DNA同源性分析最终确定新疆中华根瘤菌（Sinorhizobium xinjiangensis）为一独立种

针对S.xinjiangensis分类地位的争议，从新疆再次分离获得34株快生大豆根瘤菌，在16SrDNAPCR-RFLP分析和SDS全细胞蛋白电泳分群的基础上，进行了16SrDNA全序列相似性和DNA同源性分析.所测4个菌株和S.fredii模式菌株USDA205的16SrDNA全序列有很高的相似性.而DNA同源性分析说明新分离的菌株代表与原定的S.xinjiangensis为一个DNA同源群.其模式菌株CCBAU110与S.fredii的2株参比菌株USDA194、2048之间的DNA同源性分别为31.5%和28.7%.S.fredii的模式菌株USDA205与新分离的菌株代表及原定的S.xinjiangensis的模式菌株和2个参比菌株之间的DNA同源性为20.8%～39%，远低于70%.属于种水平上的差异.按照国际细菌分类委员会以DNA同源性≥70%且△Tm≤5℃作为定种的标准，S.xinjiangensis是Sinorhizobium属中不同于S.fredii的一个独立的种.表3参20     

豆科树种刺槐、黄檀、合欢根瘤菌的数值分类及16S rDNA-PCR RFLP研究

测定了从豆科树种刺槐、黄檀、合欢根瘤中分离获得的51个菌株与18株参比菌株的唯一碳源、氮源利用，抗生素抗性，耐逆性和酶活性等132个表型性状，并用MINTS软件进行聚类分析，结果表明，全部供试菌株在59％的相似性水平上分为两大群：一个各为慢生菌群，另一群为快生和中慢生菌群，在85.1%的相似性水平上分为5个亚群，其中亚群4不与任何已知参比菌株聚在一起，可能为新种。同时，表型性状测定结果发现某些菌株对抗生素（300μg／mL）、温度（40℃）有较强抗性，大多数菌株能在较宽的pH值范围内生长（pH5-12），这些具有抗逆特性的菌株为我国西部大中种植豆科植物接种适宜的根瘤菌提供了宝贵的种质资源，在数值分类的基础上，又对47株菌进行了16S rD-NA-PCR RFLP分析，经SPSS软件聚类后，划分为7个亚群，在较大类群的划分上，与数值分类的结果有较好的一致性，16S rDNA-PCR RFLP遗传图谱共有30种类型。表型及遗传型分析结果表明，豆科树种根瘤菌具有极大的多样性，图2表2参14。     

慢生根瘤菌交叉结瘤及其系统发育关系的研究

选用包括6株花往根瘤菌[Bradyrhizobium sp.(Arachis)]在内的13株慢生根瘤菌，进行了6种豆科植物结瘤试验及共系统发育分析。研究结果表明，慢生根瘤菌与试验的豆科宿主植物间普遍存在交叉结瘤，还发现有些菌株在原宿主外的豆科植物根部形成类根瘤的现象。16S rDNA和23S rDNA的PCR－RFLP分析揭示出这些菌株rDNA基因的差异性，不同宿主来源的慢生根瘤菌株可以同属一个rDNA类型，而从同一宿主中分离的根瘤菌菌株可分属多种不同的rDNA类型，研究结果表明，采用rDNA PCR-RFLP等遗传背景分析的手段，可能筛选出广谱的根瘤菌力株，表4参8。     

利用细菌表面展示技术构建镉耐受性的重组根瘤菌

通过细菌表面展示功能基因InaXN、猴金属硫蛋白α亚基四聚体MT4α和两种启动子PnifH及Plac元件,分别构建两个重组质粒pTNIM和pBLIM.进一步通过三亲本杂交,将重组质粒分别导入费氏中华根瘤菌HN01,分别构建获得诱导表达型重组菌HN01(pTNIM)和组成表达型重组菌HN01(pBLIM).在培养条件下比较测定重组菌和出发菌对镉的吸附能力和耐受性,结果表明,组成表达型重组菌HN01(pBLIM)在上述两个方面的能力得到明显增强,对镉的吸附富集能力提高了2倍.研究还发现重组根瘤菌也具有很好的静态吸附效果.盆栽实验结果表明,接种诱导表达型重组菌HN01(pTNIM)的大豆根瘤和根中Cd2+的富集量均明显高于野生菌株HN01.本实验为后续探索重组根瘤菌与宿主植物共生体系在Cd2+污染土壤修复中的应用前景奠定了基础.     

四川省部分豆科植物根瘤菌的遗传多样性

从四川省豆科植物鸡眼草属、合欢属、豇豆属、葛属、金合欢、杭子梢分离获得了103株根瘤菌,采用AFLP、BOXAIR-PCR研究了这些菌株的遗传多样性.结果表明,分离自四川省豆科植物6个属的根瘤菌存在明显的遗传多样性,AFLP分析中,全部供试菌株的相似性为21%,全部供试菌株可分为26个AFLP遗传群;BOXAIR-PCR聚类分析结果表明,103个菌株分在70%相似性水平处,供试菌株被分为18个BOX遗传群.除部分菌株外,多数根瘤菌按宿主类型聚群,同一宿主而地理来源不同的根瘤菌分布于不同的遗传群,表明宿主和地理环境对根瘤菌具有深刻影响.图3表1参9     

Microbial Inoculants on Woody Legumes to Recover a Municipal Landfill Site

Tree and shrubby legumes have great potential in degraded land rehabilitation because of their ability to form symbiotic associations with nitrogen fixing rhizobia and mycorrhizal fungi. Extensive soil disturbance reduces natural microbial propagules thus preventing the formation of beneficial plant-microbes symbiosis. Reintroduction of selected microbial symbionts may improve the recovery rate of disturbed ecosystems. We inoculated selected rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi on two woody legume species, the mediterranean shrub Spartium junceumL. and the exotic tree Acacia cyanophylla Lindl. in order to recover a sealed municipal landfill (Palermo, Sicily, Italy). Inoculated plants showed shoot growth parameters 2 to 12-fold higher than uninoculated plants. After transplanting on the municipal landfill site, inoculated plants showed no transplant shock and low mortality (6–15%). The chemical analysis of P and N plant content showed no differences between inoculated and uninoculated plants suggesting that a dilution effect occurred due to higher biomass production of the inoculated plants. The beneficial effects of mycorrhization and rhizobium inoculum on growth parameters were still detectable one year after transplanting in S. junceum.     

石漠化地区野生多花木蓝根瘤资源调查与分析

为充分发挥豆科植物在生态恢复与重建中的作用,调查了贵州省境内石漠化部分地区的野生多花木蓝根瘤资源.结果表明：隶属于干热河谷南亚热带季雨林生态区的野生多花木蓝根瘤菌及内生细菌资源较为丰富;野生多花木蓝的共生结瘤率只达50%左右,根瘤全部着生于寄主的侧根及须根上,大小可达0.5~3.0mm;12株根瘤菌分布在6个属10个种,其中慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）的分布频率最高41.67%,慢生根瘤菌属的B.japonicum和伯克霍尔德菌属Burkholderia bacterium的发生频率最高16.67%;16株根瘤内生细菌分布在4个属11个种,其中芽孢杆菌属（Bacillus）的分布频率最高43.75%,芽孢杆菌属的B.megaterium的发生频率最高31.25%.     

含发光酶基因的转座子质粒载体的改造及向根瘤菌HN01的转座

将从自杀性重组质粒pDB30上分离的3．6kb含卡那霉素抗性基因和发光酶基因（luxAB）的BglⅡ酶切片段，克隆到小Mr的高拷贝质粒pIJ2925上，构成新的质粒，pHNLX1011；然后将pHNLX1011经BglⅡ部分酶切，酶连在含蔗糖酶基因（sacB）的自杀性重组质粒载体pMH1701上，载体分别采用BglⅡ酶切和BamHⅠ酶切．连接转化后共得到4种重组质粒类型的菌株，它们具有不同发光活性；将它们分别与快生型大豆根瘤菌HN01进行三亲本杂交，发现它们的转座频率均较pDB30高．对经转座标记后的根瘤菌进行发光活性检测，只有pHNC3质粒所转座的根瘤菌浇具有较强发光活性．所得发光根瘤菌衍生菌株能在野大豆和栽培大豆黑农39根际形成正常根瘤，能用X光片记录下根瘤的发光活性．     

根瘤菌全细胞组分的红外光谱特征

利用红外光谱仪记录并分析了36株根瘤菌全细胞组分的红外光谱图，所得图谱分辨率高、重现性好，菌株之间的光谱特征和吸收带的位置、强度各不相同。尤其在指纹区（1700-650cm^-1），不同菌株的图谱有较为明显的差别，利用红外光谱技术可以进行根瘤菌的鉴别，菌株水平的差异能充分表现出来，红外光谱分析在一定程度上可反映根瘤菌的分类地位，但实际应用起来，仍有一定的困难。     

石漠化地区豆科植物根瘤菌降解碳酸钙、镁能力研究

微生物对岩溶地区岩石风化、成土具有明显的促进作用,为了筛选出能够促进碳酸盐岩风化、加快成土速率的优势根瘤菌菌株,将其与豆科植物建立共生体系,进行石漠化地区修复与治理,实验以分离自云南石漠化地区的9株豆科植物根瘤菌为研究对象,将9株根瘤菌接种于加有难溶性碳酸钙或碳酸镁的液体培养液中,28.5℃、160 r·min-1摇床培养15 d,于0、1、3、6、10、15 d取样2 mL,每个样3个平行;将样品加入到10 mL体积比5∶1的硝酸高氯酸消化液中浸泡过夜,放在电热板上缓慢加热至溶液澄清透明,分别用含La3＋2%的盐酸溶液定容至10 mL,空白用同样方法处理;最后采用原子火焰吸收方法测定样品中Ca2＋和Mg2＋含量,筛选出对碳酸盐岩主要成分碳酸钙和碳酸镁具有强降解作用的根瘤菌菌株。结果表明：热带根瘤菌Rhizobium tropici （SWFU09）和根瘤菌Rhizobium sp.（SWFU02）对碳酸钙降解作用最强;对碳酸镁降解作用最好的菌株为根瘤菌Rhizobiumsp.（SWFU03）、热带根瘤菌Rhizobium tropici（SWFU05）和慢生根瘤菌Bradyrhizobium sp.（SWFU01）。溶液pH值对碳酸镁降解作用具重要的影响,对碳酸钙降解作用影响不大,说明根瘤菌代谢产生的酸性物质（有机酸、氨基酸）对碳酸钙和碳酸镁降解作用有一定影响,但不是唯一影响因素;也可能是微生物代谢产生的有机配体（基）吸附碳酸钙和碳酸镁表面,与水体中的成分形成复合物,改变溶解的平衡,置换出Ca2＋和Mg2＋。