强氯精对尼罗罗非鱼精巢N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的失活动力学(英文)

强氯精是水产养殖过程中普遍使用的消毒剂,为了解强氯精能够杀菌却不会对养殖水产动物尤其是其繁殖功能产生危害的有效浓度,以分离自尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)精巢的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)为材料,利用底物反应的动力学方法探讨强氯精对该酶的失活动力学.结果显示该酶在强氯精溶液中是一个可逆的反竞争型的失活过程,其对酶抑制的IC50为(0.25±0.02)mg/m L;而且强氯精能降低该酶的热稳定性和p H稳定性;通过建立失活模型,计算得知正向和逆向微观失活速度常数k′+0和k′-0值分别为3.84×10~(-3)/s和8.37×10~(-4)/s.本研究结果可为评价强氯精对罗非鱼繁殖功能的影响提供理论依据.     

果糖对莆田黑猪精液中NAGase的抑制动力学

为了解精液中不同类型糖类物质对精子细胞中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)的影响,以莆田黑猪精液NAGase为材料,研究精液和精液稀释液主要成分之一果糖对酶的抑制作用.结果显示,果糖对NAGase具有浓度效应(IC50=575 mmol L-1).果糖对NAGase的抑制类型是可逆的非竞争性抑制,抑制常数是1.27×10-2 mmol L-1.应用底物反应的动力学方法研究果糖对该酶的抑制动力学,建立了抑制动力学模型,证明了果糖对该酶的影响是快速结合再缓慢失活的过程.本研究表明,在高浓度的抑制剂溶液中NAGase将完全失活,底物对其无保护作用.     

4种重金属离子对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)NAGase活力的影响

研究了Ag+、Pb2+、Zn2+、Hg2+等重金属离子对克氏原螯虾(Procambarus clarkia)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响,结果表明:4种重金属离子对酶活力均有不同程度的可逆抑制作用,其中Hg2+、Zn2+对酶的抑制作用较强,表现为反竞争性抑制,对结合酶(ES)的抑制常数KIS分别为0.07 mmol/L和22.04 mmol/L;而Ag+、Pb2+对酶有先激活后抑制的作用,其中Ag+对酶的抑制作用类型表现为反竞争性抑制,其抑制常数KI为1.08 mmol/L,Pb2+对酶的抑制作用类型表现为非竞争性抑制,其抑制常数KI为26.17 mmol/L.     

Hg2+和Pb2+对中国鲎N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

节肢动物蜕皮与N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)密切相关。为了探究Hg~(2+)和Pb~(2+)这2种重金属离子对节肢动物NAGase的影响,以中国鲎(Tachypleus tridentatus)为材料,从其内脏分离提取了NAGase。利用酶促反应动力学方法,研究Hg~(2+)和Pb~(2+)对中国鲎NAGase的影响;通过对酶荧光发射光谱的测定,研究NAGase酶蛋白经Hg~(2+)和Pb~(2+)作用后的空间构象变化。结果表明,Hg~(2+)和Pb~(2+)对中国鲎NAGase均有较强的抑制作用,Hg~(2+)对NAGase的抑制作用强于Pb~(2+),Hg~(2+)和Pb~(2+)对NAGase的抑制作用均表现为可逆过程,其中Hg~(2+)对NAGase的抑制属于竞争性抑制作用,抑制常数KI为22.68μmol·L~(-1),Hg~(2+)只与游离酶结合,不与酶-底物络合物结合;而Pb~(2+)对NAGase的抑制是属于竞争性-非竞争性混合型抑制作用,抑制常数KI和KIS分别为19.13 mmol·L~(-1)和75.23 mmol·L~(-1),Pb~(2+)与游离酶的亲和力相比与酶-底物络合物的亲和力更强。NAGase经Hg~(2+)和Pb~(2+)作用后荧光发射强度均降低,但荧光发射峰值并没有发生位移,说明Hg~(2+)和Pb~(2+)对中国鲎NAGase的抑制作用均为酶蛋白空间构象的变化所致。这证明了Hg~(2+)和Pb~(2+)对中国鲎NAGase活力具调控作用。     

Zn2+对棉铃虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力与性质的影响

以棉铃虫蛹为材料,经分离纯化获得棉铃虫N乙酰βD氨基葡萄糖苷酶制剂;研究了Zn2 对棉铃虫N乙酰βD氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.14)活力与性质的影响.结果表明,Zn2 对酶活力有抑制作用,酶活力丧失一半的Zn2 浓度(IC50)为1.3mmol/L.进一步研究Zn2 的抑制作用动力学,发现Zn2 对该酶的抑制作用是一种可逆过程,抑制机理表现为竞争型,抑制常数KI为1.158mmol/L.Zn2 不会影响酶的酸碱稳定性,但有Zn2 存在时,在30～40范围内,酶是稳定的,温度高于50℃后,随着Zn2 浓度的增加,酶的温度稳定性也相对增加.图5参10     

海带对镉、铅的吸附作用及其机理

利用大型海藻海带(Laminaria japonica)作为可降解性生物吸附材料,对有害重金属镉离子和铅离子的吸附作用和机理进行了研究.结果显示,通过电位差滴定法,得到海带的酸性基数量为1.25mmol.g-1,其解离常数为0.18 mmol.l-1.对平衡吸附量与pH的关系进行了模型模拟.海带对于金属离子的吸附为Bidentate型,吸附平衡常数分别为5.72×103L.mol-1,6.28×104L.mol-1.同时,采用拟二次速度模型对镉离子和铅离子的吸附速度进行了模拟,得到的吸附速度常数分别为0.010 min-1,0.014min-1.结论,海带对二价镉、铝离子的吸附量大于很多其它藻类吸附剂,对它的研究可为重金属化湖泊水质的改善和生态修复提供参考依据.     

氨基酸对中华绒螯蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响

研究了12种氨基酸对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响.结果表明,在特定浓度范围内,甘氨酸(L-Gly)、缬氨酸(L-Val)、丙氨酸(L-Ala)、苯丙氨酸(L-Phe)、苏氨酸(L-Thr)和丝氨酸(L-Ser)对酶活力没有显著影响,而蛋氨酸(L-Met)、天冬酰胺(L-Gln)、脯氨酸(L-Pro)、精氨酸(L-Arg)、组氨酸(L-His)和赖氨酸(L-Lys)对酶活力有不同程度的抑制作用.L-Pro、L-Arg和L-Lys使酶活力下降50%时抑制剂浓度(IC50)分别为450、20、85 mmolL-1.L-Pro对酶的抑制表现为可逆非竞争性类型,对酶的抑制常数K1为702.87 mmol L-1.L-Arg、L-His和L-Lys对酶的抑制均表现为可逆反竞争性类型,对酶的抑制常数K1S分别为2.19、85.81、10.23 mmol L-1.图9参10     

大肠杆菌乙酰酯酶(AES)的酶学性质

以乙酸香叶酯为底物,对大肠杆菌乙酰酯酶(Acetyl esterase,AES)的酶学性质进行解析,实现将乙酸香叶酯生物转化为香叶醇.结果显示:大肠杆菌AES酶的最佳反应p H范围为6.0-7.5;最适反应温度为30℃;最佳催化时间为2 h;Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)对酶活没有太大影响,而Cu~(2+)、Zn~(2+)明显抑制酶的活性.对AES的动力学研究可知,其米氏常数Km、最大反应常数Vm分别为2.88 mmol/L、1.87 mmol/L.该酶同样可水解乙酸松油酯、乙酸薄荷酯、乙酸香茅酯,分别产生松油醇、薄荷醇和香茅醇.本研究得出了大肠杆菌乙酰酯酶的最适反应条件,可为后期香叶醇的生物合成优化和产量提高以及其他萜醇类化合物的生物合成提供参考依据.     

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶初步纯化及部分性质

以日本沼虾内脏为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32离子交换柱层析和SephadexG-100分子筛柱层析纯化,获得比活力为3000Umg-1、纯化倍数为8.88倍的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂(NAGase).以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学,结果表明,酶的最适pH为6.0,最适温度为53℃.该酶在pH4.5~9.3区域较稳定,当pH>9.3很快失活;在50℃以下处理30min,酶活力保持稳定,高于50℃,酶稳定性较差,75℃酶完全失活.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.165mmolL-1,最大反应速度Vm为6.55μmolL-1min-1.酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为63.55kJmol-1.图5表1参16     

产碱杆菌DN25中降氰酶的分离纯化及生化特性

以一株可降氰的产碱杆菌DN25为酶来源,通过超滤、30 mg/mL硫酸鱼精蛋白沉淀、30%～70%硫酸铵盐析和Phenyl-Toyopearl 650M疏水层析等步骤,获得比活力为44 U/mg的纯化酶制剂.在确定酶浓度、反应时间等氰降解活力测定条件后开展酶学性质研究,试图为将来氰降解代谢机理的深入研究和菌株的基因工程改造提供理论基础.研究结果表明,此纯化酶催化氰化物水解的最适pH值为8.0,最适温度为30℃.该酶在pH 7.0～8.0区域稳定,而在pH>9时会很快失活;在30℃保存10 h,酶活力保持稳定,高于60℃,酶快速失活.加入甘氨酸稳定剂,在60℃下保存20 min酶活仍可保留19.6%.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为3.11 mmol/L,最大反应速率Vmax为0.23 mmolL-1min-1.     

镉胁迫下油菜毛状根的生理响应及铁钾含量

利用液体悬浮培养法研究不同镉(Cd)浓度(0、25、50、100、200和400μmol/L)胁迫下油菜毛状根的生理响应及对铁钾含量的影响,探究油菜毛状根对镉胁迫的耐受与富集能力.结果显示:(1)低镉浓度(100μmol/L以下)对毛状根的生长无显著影响,高镉浓度(100μmol/L以上)下毛状根的生长则受到明显的抑制,25μmol/L镉胁迫7 d时毛状根的鲜重最大(4.34 g).(2)油菜毛状根中活性氧(ROS)的含量随着镉浓度的增加而上升,根中主要抗氧化酶(超氧化物酶SOD、过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT)的活性在镉胁迫1 d时,表现出先降低后升高的趋势;镉胁迫7 d时,表现出先升高后降低的趋势.(3)碘化丙啶PI染色与丙二醛MDA分析表明,根细胞的损伤随着镉浓度的增加越发严重.(4)油菜毛状根中的镉含量随着培养基中镉浓度的增加而增加,400μmol/L、7 d时,达到最大值2.97 mg/g.毛状根中的铁含量在镉胁迫1 d时随着镉浓度的增加显著上升,最大值达到14.52 mg/g;镉胁迫7 d时没有明显变化.镉胁迫7 d时毛状根中的钾含量是镉胁迫1 d时(15.73 mg/g)的1.6倍.本研究结果表明,油菜毛状根对镉胁迫的生理响应变化与镉的作用浓度和时间相关;同时镉胁迫造成了毛状根中铁、钾元素代谢紊乱,但油菜毛状根对镉有较好的富集效果.     

常见离子对漆酶降解活性艳蓝的调控作用

漆酶具有很高的工业价值,但水体中离子的存在为其推广使用带来了巨大挑战.探讨水体中常见的7种阳离子和8种阴离子调控自由漆酶和漆酶–介体系统对水中活性艳蓝降解速率的差异.结果显示:Mn~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、HPO_4~(2-)和NO_2~-在0-10 mmol/L范围内可促进漆酶对活性艳蓝的降解,降解速率由高到低依次为NO_2~-、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、HPO_4~(2-);SO_3~(2-)、Cl~-、Fe~(2+)和Fe~(3+)对活性艳蓝的降解有抑制作用,其中Fe~(2+)和SO_3~(2-)的最低抑制浓度分别为5和0.5 mmol/L;其他离子对漆酶降解活性艳蓝没有显著性影响.在5种介体的协同作用中,紫脲酸(VA)的效果最佳,导致漆酶对活性艳蓝的降解速率提升10%左右,其余介体的促进效率明显低于VA.在同等离子的调控下,漆酶–介体系统中的降解速率优于自由漆酶.本研究初步揭示了漆酶对活性艳蓝的降解机理,同时可以通过控制水体中离子的种类和数量来更好地实现漆酶对活性艳蓝的降解,结果可为漆酶在实际染料废水处理中的应用提供理论依据.(图4表4参40)     

患红体病的凡纳滨对虾外壳膜NAGase基本性质的改变

分别以健康和患红体病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vanname)外壳膜为材料,抽提其N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.52,简称NAGase),测定分析两种来源对虾的外壳膜NAGase的活力和性质的差异.测得健康对虾NAGase的活力为 34.80 U mg-1,而患红体病对虾的活力为 38.32 U mg-1.结果表明:两种来源对虾的NAGase活力、基本酶学性质等均存在差异.表明对虾患红体病后,外壳膜NAGase的活力、催化反应动力学常数Km和Vm值、活化能均较高,但其最适温度较低, pH稳定性及热稳定性较差.     

热解糖高温厌氧杆菌β-葡萄糖苷酶的重组表达与酶学性质

β-葡萄糖苷酶是纤维素分解酶系中的重要组成部分,为从嗜热微生物中挖掘酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶,解决β-葡萄糖苷酶在工业应用方面普遍存在的活力偏低、稳定性不足、易受产物抑制等问题,通过密码子优化、基因合成和分子克隆技术,从热解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷酶基因bglY,构建重组表达载体pET22b-bglY,并转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,经IPTG诱导获得可溶性表达,采用Ni-NTA亲和层析法获得纯酶,并探究其酶学性质.结果显示,BglY属于GH1家族成员,分子量为52 × 10~3,最适反应温度65℃,70℃的半衰期达 1 h;最适反应pH 6.5,在pH 5-10范围内稳定;p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG)为底物时比活为420.2 ± 5.6 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率V_(max)分别为2.1 ± 0.4 mmol/L和909.1 ± 6.2 μmol min~(-1) mg~(-1);该酶对β-1,4糖苷键的底物具有水解偏好性,也可以水解纤维二糖和乳糖;5 mmol/L Fe~(3+)、Fe~(2+)、Cr~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)和EDTA对酶有激活作用,1% SDS完全抑制其活性;该酶可以抵抗产物葡萄糖的反馈抑制,且0.1-0.6 mol/L浓度的葡萄糖对酶具有激活作用,其中0.4 mol/L葡萄糖可提升活性至1.3倍,当葡萄糖浓度超过0.6 mol/L时,酶的活性才开始出现抑制.本研究表明BglY是一个葡萄糖激活型β-葡萄糖苷酶,其酶学性质优异,反应pH和温度范围较广且稳定,同时能水解天然底物纤维二糖和乳糖,可在提高纤维素生物质向葡萄糖的酶促转化等方面发挥应用潜力.(图7表3参32)     

Inhibitory kinetics of β-N-acetyl-D-glucosaminidase from Nile tilapia (Oreochromis niloticus) by cadmium北大核心CSCD

Cadmium (Cd2+) pollution in an aquatic environment can negatively affect certain reproductive parameters of aquatic animals. β-N-acetyl-D-glucosaminidase (NAGase) is considered to play an important role in the fertilization process. The aim of the present study was to investigate the effect of Cd2+ on the activity of NAGase purified f rom the testis of Nile tilapia, toward contributing new knowledge on the breadth of negative effects of Cd2+ for Nile tilapia production. The kinetic method of substrate reaction was used for this assessment, and an inhibitory model was established to study the kinetics of NAGase under inhibition by Cd2+. The results showed that Cd2+ could reversibly inhibit the enzymatic activity of NAGase, and the half-maximal inhibitory concentration was estimated to be 40.95 mmol/L. Cd2+ was found to be a competitive inhibitor of NAGase, and the inhibitory constant was determined to be 17.13 mmol/L. The microscopic rate constants of inactivation were also determined. Together, these findings demonstrate that Cd2+ is a reversible inhibitor that can competitively inhibit NAGase. These results may provide a theoretical foundation for further studies on the reproduction of tilapia. © 2018 Science Press. All rights reserved.     

Cu2+、Cd2+、Zn2+对两种单胞藻的毒害作用

分别用不同浓度 (c =0 .0 1～ 2 .34mmol/L)的Cu2 + 、Cd2 + 、Zn2 + 处理亚心型大扁藻 (Plztymonassp.)和小球藻(Chlorelavulagris) ,观察了重金属离子对其生长、呼吸及其被富集的情况 .结果表明 :① 3种离子的毒性强度的顺序为Cu2 + >Cd2 + >Zn2 + ;亚心型大扁藻的耐受力大于小球藻 ;②Cu2 + 对生长的抑制最强 ,两种藻的c(EC50 ,72h)分别为 0 .2 11mmol/L和 0 .2 89mmol/L ;Cd2 + 对生长的抑制稍弱 ,两种藻的c(EC50 ,72h)分别为 0 .4 38mmol/L和 0 .2 4 1mmol/L ;Zn2 + 对生长的抑制最弱 ,其c(EC50 ,72h)分别为 0 .75 4mmol/L和 0 .30 8mmol/L ;③在c(EC50 )毒害浓度下 ,两种单胞藻均提前进入生长静止期 ,缩短了种群生长周期 ;呼吸作用先增强后降低 ;④在c(EC50 )毒害浓度下 ,两种藻对Cu2 + 、Zn2 + 的富集量为 4 5 82～ 4 12 83.7mgkg-1,对Cd2 + 的富集量 5 0 0～ 2 72 3.6mgkg-1.图 2表 3参 8     

溴氰菊酯对罗非鱼血清中溶菌酶质量浓度及肝脾脏影响

随着溴氰菊酯在农业上的广泛应用,其在水环境中的污染机率也在增加。为了研究溴氰菊酯连续暴露对罗非鱼免疫系统的影响。通过测定血清中溶菌酶质量分数,观察罗非鱼(tilapia)肝脾脏的外观变化,以及计算肝脏和脾脏的脏器系数,评价溴氰菊酯连续染毒对罗非鱼的影响。实验设1.0,2.0,3.0,5.0,10.0μg/L5个质量浓度组和空白对照组,同时每组设置一个平行样。试验开始后的第3天,1.0~5.0μg/L质量浓度组的罗非鱼血清中的溶菌酶质量浓度接近或略小于对照组,10.0μg/L质量浓度组与对照组相比下降明显(P<0.05),降幅达49.3%。实验7~15d期间,1.0~5.0μg/L质量浓度组罗非鱼血清的溶菌酶质量浓度渐渐升高,高于正常鱼体的质量浓度,最高值可达138.06±2.2μg/mL,为对照组的220.9%(P<0.05)。10.0μg/L试验组罗非鱼血清中溶菌酶的质量浓度在试验第7天时降至最低,为26.5±1.9μg/mL,为对照组的42.4%,表现出明显的抑制作用(P<0.01)。随着暴露时间的延长,各试验组在20d时恢复至正常水平,血清中溶菌酶的质量浓度与对照组相比没有明显差异(P>0.05);溴氰菊酯染毒第25天时罗非鱼的肝脏和脾脏的脏器系数与对照组相比均未发生明显的差异,罗非鱼的脾脏外观没有发生异常,但肝脏却发生了明显的病变,试验第25d时10.0μg/L质量浓度组罗非鱼肝脏的异常率达66.67%。试验结果表明,溴氰菊酯对罗非鱼血清中溶菌酶的影响是可逆的,对肝脏会造成一定的病理损伤,对脾脏的影响未检出。     

芽孢杆菌植酸酶phy(ycD)基因在大肠杆菌中的异源表达与纯化

为研究中性植酸酶的性质,将芽孢杆菌来源植酸酶基因phy(ycD)构建到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,进行诱导表达,利用Ni-NAT和Superdex-75纯化后,对重组植酸酶r-phy(ycD)的性质进行分析.结果显示,该酶是Ca2+依赖性酶,Ca2+最适浓度为1 mmol/L,酶比活为4.7 U/mg,酶促反应的最适pH为6.5,在中性条件下稳定,最适反应温度为45℃,K m值和V max值分别为0.213 mmol/L和5.55 U/mg.Zn2+、Ni2+、Ba2+和Ag2+对酶促反应均有显著抑制作用.本研究表明,Ca2+对该类酶的活性和热稳定性起着关键性作用,因此在表达和纯化过程中需要在培养基和纯化所需的各类缓冲液中添加Ca2+.     

一种提取土壤样品中麻疯树核糖体失活蛋白curcin的方法

建立并优化了一种土壤麻疯树核糖体失活蛋白curcin的提取方法.优化后的提取步骤和参数为:0.1 g含curcin的土壤样品加入1 m L的提取缓冲液(5 mmol/L磷酸盐,0.1 mmol/L EDTA,0.2%SDS(m/V),20 mmol/Lβ-巯基乙醇,p H7.2),在18℃以上的室温条件下振荡混匀1 h,离心取上清液.重复该过程一次,合并上清液.上清液于4℃放置过夜,离心取上清液,即为样品粗提液.该样品粗提液即可用单克隆抗体间接酶联免疫吸附法(ELISA)进一步检测其中的curcin含量.该方法对curcin含量高于8μg/g土壤可进行定性检测,对于curcin含量分别为100、500、1 000μg/g的土壤样品的回收率分别达到49.3%±2.8%、64.2%±3.62%和78.33%±4.24%.该方法的变异系数保持在5%左右,对来自四川3个样地的土壤有较好的适用性.本研究建立优化的提取方法可为评估curcin蛋白在农业领域应用的生态风险提供技术支持.     

有机溶剂和变性剂对枯草芽胞杆菌溶栓酶活性的影响

以枯草芽胞杆菌LD-8547菌株发酵液为材料,提取分离溶栓酶,研究了几种有机溶剂及变性剂对枯草杆菌溶栓酶活性的影响.结果表明,甲醇对溶栓酶表现为抑制作用,在10%-15%浓度范围时,其抑制作用最强;乙醇在5%～15%浓度范围内对酶活有激活作用,但随浓度的增大则转变为较强的抑制作用;正丁醇和异丙醇对酶活力则表现出强烈的抑制作用;丙三醇对酶活力有轻微的抑制作用,随着浓度增加抑制作用逐渐增强;异戊醇在5%～15%浓度范围内有一定的激活作用,但当浓度大于15%时则表现为抑制作用.醛类对酶活也有较强的抑制作用;丙酮、DMSO、DMF、SDS和异氰硫酸胍对酶活均有不同程度的抑制作用;脲浓度＜0.01 mmol/L时略有激活作用,随浓度增大转变为抑制作用.实验同时对EDTA在不同浓度和不同时间内对酶活力的影响进行了研究,结果表明,浓度＜2mmol/L的EDTA基本不影响酶活力,但随着浓度的增大,其抑制作用明显增大.本实验还以牛血为材料,对酶液进行了体外抗血凝和溶血栓实验,结果表明,该酶具有抗血凝和溶血栓效果.