乙酰辅酶A合成酶的酶学性质及其在甲羟戊酸合成中的应用

乙酰辅酶A合成酶(ACS)在微生物体内可直接将乙酸转化为乙酰辅酶A,乙酰辅酶A再进入微生物的碳代谢循环过程.为提高乙酸的利用效率,筛选催化活性较高的乙酰辅酶A合成酶,从大肠杆菌(Escherichia coli K-12)和巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus ATCC 33445)中扩增得到3个不同的乙酰辅酶A合成酶基因,将这3个基因分别连接到p ET-28a(+)载体上,Western Blot分析表明,3个基因均在E.coli BL21(DE3)中成功表达.对3个不同来源的乙酰辅酶A合成酶的酶活性进行比较,发现来自于巴氏醋酸杆菌的乙酰辅酶A合成酶(ACS2)具有较高的催化活力;其最适温度37℃,最适pH在7-8之间;在最适反应条件下,K_m为1.16 mmol/L,最大反应速度(V_(max))为20.45 mmol L~(-1) min~(-1).将ACS2应用到以乙酸为底物生物合成甲羟戊酸过程中,当过表达ACS2时,单批补料发酵条件下,甲羟戊酸产量达到6.59g/L.本研究筛选到1种催化活性较高的乙酰辅酶A合成酶,显著提高了甲羟戊酸的生物合成,可为乙酰辅酶A合成酶的进一步研究和应用提供理论支持.(图8表1参18)     

基于杀螨剂靶标朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶体外表达的新型杀螨活性化合物筛选

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是保证神经信号在生物体内正常传递的关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的作用靶标.本研究在前期朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶基因原核表达及最适反应条件摸索的基础上,大规模表达纯化朱砂叶螨AChE,进一步研究其酶学性质.研究结果显示,在温度为25℃、其他条件最适的情况下,测定酶K_m值为0.67 mmol/L,K_(cat)/K_m值为13.53 mmol L~(-1) s~(-1).随后,从SPECS化学库筛选到了55个候选AChE抑制性化合物,获得了9个抑制活性优于或相当于毒扁豆碱的朱砂叶螨AChE抑制化合物,并且它们对朱砂叶螨有较好的毒性.本研究为乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选以及以乙酰胆碱酯酶为靶标的农药开发提供了理论依据和实验基础.     

Hg2+和Pb2+对中国鲎N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

节肢动物蜕皮与N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)密切相关。为了探究Hg~(2+)和Pb~(2+)这2种重金属离子对节肢动物NAGase的影响,以中国鲎(Tachypleus tridentatus)为材料,从其内脏分离提取了NAGase。利用酶促反应动力学方法,研究Hg~(2+)和Pb~(2+)对中国鲎NAGase的影响;通过对酶荧光发射光谱的测定,研究NAGase酶蛋白经Hg~(2+)和Pb~(2+)作用后的空间构象变化。结果表明,Hg~(2+)和Pb~(2+)对中国鲎NAGase均有较强的抑制作用,Hg~(2+)对NAGase的抑制作用强于Pb~(2+),Hg~(2+)和Pb~(2+)对NAGase的抑制作用均表现为可逆过程,其中Hg~(2+)对NAGase的抑制属于竞争性抑制作用,抑制常数KI为22.68μmol·L~(-1),Hg~(2+)只与游离酶结合,不与酶-底物络合物结合;而Pb~(2+)对NAGase的抑制是属于竞争性-非竞争性混合型抑制作用,抑制常数KI和KIS分别为19.13 mmol·L~(-1)和75.23 mmol·L~(-1),Pb~(2+)与游离酶的亲和力相比与酶-底物络合物的亲和力更强。NAGase经Hg~(2+)和Pb~(2+)作用后荧光发射强度均降低,但荧光发射峰值并没有发生位移,说明Hg~(2+)和Pb~(2+)对中国鲎NAGase的抑制作用均为酶蛋白空间构象的变化所致。这证明了Hg~(2+)和Pb~(2+)对中国鲎NAGase活力具调控作用。     

热解糖高温厌氧杆菌β-葡萄糖苷酶的重组表达与酶学性质

β-葡萄糖苷酶是纤维素分解酶系中的重要组成部分,为从嗜热微生物中挖掘酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶,解决β-葡萄糖苷酶在工业应用方面普遍存在的活力偏低、稳定性不足、易受产物抑制等问题,通过密码子优化、基因合成和分子克隆技术,从热解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷酶基因bglY,构建重组表达载体pET22b-bglY,并转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,经IPTG诱导获得可溶性表达,采用Ni-NTA亲和层析法获得纯酶,并探究其酶学性质.结果显示,BglY属于GH1家族成员,分子量为52 × 10~3,最适反应温度65℃,70℃的半衰期达 1 h;最适反应pH 6.5,在pH 5-10范围内稳定;p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG)为底物时比活为420.2 ± 5.6 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率V_(max)分别为2.1 ± 0.4 mmol/L和909.1 ± 6.2 μmol min~(-1) mg~(-1);该酶对β-1,4糖苷键的底物具有水解偏好性,也可以水解纤维二糖和乳糖;5 mmol/L Fe~(3+)、Fe~(2+)、Cr~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)和EDTA对酶有激活作用,1% SDS完全抑制其活性;该酶可以抵抗产物葡萄糖的反馈抑制,且0.1-0.6 mol/L浓度的葡萄糖对酶具有激活作用,其中0.4 mol/L葡萄糖可提升活性至1.3倍,当葡萄糖浓度超过0.6 mol/L时,酶的活性才开始出现抑制.本研究表明BglY是一个葡萄糖激活型β-葡萄糖苷酶,其酶学性质优异,反应pH和温度范围较广且稳定,同时能水解天然底物纤维二糖和乳糖,可在提高纤维素生物质向葡萄糖的酶促转化等方面发挥应用潜力.(图7表3参32)     

芽孢杆菌植酸酶phy(ycD)基因在大肠杆菌中的异源表达与纯化

为研究中性植酸酶的性质,将芽孢杆菌来源植酸酶基因phy(ycD)构建到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,进行诱导表达,利用Ni-NAT和Superdex-75纯化后,对重组植酸酶r-phy(ycD)的性质进行分析.结果显示,该酶是Ca2+依赖性酶,Ca2+最适浓度为1 mmol/L,酶比活为4.7 U/mg,酶促反应的最适pH为6.5,在中性条件下稳定,最适反应温度为45℃,K m值和V max值分别为0.213 mmol/L和5.55 U/mg.Zn2+、Ni2+、Ba2+和Ag2+对酶促反应均有显著抑制作用.本研究表明,Ca2+对该类酶的活性和热稳定性起着关键性作用,因此在表达和纯化过程中需要在培养基和纯化所需的各类缓冲液中添加Ca2+.     

4种重金属离子对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)NAGase活力的影响

研究了Ag+、Pb2+、Zn2+、Hg2+等重金属离子对克氏原螯虾(Procambarus clarkia)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响,结果表明:4种重金属离子对酶活力均有不同程度的可逆抑制作用,其中Hg2+、Zn2+对酶的抑制作用较强,表现为反竞争性抑制,对结合酶(ES)的抑制常数KIS分别为0.07 mmol/L和22.04 mmol/L;而Ag+、Pb2+对酶有先激活后抑制的作用,其中Ag+对酶的抑制作用类型表现为反竞争性抑制,其抑制常数KI为1.08 mmol/L,Pb2+对酶的抑制作用类型表现为非竞争性抑制,其抑制常数KI为26.17 mmol/L.     

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶初步纯化及部分性质

以日本沼虾内脏为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32离子交换柱层析和SephadexG-100分子筛柱层析纯化,获得比活力为3000Umg-1、纯化倍数为8.88倍的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂(NAGase).以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学,结果表明,酶的最适pH为6.0,最适温度为53℃.该酶在pH4.5~9.3区域较稳定,当pH>9.3很快失活;在50℃以下处理30min,酶活力保持稳定,高于50℃,酶稳定性较差,75℃酶完全失活.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.165mmolL-1,最大反应速度Vm为6.55μmolL-1min-1.酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为63.55kJmol-1.图5表1参16     

香叶醇联合柠檬醛体外抗MRSA的优化配比

通过体外抑菌实验研究香叶醇与柠檬醛联合使用抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的体外抑菌活性,并采用单纯形格子混料设计优化二者比例.采用微量稀释法测定香叶醇和柠檬醛对43株MRSA的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC),采用棋盘法测定香叶醇和柠檬醛联合用药时的分级抑菌浓度(Fractional inhibitory concentration,FIC),采用单纯形格子设计优化香叶醇和柠檬醛联合用药时的比例,并采用微量稀释法对最佳配比混合液的抗MRSA活性进行测定.结果显示:香叶醇的MIC值为0.34-0.67 mg/mL,柠檬醛的MIC值为0.66-42.23 mg/mL.二者联合使用时,以协同作用为主,占46.51%;其次为相加作用,占41.86%.单纯形格子设计优化的香叶醇和柠檬醛联合使用的最佳比例为香叶醇84.50%、柠檬醛15.50%.采用此配比测定香叶醇和柠檬醛混合液对43株MRSA的MIC值,发现混合液MIC_(50)、MIC_(90)分别为0.25 mg/mL和0.44 mg/mL;与香叶醇单独使用相比,MIC_(50)和MIC_(90)分别约为单独使用时的1/2和2/3;与柠檬醛单独使用相比,MIC_(50)和MIC_(90)分别约为单独使用时的1/3和1/4.上述结果表明香叶醇与柠檬醛联合使用时可起到增敏的效果,且降低彼此的用量.(图2表5参31)     

猪精液酸性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的纯化及性质水

以杜洛克猪精液为材料,采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-32阴离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛柱层析纯化,获得纯化倍数为27.64、比活力为1 773.25 U mg~(-1)的酸性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶纯酶制剂.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定,纯酶两种亚基相对分子质量分别为129.13×10~3和62.24×10~3.对其酶学性质的研究结果表明,酶的等电点为5.10,最适pH值为5.5,最适温度为60℃.酶在pH 3.6~9.2、温度10℃～55 ℃的范围内较稳定.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨罐葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,测得米氏常数K_m为0.455 mmol L~(-1),最大反应速度V_m为17.34μmol L~(-1)min~(-1),活化能为41.70 kJ mol~(-1).图8表1参15     

TiO2光催化降解乙酰甲胺磷

在TiO2悬浮体系中,利用光催化技术消除乙酰甲胺磷(DMAPT).探索了催化剂用量和目标物浓度对消除速率的影响.结果表明,催化剂的最佳用量为4g·l-1,DMAPT的光催化降解规律符合L-H模型,吸附常数和反应速率参数分别为2mmol-1·l和0.6mmol·l-1·min-1.反应中主要的活性物种为·OH.反应的主要中间产物和矿化产物有O,S-二甲基硫代磷酰胺酯,O,O',S-三甲基硫代磷酸酯和磷酸甲酯等.DMAPT的降解从C-N键的断裂开始,随后经过P-N,P-S,P-C键的氧化分解,生成低毒和无毒的中间产物,并随着反应的继续最终达到彻底矿化,最终产物为SO2-4,NO-3,PO3-4和CO2.     

响应面法优化菌株Bacillus sp.W77酯酶发酵条件

为开发适应性好的工业用酶,从深圳福田红树林自然保护区土壤中分离纯化获得一株产耐高温嗜碱性酯酶的菌株,通过形态学和分子生物学初步鉴定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),命名为Bacillus sp.W77;对所产的粗酶液进行酶活测定,发现该菌产的酯酶的最适反应温度是50℃,最适pH为8.0,且在碱性条件下较稳定;采用响应面法(Response surface methodology)对土壤菌株Bacillus sp.W77的产酯酶条件进行了优化,酵母提取物6.67 g/L,磷酸氢二钾0.56 g/L,硫酸镁0.36 g/L时,此时预测的最大酯酶活力的D405 nm值为1.266,在最佳产酶条件下,优化后酯酶活力的D405 nm值由0.829提高到1.235,实际值达到理论预测值的97.5%.     

海洋微生物Fulvimarina manganoxydans磷酸酶FM2382的克隆表达及酶学性质

为促进海洋微生物及基因资源的开发应用,将海洋微生物Fulvimarina manganoxydans sp.nov.8047的磷酸酶基因fm2382在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达、纯化,并研究磷酸酶FM2382的酶学性质.设计引物从F.manganoxydans sp.nov.8047基因组DNA中扩增出磷酸酶fm2382基因,克隆至pET28(a)表达载体中,构建重组菌株,表达纯化后对磷酸酶FM2382的酶学性质进行分析.结果表明:磷酸酶FM2382最适反应温度为45℃,最适反应pH 7.1,70-80℃高温处理1 h后仍具35%左右的活力,在pH 7.1-9.0范围内具有较好的稳定性;金属离子对磷酸酶活力有不同程度的影响,其中Mg~(2+)、Mn~(2+)具有强烈的激活作用;K_m=1.42×10~(-3)mol/L,V_m=2.5×10~(-7)mol/L.本研究表明F.manganoxydans sp.nov.中获得的fm2382基因可以在大肠杆菌中高效表达且FM2382是一种新的磷酸酶.     

Zn2+对棉铃虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力与性质的影响

以棉铃虫蛹为材料,经分离纯化获得棉铃虫N乙酰βD氨基葡萄糖苷酶制剂;研究了Zn2 对棉铃虫N乙酰βD氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.14)活力与性质的影响.结果表明,Zn2 对酶活力有抑制作用,酶活力丧失一半的Zn2 浓度(IC50)为1.3mmol/L.进一步研究Zn2 的抑制作用动力学,发现Zn2 对该酶的抑制作用是一种可逆过程,抑制机理表现为竞争型,抑制常数KI为1.158mmol/L.Zn2 不会影响酶的酸碱稳定性,但有Zn2 存在时,在30～40范围内,酶是稳定的,温度高于50℃后,随着Zn2 浓度的增加,酶的温度稳定性也相对增加.图5参10     

高选择性手性酯酶产生菌的筛选及应用

从土壤中分离得到230株产酯酶菌株，经反复筛选，从中挑选出一株酶活及选择性均较高的菌株YQ231，该菌株所产酯酶能将外消旋的酯水解为手性醇（环戊烯酮），且该酶优先水解（R）-型酯。经生理生化试验鉴定，该细菌为不动杆菌属（Acinetobacter sp.）。研究了该菌株的产酶过程，结果表明：酶活在24h达最高值。同时研究了该菌株的催化特性，在反应12h时其转化率达48.8％，eep为92.3％，ees为70.3％。图3表2参9     

MnO2纳米酶催化ABTS的显色反应及其在Fe2+和Pb2+检测中的应用

本文探讨了纳米MnO_2催化2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)显色反应的类氧化酶活性,系统地评估了单一金属离子Fe~(2+)和Pb~(2+)对MnO_2纳米酶活性的影响及作用机理,揭示了MnO_2纳米酶-ABTS反应体系在选择性检测实际水体中Fe~(2+)和Pb~(2+)的应用.在pH 3.8、25℃条件下,纳米MnO_2能够催化ABTS单电子转移形成ABTS阳离子自由基(ABTS~(·+),绿色产物),其类氧化酶活性为0.0412 U·mL~(-1).酶剂量、底物浓度、pH和温度影响了MnO_2纳米酶活性.在反应体系中添加0.01 mmol·L~(-1) Fe~(2+)(或Pb~(2+))显著地抑制了MnO_2纳米酶活性(P0.01),主要是由于Fe~(2+)(或Pb~(2+))在静电引力作用下强烈吸附在纳米MnO_2表面,导致MnO_2纳米酶催化活性的钝化甚至失活.其中Fe~(2+)吸附在MnO_2纳米酶表面能够与多价锰发生氧化还原反应,而Pb~(2+)特异性吸附在MnO_2纳米酶表面形成络合物.加标回收试验结果表明,MnO_2纳米酶能够用于选择性测定实际水样中单一污染的Fe~(2+)和Pb~(2+).MnO_2纳米酶-ABTS反应体系对天然水体中Fe~(2+)和Pb~(2+)的检测具有较高精确度(相对误差为3.4%—10.5%)和良好回收性能(回收率为96%—110%).研究结果提供了一种简单、快速、高灵敏的检测方法用于可视化分析环境水样中Fe~(2+)和Pb~(2+)浓度.     

Mn~(2+)协同Fe~(3+)-EDTA在中性pH条件下催化类Fenton降解水中卡马西平

研究了Mn~(2+)协同Fe~(3+)-EDTA络合体催化类Fenton反应,在中性p H条件下对水中新兴污染物卡马西平的降解情况.考察了Mn~(2+)∶Fe~(3+)、EDTA∶Fe~(3+)和H_2O_2∶Fe~(3+)的物质的量比率、Fe~(3+)浓度和初始p H等关键因素对卡马西平降解效果的影响.结果表明,共存Mn~(2+)能够显著增强Fe~(3+)-EDTA络合体催化类Fenton反应体系的氧化能力.在0.1 mmol·L~(-1)Fe~(3+)、EDTA∶Fe~(3+)为2∶1、Mn~(2+)∶Fe~(3+)为1∶1、H_2O_2∶Fe~(3+)为150∶1和p H 7.0的条件下,经过20 min反应时间,卡马西平的降解率能够达到100%,表观降解速率常数达到0.6374 min~(-1).其增效机理是通过Mn~(2+)-EDTA与H_2O_2反应促进O_2~(·-)的产生,进而加速还原Fe~(3+)-EDTA至Fe~(2+)-EDTA,间接提高HO~·的产生速率.研究结果能够为水中卡马西平的有效去除提供参考.     

常见离子对漆酶降解活性艳蓝的调控作用

漆酶具有很高的工业价值,但水体中离子的存在为其推广使用带来了巨大挑战.探讨水体中常见的7种阳离子和8种阴离子调控自由漆酶和漆酶–介体系统对水中活性艳蓝降解速率的差异.结果显示:Mn~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、HPO_4~(2-)和NO_2~-在0-10 mmol/L范围内可促进漆酶对活性艳蓝的降解,降解速率由高到低依次为NO_2~-、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、HPO_4~(2-);SO_3~(2-)、Cl~-、Fe~(2+)和Fe~(3+)对活性艳蓝的降解有抑制作用,其中Fe~(2+)和SO_3~(2-)的最低抑制浓度分别为5和0.5 mmol/L;其他离子对漆酶降解活性艳蓝没有显著性影响.在5种介体的协同作用中,紫脲酸(VA)的效果最佳,导致漆酶对活性艳蓝的降解速率提升10%左右,其余介体的促进效率明显低于VA.在同等离子的调控下,漆酶–介体系统中的降解速率优于自由漆酶.本研究初步揭示了漆酶对活性艳蓝的降解机理,同时可以通过控制水体中离子的种类和数量来更好地实现漆酶对活性艳蓝的降解,结果可为漆酶在实际染料废水处理中的应用提供理论依据.(图4表4参40)     

果糖对莆田黑猪精液中NAGase的抑制动力学

为了解精液中不同类型糖类物质对精子细胞中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)的影响,以莆田黑猪精液NAGase为材料,研究精液和精液稀释液主要成分之一果糖对酶的抑制作用.结果显示,果糖对NAGase具有浓度效应(IC50=575 mmol L-1).果糖对NAGase的抑制类型是可逆的非竞争性抑制,抑制常数是1.27×10-2 mmol L-1.应用底物反应的动力学方法研究果糖对该酶的抑制动力学,建立了抑制动力学模型,证明了果糖对该酶的影响是快速结合再缓慢失活的过程.本研究表明,在高浓度的抑制剂溶液中NAGase将完全失活,底物对其无保护作用.     

重组大肠杆菌产CotA漆酶的发酵条件优化

CotA漆酶在环境保护、食品工业和纸浆漂白等工业中具有重要的应用价值.将重组表达载体pET-22b/CotA转入大肠杆菌BL21(DE3),得到工程菌株,采用单因素实验和正交实验相结合的方法,研究诱导表达条件和发酵培养基对重组大肠杆菌产CotA漆酶量的影响.结果表明,初始pH 7.5的培养基中,添加0.6 mmol L-1 Cu2+,1 g L-1葡萄糖作碳源、15 g L-1蛋白胨和2 g L-1硫酸铵作氮源,以10%的接种量,37℃、200 r/min,直到菌液的D600 nm值为1.0,加入终浓度为1.0 mmol L-1的IPTG,25℃诱导12 h,漆酶的产量最高.优化前发酵液的粗提液的漆酶活性仅为1 190 U mL-1,优化后达到3 526 U mL-1,正交实验优化后漆酶活性提高了2.96倍.纯化的CotA漆酶最适反应温度为45℃,最适pH值为7.2.CotA漆酶对RBBR的脱色率在90%以上,此CotA漆酶在短时间内对染料能够有效地脱色,能够成为有潜力的工业用酶.图6表3参17     

镉离子对尼罗罗非鱼精巢N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的失活动力学（英文）

镉离子污染对水生生物的繁殖造成了不利影响,N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)被认为参与了动物的受精过程.为了解镉离子对罗非鱼繁殖的影响,以尼罗罗非鱼精巢分离获得的NAGase酶为研究对象,采用底物反应动力学方法,建立镉离子对NAGase酶的失活模型,探究镉离子对该酶活性的影响.结果显示,镉离子对NAGase表现出了可逆的抑制,对NAGase抑制的IC_(50)为40.95 mmol/L.镉离子对NAGase的抑制机理为竞争型抑制,抑制常数KI为17.13mmol/L,同时测定了微观失活速度常数.本研究表明镉离子对NAGase的抑制类型为竞争型的可逆抑制,结果可为后期研究镉离子对罗非鱼繁殖性能的研究提供理论基础.