地衣芽孢杆菌2709和 6816碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及序列分析

用PCR方法从地衣芽孢杆菌 2 70 9和 6 816中扩增了碱性蛋白酶基因 (apr1和apr2 ) ,扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体 pET -2 8a中 ,构建成重组分泌型表达载体pAPR1、pAPR2 .pAPR1、pAPR2中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM 10 9(DE3)中得到表达 .SDS -PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为 30 .5× 10 3 ,同核酸序列测定所推导的值相符 .表达产物分别占细胞总蛋白的 8.0 %和 7.5 % .2 70 9重组菌所得酶活为 12 10u/mL ,6 816重组菌所得酶活为 1175u/mL .研究发现 ,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时可能存在前肽自动脱落的现象 .同时 ,对地衣芽孢杆菌 2 70 9碱性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析 ,发现与地衣芽孢杆菌 6 816碱性蛋白酶基因的同源性为 98% .图 5参 11     

一株降解除草剂膦化麦黄桐(PPT)菌的筛选与鉴定

从喷洒有除草剂的土壤中分离到一株能分解膦化麦黄桐(PPT)的细菌.该菌在以PPT为唯一碳源的培养基上生长,能利用PPT的最高浓度为2. 7g/L.采用常规生理生化鉴定方法,并结合16SrDNA序列分析法对该菌进行鉴定.结果表明,该菌与生癌肠杆菌(Enterobactercancerogenus)序列相似性为99. 3%,在细菌分类学上属于肠杆菌.将它命名为Enterobactersp. PPT. 图4表2参7     

根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化

通过构建质粒pCAM3300-zeocin,将其电击转化到根癌农杆菌LBA4404中.将含有目的质粒pCAM3300-zeocin的根癌农杆菌和工业化产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5共培养,利用zeocin抗性基因为筛选标记,实现了pCAM3300-zeocin对产甘油假丝酵母的转化.并根据产甘油假丝酵母的生长特性,对转化条件进行了优化,在共培养时间为24h,产甘油假丝酵母和根癌农杆菌的细胞比例为1∶(500～1000)时最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞.初步建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的转化方法.     

gsh1基因的克隆及其在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthetase)编码基因gsh1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastorisx-33,构建了重组菌P.pastorisx-33(pGAPZA-gsh1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性转化子,并通过PCR进行了验证.对阳性转化子的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶酶活力进行了测定,结果显示,重组酵母的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶的酶活是宿主菌的3.0倍,在液体YEPD中重组菌GSH的产量为42.2mg/L,是宿主菌的1.6倍.图7表1参10     

湖流域土壤微生物基因组总DNA分离纯化及其质粒文库的初步构建

采用研磨／冻融和SDV蛋白酶K热处理以及CTAB处理等理化方法，直接从太湖流域土壤样品中抽提得到微生物总基因组DNA，所得粗DNA用透析袋法以及Nucleaotrap suspension DNA纯化试剂盒进行了纯化，纯化过的DNA能够满是常用限制性内切酶酶切、细菌16S rDNA通用引物和随机引物进行PCR扩增的要求，将所得纯品DNA经过EcoRI部分酶切之后与酶切并脱磷酸的pSK^ 空载体连接，再以大肠杆菌JM109为宿主细胞初步构建了土壤微生物基因组文库，图6参7     

克雷伯氏菌产1,3-丙二醇菌株选育及甘油脱水酶基因转录分析

通过对野生克雷伯氏菌(Klebsiella)进行紫外诱变,获得一株耐高浓度甘油及高浓度1,3-丙二醇的突变菌株A-39-3,该突变株产1,3-丙二醇的量较野生菌株提高了58%,副产物2,3-丁二醇和乙醇的量分别降低了27%和19%.为探讨突变株高产1,3-丙二醇的原因,通过对突变菌株发酵过程中关键酶的酶活跟踪分析,发现1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的酶活力与野生菌株相差不大,甘油脱氢酶(GDH)的酶活力略有下降,而突变菌株的甘油脱水酶(GDHt)的酶活力明显高于野生菌株.并采用半定量RT-PCR方法,从转录水平上比较甘油脱水酶基因的差异,结果发现突变菌株A-39-3甘油脱水酶基因的相对mRNA转录水平是野生菌株K的2.58倍,分析说明该突变株1,3-丙二醇产量的提高与关键酶基因dhaB的mRNA转录水平关系密切.     

产甘油假丝酵母补料发酵中的甘油合成衰减

为揭示产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes补料发酵后甘油合成衰减机理,以指导甘油合成及菌株改造,对补料发酵后甘油的生成情况、葡萄糖的消耗情况、细胞内的代谢流量变化以及代谢途径关键酶活力变化进行了研究.结果表明,补料发酵后葡萄糖的代谢流量分布发生变化,流向HMP途径和甘油合成途径的流量分别降低48%和33%,更多的碳流通过EMP途径形成副产物;胞浆3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)的活力下降,而丙酮酸激酶(PYK)活力上升.补料发酵后甘油合成关键酶ctGPD酶活力低下,流向甘油合成途径的碳流减小,还原力供给受影响,这些因素共同作用引起了补料发酵后甘油合成的衰减.