ORP、电导率、营养盐(总氮和总磷)、叶绿素a及3种DNA病毒等水质指标进行了现场或采样分析。结果表明,两湖泊中营养盐含量高的湖滨带(滇池草海和洱海沙坪湾),由于水生植物覆盖度高,湖水保持了叶绿素a含量低的状态。对洱海湖滨带的水质分析结果表明,洱海水质有较明显的季节性变化。分析表明,与水温相比,营养盐浓度可能是影响藻类生物量的更重要的因素。3种DNA病毒检测结果初步表明,水生植物不仅能控藻,而且对病毒也有抑制作用。     

聚磷激酶基因在假单胞菌中的整合和表达

为了构建高效除磷的微生物,将来源于大肠杆菌的聚磷激酶基因(ppk)插入广宿主载体pBBR1MCS-2多克隆位点区,得到质粒pBBR1MCS-2-ppk.以该质粒为模板,通过PCR扩增出携带有载体启动子和终止子序列的ppk基因,插入自杀型质粒pUTmini-Tn5中得到重组质粒pUTmini-Tn5-ppk.pUTmini-Tn5-ppk经三亲接合作用进入Pseudomonas putidaKT2440,同时mini-Tn5通过转座作用将ppk整合到宿主菌株的染色体DNA中,获得基因工程菌Pseudomonas putidaKT2440-PPK,用于表达ppk.RT-PCR结果显示,ppk基因在KT2440-PPK中得到较高量的表达,而在原始菌株KT2440中表达微弱.人工模拟污水实验结果表明,接种1 h时KT2440-PPK中聚磷含量达到最大,为3.05 mg/g,约是对照菌株KT2440的15倍.测定模拟污水中磷酸盐的含量表明,KT2440-PPK可以去除该模拟污水中90%以上的磷酸盐.     

黄杆菌P3-2降解对硫磷的质粒

黄杆菌(Flavobacterium sp.)P3-2具有水解对硫磷农药的能力.该菌在L.B培养基或以乙酸、乙醇或甘油为碳源的合成培养基上能产生对硫磷水解酶.用碱裂解法从P3-2菌株中分离出一种质粒(PAR).P3-2菌株经丝裂霉素C处理后,消除质粒的原菌株丧失了产生对硫磷水解酶的性能.用蔗糖梯度离心纯化的质粒DNA经EcoRI和BamHI消化,分别产生16和2个DNA片段、以EcoRI消化λDNA产生的6个片段的分子量作标准,测得PAR质粒的分子量约为37.16×10~6 dalton.在电镜下观察呈环状的DNA分子.     

Amplification of plasmid DNA bound on soil colloidal particles and clay minerals by the polymerase chain reaction

Polymerase chain reaction(PCR)was used to amplify a 600-base pair(bp)sequence of plasmid pGEX-2T DNA bound on soil colloidal particles from Brown soil(Alfisol)and Red soil(Ultisol),and three different minerals(goethite,kaolinite,montmorillonite). DNA bound on soil colloids,kaolinite,and montmorillonite was not amplified when the complexes were used directly but amplification occurred when the soil colloid or kaolinite-DNA complex was diluted,10- and 20-fold.The montmorillonite-DNA complex required at least 100-fold dilution before amplification could be detected.DNA bound on goethile was amplified irrespective of whether the complex was used directly,or diluted 10- and 20-fold.The amplification of mineral-bound plasmid DNA by PCR is,therefore,markedly influenced by the type and concentration of minerals used.This information is of fundamental importance to soil molecular microbial ecology with particular reference to monitoring the fate of genetically engineered microorganisms and their recombinant DNA in soil environments.     

基于SCGE的五氯酚对稀有鮈鲫DNA损伤的研究

采用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术,研究了在不同的染毒时间内不同浓度的五氯酚(PCP)对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)血细胞和肝脏细胞DNA的损伤.结果显示,各PCP染毒组细胞彗星尾部DNA含量 (%DNAT) 和彗星尾长(TL) 显著增加,与空白对照组比较,差异极显著(P0.926,说明在实验浓度范围内, 存在显著的浓度-效应关系.在同一浓度下,随着暴露时间的增加,处理组%DNAT和TL逐渐增加,存在显著的时间-效应关系.由于PCP可引起稀有鮈鲫血细胞和肝脏细胞DNA的严重损伤,因此稀有鮈鲫血细胞和肝脏细胞DNA的损伤可作为PCP遗传毒性的指示.     

锑的淡水水质基准及其对我国水质标准的启示

针对我国锑水生生物水质基准缺乏的问题，收集筛选了锑对淡水水生生物的急性和慢性毒性数据，使用评价因子法、毒性百分数排序法和物种敏感度分布法分别推导我国锑的淡水水质基准，通过综合分析和比较，选择物种敏感度分布法推导的急性和慢性的水质基准值（466.62μg/L和88.71μg/L）作为最终的基准推荐值.通过与国内外现有锑相关水质标准进行比较，提出在我国相关水质标准修订中分别制定保护水生生物和人体健康水质标准的建议，避免水质标准对水生生物的"过保护"问题.