温度和pH值对重组杆状病毒(AcMNPV-BmKIT-Chi)的毒力影响

研究了温度、酸碱度对重组杆状病毒(AcMNPV-BmKIT-Chi)毒力的影响.结果显示,多角体病毒在温度4~50℃,pH6.0~8.0范围内可以保持较高的毒力稳定性;不同虫龄棉铃虫幼虫对重组病毒的毒力敏感性差异显著,低虫龄对重组核型多角体病毒更为敏感;病毒对幼虫存在亚致死作用,饲毒组与对照组幼虫体重差异显著.图3表3参13     

腺病毒气溶胶的实时荧光定量PCR检测和绿色荧光蛋白活细胞检测

将带有绿色荧光蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,作为模拟病毒建立一种检测病毒侵袭力的方法.在钢化玻璃箱中通过TK-3型微生物气溶胶发生器将腺病毒形成气溶胶,用FA-1型多级撞击式空气微生物采样器进行气溶胶采样,对采样样品分别进行实时荧光定量PCR检测和表达了绿色荧光蛋白的PK15活细胞定时检测.实时荧光定量PCR检测可测定病毒在大气中存在的相对基因拷贝数,通过在荧光显微镜下计数带绿色荧光的PK15细胞数可直观检测病毒的感染力及活力.结果表明,重组腺病毒气溶胶主要分布在采样器第五级,腺病毒气溶胶与病毒粒子相比较大.     

基因工程菌漆酶对蒽醌染料的脱色研究

利用基因工程菌甲醇毕赤酵母(PMAD16/pMETαA-Lcc1)培养产生的重组漆酶,研究了重组漆酶对蒽醌染料Remazol Brilliant Blue R脱色的影响。结果表明:重组漆酶对蒽醌染料RBBR脱色的最佳pH值为4.5,温度为45℃,当溶液中漆酶活力为10.0U/mL时,在最适脱色条件下作用14h,粗漆酶和纯化漆酶对蒽醌染料RBBR(80mg/L)的脱色率分别为95.2%和87.5%,重组漆酶可有效地使蒽醌染料RBBR脱色。     

全氟辛基磺酸及其替代产品的内分泌干扰效应评价

为研究全氟辛基磺酸(PFOS)及其替代品的内分泌干扰效应,将重组人雌激素/雄激素/孕激素/甲状腺激素/维甲酸受体基因的双杂交酵母暴露于不同浓度的PFOS及替代品中,并结合体外代谢活化技术检测直接和间接的类/抗激素活性。结果表明,被替代品PFOS表现为雄激素受体、甲状腺受体和维甲酸受体拮抗剂,且在代谢活化后新增了雌激素受体拮抗效应,其半数效应浓度(EC₅₀)在3.0×10^-4～4.8×10^-3 g·L^-1之间;同时,4种替代化学品没有任何效应检出,说明不会通过与核受体结合干扰天然激素的正常功能。研究结果说明,与原化学品相比,替代产品的应用在内分泌干扰效应方面可能具有更低的环境风险。     

产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB)的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最重要的用途是作为合成聚酯PTT的单体.由于微生物发酵法生产1,3-PD具有操作简单,不易产生有毒副产物等特点,已得到广泛关注.本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用温控表达载体pBV220串联构建了重组质粒pBV220-yqhD-dhaB,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB).该重组菌在LB培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得胞内甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力分别达到260 U/mg蛋白和140U/mg蛋白;在含甘油40 g/L的发酵培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得发酵液中1,3-PD含量为8.5 g/L.这将为进一步构建基因工程菌生产1,3-PD打下坚实的基础.图6表1参18     

基于H4IIE细胞株测试间接雌激素效应物质的代谢活化方法

利用鼠肝癌细胞(H4IIE)代谢活化环境样品中间接雌激素效应物质的方法,以标准化合物双酚A和北方某污水处理厂各工艺过程的水样以及南方某水厂自来水样的有机提取物为对象,比较了代谢活化作用对雌激素效应检测结果的影响.研究结果表明,双酚A代谢活化产物的雌激素活性明显高于双酚A;环境样品中存在大量的间接雌激素效应物质,通过细胞代谢活化的方法能够检出其活性.因此,推荐将鼠肝癌细胞代谢活化与重组基因酵母检测的方法相结合,用于环境样品中直接和间接雌激素效应物质的检测.     

顺丁烯二酸异构酶工程菌发酵条件优化

为提高重组大肠杆菌中顺丁烯二酸异构酶表达量,通过正交试验设计,对工程菌的生长条件和目的蛋白可溶表达条件进行优化.采用250 mL三角瓶中装有50 mL(Amp 100 mg L-1)的培养基,分别研究培养基中葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉的浓度,培养基pH值以及摇床转速、装液量、接种量等对蛋白可溶表达量的影响.确定顺丁烯二酸异构酶工程菌最优化培养基为:蛋白胨20 g L-1、酵母浸粉2.5 g L-1、K2HPO4·3H2O 3.0 g L-1、KH2PO4 1.5 g L-1、NaCl 6 g L-1、MgSO43 g L-1,培养基pH调至6.5.确定顺丁烯二酸异构酶工程菌可溶性表达最优条件为:37℃下培养至D600 nm值为1.0时,添加终浓度为0.05 mmol L-1的IPTG进行诱导,诱导温度37℃,摇床转速220 r min-1,装液量20%,接种量5%,诱导时长为6 h.利用BioFlo 415发酵罐以最优化的培养基和发酵条件对该工程菌进行了3批发酵实验,与摇瓶实验相比,顺丁烯二酸异构酶的表达量提高了近1.5倍,单位发酵液的酶活力由46 U mL-1发酵液提高到78 U mL-1发酵液.以上数据为顺丁烯二酸异构酶重组工程菌的中试发酵奠定了基础.图7表2参17     

环境雌激素的生物检测与应用

环境雌激素问题已成为环境领域的研究热点。因此,建立简单快速有效的检测方法显得尤其重要。目前对污染物雌激素效应的测评主要依赖于生物学方法,文章主要介绍了子宫生长实验、肝细胞卵黄蛋白原生成实验、人乳腺癌细胞(MCF-7)增值实验、重组基因酵母实验、酵母双杂交实验五种主要的环境雌激素生物检测方法及其在国内外环境激素测评中的应用现状。     

β-甘露聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达

从Bacillus subtilis JNA 3-10中克隆出β-甘露聚糖酶基因成熟肽链编码序列manA1和含信号肽的β-甘露聚糖酶基因manA2,在B.subtilis 168中克隆表达,分别筛选获得高效分泌表达β-甘露聚糖酶的重组菌株BPM1001(pMA5-manA1/B.subtilis 168)和BPM1002(pMA5-manA2/B.subtilis 168),结果表明菌株BPM1002总酶活力是菌株BPM1001的9.65倍,是原始菌株的13.1倍.在基因manA2下游引入His序列克隆出β-甘露聚糖酶基因manA3,获得枯草芽孢杆菌168重组菌株BPM1003.采用Ni-NTA柱纯化重组菌株BPM1003分泌表达的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质,该酶促反应的最适pH为6.5,最适温度为65℃,在37℃条件下保存一个月酶活力依然保留有77.8%.5 L发酵罐放大实验结果表明魔芋粉对于产β-甘露聚糖酶具有明显的诱导作用,酶活力最高可达2 748.82 U/mL.图9表3参19     

松花江吉林段土壤有机组分的雄激素干扰效应

利用重组AR(雄激素受体)基因酵母,结合土壤样品索氏提取、富集和净化方法,开展松花江流域吉林段土壤有机组分雄激素干扰效应及其分布特征研究. 结果表明:所有样品均未检测出显著的AR诱导活性;部分样品检测出AR抑制活性,检出率为62.50%,最大抑制率为61.74%;采用RIC20(抑制率为20.00%时,96孔板每孔所需要的土壤当量,单位为mg/well)表征样品的抑制活性,RIC20在1.01~9.03 mg/well之间, 表明松花江吉林段土壤中存在AR抑制活性物质,可能具有潜在的环境危害. 研究区土壤雄激素干扰效应的分布特征表明,干扰效应分布与产业布局呈一定的相关性;工业区的AR抑制活性明显高于农田区,表明化工原料及产品的生产和使用及工业废水的排放可能是该地区土壤中AR抑制活性的重要来源.