朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的原核表达及其活性分析

乙酰胆碱酯酶(ACh E)在神经信号传导过程中起重要作用,是氨基甲酸酯类和有机磷类农药的主要作用靶标.对朱砂叶螨ACh E进行体外表达和纯化,并分析其活性.将朱砂叶螨ace基因序列插入到原核高效表达载体p ET-30a中,构建表达载体p ET-30a/ace,转入表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG诱导高效表达;镍柱纯化目的蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定目的蛋白;以纯化的螨ACh E为抗原制备抗螨ACh E特异性抗体;改良的Ellman法测定螨ACh E活性.结果获得了相对分子质量(Mr)约为68×103的较高纯度的螨ACh E蛋白,检测大部分为可溶性表达,酶活检测具有乙酰胆碱酯酶活性,并制备了107效价的抗螨ACh E特异性抗体.采用重组ACh E(IC50=5.4 mmol/L)检测毒扁豆碱抑制活性比螨粗酶液(IC50=58.7 mmol/L)灵敏度提高11倍.本研究构建了螨ACh E体外高效表达载体并获得了具有较好活性的重组螨ACh E,可为抗ACh E杀螨剂的体外高通量筛选和以ACh E为靶标的农药残留检测奠定基础.     

粘红酵母△12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

Δ12-脂肪酸脱氢酶一般特异性催化在油酸的Δ12位引入双键转变成亚油酸.为了从粘红酵母YM25079中克隆全长Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列,参考已知的Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列设计基因特异性引物,通过PCR扩增获得到全长为1 353 bp的c DNA序列,序列分析结果表明该序列具有一个编码450个氨基酸的完整开放阅读框,所编码蛋白质的大小为50.9×103.与报道的Δ12-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区,表明该序列为一个新的编码Δ12-脂肪酸脱氢酶的基因.为了验证其功能,把开放阅读框序列亚克隆到表达载体p YES3/CT,构建重组表达载体p YRGD12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达.脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,该序列所编码的蛋白质具有Δ12-脂肪酸脱氢酶活性,能将油酸转化为亚油酸,亚油酸的含量占酵母总脂肪酸的4.31%.以上结果表明,PCR所获得序列是新的Δ12-脂肪酸脱氢酶基因.     

冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)过表达载体的构建及鉴定

为构建携带冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)的过表达载体,首先从4℃条件下冷处理8 h的SD大鼠睾丸组织中获得CIRP基因的c DNA序列,然后扩增CIRP基因的编码区,将其克隆到真核表达载体p Lenti6/V5中,酶切鉴定并测序.将克隆成功的质粒转染HEK293T细胞,用Western blot检测CIRP的表达水平.成功扩增CIRP编码区,并将其克隆至载体p Lenti6/V5中;当将CIRP过表达载体转染HEK293T细胞后,Western blot检测结果显示CIRP蛋白表达水平明显增加(P<0.01).本研究成功构建了CIRP过表达载体,为进一步研究CIRP的作用机制提供了基础工具.     

Evolution characteristics and transcriptional responses to multiple stresses of NAC genes in Chenopodium quinoa and its ancestral diploid species北大核心CSCD

NAC是一类广泛参与调控植物在生物和非生物胁迫下防御应答的转录因子.基于系统的比较基因组学研究方法,对藜麦Chenopodium quinoa的NAC基因进行进化与多个生物和非生物逆境下的应答研究.在藜麦C.quinoa、祖先二倍体Chenopodium pallidicaule和Chenopodium suecicum基因组中分别共鉴定得到106、54和54个NAC基因.染色体定位数据表明藜麦基因组中18个NAC基因涉及串联倍增事件.3个物种NAC基因的系统进化树证明藜麦基因组中存在NAC基因的倍增与丢失.藜麦分别和C.pallidicaule和C.suecicum之间同源基因组模块的对应数目关系进一步证明藜麦保留了相当数量的祖先二倍体NAC基因,是其NAC基因倍增的主要动力.此外,藜麦NAC基因在干旱、高温、盐、低磷胁迫和GCFSV侵染下的表达模式被阐明;大量NAC基因被显著地诱导表达,推测其参与了藜麦在生物和非生物胁迫下的防御应答反应.本研究结果为藜麦的遗传育种提供了优良的候选NAC基因.(图7参26)     

真菌对磺胺二甲氧嘧啶降解过程的转录组分析及差异表达基因的功能分析

采用黄孢原毛平革菌降解磺胺二甲氧嘧啶（SDM）,4 d后SDM的去除率达74%,降解速率达3.24 mg·L^-1·d^-1.采用Illumina高通量测序平台对降解SDM后的菌株与对照组菌株进行测序,通过GO和KEGG富集分析,得到的差异表达基因能显著富集到与降解相关的“氧化还原酶活性”途径,及与应激反应有关的“ABC转运体”路径.通过对高表达高上调的差异表达基因的筛选与分析,得到了耐受和降解SDM的功能基因.水通道蛋白、ABC转运蛋白及甲基转运酶基因等在黄孢原毛平革菌对环境的耐受中起到重要的作用.乙醇氧化酶、细胞色素P450和糖苷水解酶等在黄孢原毛平革菌对SDM的降解中起着关键的作用.本文从转录组水平分析了SDM的降解机制,为黄孢原毛平革菌在环境修复中的应用提供一定的参考.     

青海农用沼气池微生物群落结构及差异基因功能分析

文章以产气性能不同的青海农用沼气池为研究对象,利用宏转录组学技术分析了温度最高和最低时期污泥样品的微生物组成、差异基因表达及代谢过程。物种注释表明4个样品中最优势的种类均为细菌,且较优势类群有假单胞菌属(Pseudomonas)、硫单胞菌属(Sulfurimonas)、海螺菌属(Marinospirillum)和拟杆菌门未分类属(norank_p__Bacteroidetes)。差异基因的筛选结果表明产气性能不同的沼气池样品具有更多的差异基因。通过KEGG pathway富集分析发现,产气好样品的代谢通路表达量更大,且对碳水化合物和氨基酸的利用率及产能更高。同时,参与氨基酸代谢、核苷酸代谢、碳水化合物代谢以及能量代谢等过程的差异表达基因显著富集,说明这几种代谢途径在青海农用沼气池微生物的代谢过程中占据重要地位。4个样品两两比较可知,产气性能不同的比较组差异基因注释到的代谢通路更多,且微生物及其代谢的差异更大。     

苏云金芽孢杆菌无质粒突变株BMB171的转化和表达性能

研究了苏云金芽孢杆菌无质粒突变株ＢＭＢ１７１的转化性能和表达ｃｒｙ１Ａｃ和ｃｒｙ１Ｃａ基因的性能．用ｐＨＴ３１０１、ｐＢＭＢ３０５、ｐＢＭＢ１７３６、ｐＢＭＢ６７１、ｐＢＴＬ１和ｐＨＶ１２４９等６种外源质粒电转化无质粒突变株ＢＭＢ１７１,其转化频率分别是Ｂｔ４Ｑ７、Ｂｔ４Ｄ１０和Ｂｔｉ．ＩＰＳ．７８／１１等３种常用受体菌相应最高转化频率的１０００、６．７、１２．５、６６．７、３５００和２倍,其每μｇＤＮＡ的最高转化子数达１０７．导入ＢＭＢ１７１的外源质粒的稳定性与其复制子类型和质粒大小有关．无质粒突变株ＢＭＢ１７１表达ｃｒｙ１Ａｃ基因的表达量高于对照受体菌Ｂｔ４Ｑ７,略低于Ｂｔ４Ｄ１０和Ｂｔｉ．ＩＰＳ．７８／１１,而ＢＭＢ１７１表达ｃｒｙ１Ｃａ基因的表达量高于这３种受体菌;对小菜蛾３龄幼虫和甜菜夜蛾初孵幼虫的毒力测定结果表明,ＢＭＢ１７１表达ｃｒｙ１Ａｃ基因的杀虫毒力高于Ｂｔ４Ｑ７和Ｂｔ４Ｄ１０,略低于Ｂｔｉ．ＩＰＳ．７８／１;而表达ｃｒｙ１Ｃａ基因的毒力高于这３种受体菌     

苏云金芽孢 力无质粒突变株BMB171的转化和表达性能

研究了苏云金芽孢杆菌无质粒突变株ＢＭＢ１７１的转化性能和表达ｃｒｙ１Ａｃ和ｃｒｙ１Ｃａ基因的性能,用ｐＨＴ３１０１、ｐＢＭＢ３３０５、ｐＢＭＢ１７３６、ｐＢＭＢ６７１、ｐＢＴＬ－１和ｐＨＶ１２４９等６种外源质粒电转化无质粒突变株ＢＭＢ１７１,其转化频率分别是Ｂｔ－４Ｑ７、Ｂｔ－４Ｄ１０和Ｂｔｉ．７８／１１等３种常用体菌相应最高转化频率的１０００、６．７、１２．５、６６．７、３５００和２倍,其每μｇ     

1,3-二苯胍对斑马鱼早期生命阶段的影响

1,3-二苯胍(1,3-diphenyl guanidine, DPG)是橡胶生产过程中添加的硫化促进剂,在水环境中广泛存在。然而作为水环境中的一种污染物,目前DPG对水生生物的毒性及其机制的研究极为匮乏。为了研究DPG对水生生物的生殖发育毒性及潜在机制,选择水生模式生物斑马鱼(Danio rerio)作为受试生物。将斑马鱼胚胎分别暴露于浓度为30、100和300μg·L^-1的DPG溶液中120 h,通过转录组测序、基因表达水平定量分析及性激素水平测定(雌二醇和睾酮)来探究其对斑马鱼早期生命阶段的生殖发育毒性及机制。转录组测序结果表明,DPG暴露可以显著影响与精卵识别及生殖细胞发育相关的生物学过程。DPG暴露使类固醇合成通路相关基因(cyp11a1、cyp17a1、cyp19a1a、hsd17b1、ar)的转录表达显著上调。激素结果表明DPG暴露导致斑马鱼仔鱼体内雌二醇水平显著升高。以上研究结果表明,在分子水平上,DPG能够影响斑马鱼胚胎及仔鱼的发育,但是在个体水平上仍然缺乏直接的证据揭示DPG暴露对斑马鱼生殖和胚胎发育的不良结局。本研究为DPG对水生生物的毒性研...