中药材哈蟆油PCR鉴定的初步研究

从中国林蛙 (Ranachensinensis)、中华大蟾蜍 (Bufogargarizans)以及鳕鱼 (Gadusmacrocephalus)等组织材料中提取DNA ,扩增出约 340bp的 12SrRNA基因片段 ,测定其序列 ,并参考有关序列 ,设计一对哈蟆油的鉴别引物HsmL1、HsmH1,用该鉴别引物扩增蛙类原动物的模板DNA时 ,只有中国林蛙和黑龙江林蛙的模板能得到阳性扩增 ,其余样品为阴性 .因此该对引物能用于哈蟆油药材来源的鉴别 .对购自 5个不同药材商店的哈蟆油PCR鉴定结果表明 ,现市售商品哈蟆油有不同的材料来源 .图 3表 1参 9     

濒危植物厚朴SSR引物筛选及反应体系优化

探索适宜厚朴(Magnolia officinalis)简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)-聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的最佳条件.在SSR引物筛选基础上,利用正交试验设计对影响PCR反应的5个因素(模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和Taq酶催化活性浓度)进行4个水平的优化,并通过温度梯度试验优化引物退火温度.在厚朴及其近缘物种的70对引物中,筛选出13对扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物.PCR各因素在不同水平下对反应体系的影响由大到小依次为引物浓度、Taq酶催化活性浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和模板DNA浓度.PCR最佳优化体系:25 μL体系中,模板DNA质量浓度为2 ng·μL-1,引物浓度为0.6μmol·L-1,Mg2+浓度为2.0 mmol·L-1,dNTPs浓度为0.5 mmol·L-1,Taq酶催化活性浓度为0.03 U·μL-1(1U=16.67 nkat).最佳扩增程序:94℃预变性4 min,94℃变性30 s,48.0～59.0℃(退火温度随引物不同而定)退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环后72℃延伸10 min.上述结果可为利用SSR-PCR技术研究濒危厚朴群体遗传学和分子生态学提供技术参数.     

Quantification of viable bacteria in wastewater treatment plants by using propidium monoazide combined with quantitative PCR (PMA-qPCR)

The detection of viable bacteria in wastewater treatment plants(WWTPs) is very important for public health, as WWTPs are a medium with a high potential for waterborne disease transmission. The aim of this study was to use propidium monoazide(PMA) combined with the quantitative polymerase chain reaction(PMA-qPCR) to selectively detect and quantify viable bacteria cells in full-scale WWTPs in China. PMA was added to the concentrated WWTP samples at a final concentration of 100 μmol/L and the samples were incubated in the dark for 5 min, and then lighted for 4 min prior to DNA extraction and qPCR with specific primers for Escherichia coli and Enterococci, respectively. The results showed that PMA treatment removed more than 99% of DNA from non-viable cells in all the WWTP samples, while matrices in sludge samples markedly reduced the effectiveness of PMA treatment. Compared to qPCR, PMA-qPCR results were similar and highly linearly correlated to those obtained by culture assay, indicating that DNA from non-viable cells present in WWTP samples can be eliminated by PMA treatment, and that PMA-qPCR is a reliable method for detection of viable bacteria in environmental samples. This study demonstrated that PMA-qPCR is a rapid and selective detection method for viable bacteria in WWTP samples, and that WWTPs have an obvious function in removing both viable and non-viable bacteria. The results proved that PMA-qPCR is a promising detection method that has a high potential for application as a complementary method to the standard culture-based method in the future.     

引物选择对污泥微生物多样性分析的影响

研究不同引物对PCR-DGGE和PCR-RFLP技术分析污泥群落结构的影响,选取8对通用引物扩增16S rDNA不同可变区序列并对细菌多样性进行DGGE分析,也选取11对通用引物扩增16S rDNA片段并对细菌多样性进行RFLP分析.通过分析PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱、DGGE图谱和酶切图谱,评价不同引物的扩增效果及其对污泥群落多样性的表征能力.结果表明,采用不同引物进行污泥群落结构DGGE分析或RFLP分析时,污泥群落多样性差异显著.PCR-DGGE分析中,引物B341F/B534R(V3区)分析效果较好,条带较丰富,能够充分反映污泥群落多样性.PCR-RFLP分析中,引物27f/8f和1500R扩增效果较好,酶切位点较多,酶切图谱条带丰富,差异性显著,能够充分表征污泥群落多样性.因此,活性污泥细菌多样性分析时,PCR-DGGE分析较优的引物为B341F和B534R,PCR-RFLP分析较优的引物为27f/8f和1500R.     

石油烃厌氧降解关键基因masD和bamA的实时荧光定量PCR检测方法与应用

masD和bamA是控制石油烃厌氧降解的关键基因,利用实时荧光定量PCR技术检测masD和bamA基因具有简便快速和易操作等优点.但目前所用方法存在扩增效率低,方法灵敏度较差的问题.本文根据引物设计原则,利用Allele ID6软件重新设计了扩增masD和bamA的实时荧光定量PCR引物,将质粒DNA进行8次10倍梯度稀释后构建实时荧光定量PCR标准曲线.优化后的体系（20μL）为：FastStart Essential DNA Green Master 10.0μL,上下游引物各0.4μL,RNase-Free Water 4.2μL,5.0μL DNA模板.利用新设计的引物扩增masD和bamA基因的最适退火温度分别为61℃和57℃.优化后的检测方法扩增效率提高至97.5%和71.2%,比文献报道的方法提高了7.6%—44.5%,具有更高的重复性和灵敏度.利用设计的引物对陕北5个地区石油污染土壤中的masD和bamA基因进行定量检测结果表明,石油污染土壤中普遍存在着控制石油烃厌氧降解的关键基因,所测定的土壤中bamA降解基因的拷贝数远高于masD降解基因.     

几株亚硝化菌的筛选及初步鉴定

通过富集培养获得了几株自养型氨氧化菌，在进行形态学和生化检验之后，又设计了几对引物，以扩增亚硝化菌的特征性基因Amoa。试验表明，不同菌株采用不同引物，均扩增出了预期片段，所以可初步断定，所筛选到的菌种确为亚硝化菌。     

环境水体中肠道病原细菌定量PCR检测与膜过滤分析方法的比较

采用通用引物,通过实时荧光定量PCR方法(QPCR),对西安市5个地表水体中肠道病原细菌的细胞密度进行了分析.检测水样体积为100mL,分别于2006年3～6月取自水源水(黑河)、景观娱乐用水(大唐芙蓉园北湖和兴庆湖)、纳污河(浐河)和未消毒的二级出水(北石桥污水处理厂),并将QPCR检测结果与滤膜法(MF)测得的细菌总数、大肠菌群和粪大肠杆菌CFU结果进行了比较分析.5个水体(n=60)检测结果显示,QPCR检测结果是大肠菌群CFU的2.2～5倍,是粪大肠杆菌CFU的7～14倍.病原细菌检测的几何平均值范围,QPCR法在25～67000 CCE·100mL-1之间,MF法大肠菌群在3～45000 CFU·100mL-1之间,粪大肠菌群在0～3000 CFU·100mL-1之间(n=60).两种方法的检测结果使用Spearman秩相关法来计算,结果显示,QPCR检测结果与大肠菌群、细菌总数以及粪大肠杆菌CFU均呈现显著正相关,秩相关系数分别为r=0.983、r=0.908和r=0.948.     

甘蔗SCoT-PCR反应体系优化与多态性引物筛选及应用

目标起始密码子多态性(Start condon targeted polymorphism,SCoT)分子标记是一种新型的标记,结合了ISSR标记和RAPD标记的优点.本研究针对SCoT-PCR反应体系的影响因素,以甘蔗叶片DNA为材料,在单因子实验的基础上,采用L16(45)正交实验设计,进一步探讨了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物及Taq酶等5个因素对甘蔗SCoT-PCR扩增效果的影响,建立了甘蔗SCoT-PCR的优化反应体系.25μL PCR反应混合液中,含50 ng DNA模板、2.0μL 10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)、0.625 U Ex Taq酶,dNTP和引物的终浓度分别为0.22 mmol/L和0.9μmol/L.以我国种植面积最大的栽培品种新台糖22号为模板,应用优化体系,对40条SCoT标记引物进行测试,筛选出16条有效扩增的引物,且均为多态性引物,其GC含量在50%～67%之间.该体系的稳定性和SCoT标记引物的扩增能力,通过基于随机选择的4条引物对9份具有地理来源和遗传背景不同的甘蔗种质进行标记分析来验证,结果共扩增出84条带,其中多态性条带占82.14%,平均单条引物可扩增出21条.研究结果为在甘蔗上进一步开发和应用功能性SCoT标记奠定了基础.     

环境水体中肠道病原细菌的定量PCR检测

采用通用引物,通过实时荧光定量PCR方法(QPCR),对西安市5处地表水体中肠道病原细菌的细胞密度进行4个月的连续检测,并将QPCR检测结果与滤膜法测得的大肠菌群CFU值进行比较分析.结果显示, QPCR法可信度为94%,最小检测值为每管未稀释DNA提取物含2.7个大肠杆菌细胞.5个水体(N=60)检测结果表明, QPCR检测结果是大肠菌群CPU的2.2～5倍.病原细菌的几何平均值范围, QPCR法在25～67 000 CCE/100 mL之间, MF法大肠菌群为3～45 000 CFU/100 mL之间.2种方法的离散和回归分析表明, QPCR检测结果与大肠菌群CFU显著正相关,秩相关系数为r=0.983.     

松材线虫PCR标准化阳性对照构建及检测体系的建立

建立了松材线虫PCR检测标准化阳性对照及特异性强的PCR检测体系.根据松材线虫rDNA-ITS区和BxPe12基因的特异基因序列设计引物,并从中筛选出一对特异引物cqubs01/cquba01,该引物能从松材线虫特异性扩增出196 bp片段,而不能对其他种类线虫进行扩增.基于优化PCR反应体系和反应程序,稳定的检测体系得以建立,检测灵敏度为100 ps/μL.以松材线虫基因组DNA为模板,以上述特异引物进行PCR扩增,将纯化后的PCR产物与PMD18-T载体连接之后转入大肠杆菌中,筛选出阳性克隆进行测序验证,最终获得了松材线虫的无害化阳性对照,建立了松材线虫标准化阳性对照的PCR检测体系.对来自于不同地区的12批次近100个样品进行了实际检测验证,其结果与实际发生情况一致,说明本检测体系稳定可靠.图3表2参8