四川地区结瘤大豆根际土壤中紫云英、苜蓿和三叶草根瘤菌的多样性分析

为了解四川地区结瘤大豆根际土壤是否存在与紫云英、苜蓿和三叶草共生结瘤的根瘤菌及其多样性,从四川盆地采集不同种植模式下结瘤大豆根际土壤样品31份,利用紫云英、苜蓿和三叶草进行盆栽捕获试验以获得共生根瘤,从根瘤中分离纯化出根瘤菌,对其进行表型和分子鉴定;并将根瘤菌回接到紫云英、苜蓿、三叶草和大豆根际以检测根瘤菌的寄主范围.在捕获实验中,苜蓿和三叶草分别在6个土壤样品中共生结瘤,而紫云英只在2个土样中共生结瘤,并从共生根瘤中分离出14株根瘤菌;16S r DNA基因序列的相似性分析表明这14株根瘤菌均属于根瘤菌属(Rhizobium),且16S r DNA基因的系统发育树揭示它们分属于根瘤菌属的不同种;这14株根瘤菌在回接实验中都只能让捕获豆科植物结瘤,而不能让其他3种豆科植物结瘤.本研究结果表明,四川地区结瘤大豆根际土壤中的紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)和三叶草根瘤菌(R.leguminosarum var.trifolii)资源较少,其与大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)分属于不同的属,且根瘤菌的回接实验进一步证明了根瘤菌的寄主专一性.     

亚硝酸细菌amoA基因的克隆、测序与表达

采用PCR技术对亚硝酸细菌的特异性amoA基因进行克隆、测序 ,以确定其准确性 ;然后采用基因重组技术构建亚硝酸细菌的基因工程菌 ,并进行鉴定与功能初步评价 .结果表明 ,克隆得到的 4种亚硝酸细菌的amoA基因 ,与标准菌株Nitrosomonassp.GH2 2的amoA基因同源性达到 98%～ 99% ;构建了一种含有特异性amoA基因的大肠杆菌基因工程菌株 ,并采用直接比色法对重组细菌的氨氧化活性进行测定 ,发现基因工程菌的氧化氨氮速率明显高于分离的野生菌株 .研究表明 ,利用基因重组技术对亚硝酸细菌等自养菌进行改造 ,构建高效基因工程菌在水污染治理领域具有可行性 .图 6表 1参 12     

四川盆地大豆根瘤内生细菌的分离鉴定及促生效果

以四川盆地大豆根瘤为材料,采用划线法分离内生细菌、16S rDNA PCR-RFLP分析其遗传多样性,并结合菌株促生特性和盆栽试验筛选优良促生菌.从分离获得的130株内生细菌中选取了40株细菌作为供试菌株,16S rDNA序列表明分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium).以大豆为供试作物筛选出了12株具有促生能力的细菌,所有菌株均能分泌吲哚-3-乙酸(IAA),浓度达到0.353-32.404μg/mL;7株能产铁载体,活性单位为7.35%-34.31%;有11株具有溶磷能力,溶磷量达到4.26-10.6μg/mL;6株具有固氮能力.接种12株供试菌株后,玉米的农艺性状、植株全氮和全磷含量均优于单施化肥处理,其中菌株DA16-5效果最好,表现出良好的促生潜力.综上,四川盆地大豆根瘤内生菌遗传多样性丰富并且普遍具有促生能力,是重要的生物资源.     

紫花苜蓿根际氢氧化细菌的分离与鉴定

利用气体循环培养体系从陕西乾县HUP-豆科植物紫花苜蓿(Medicago sativa)根际土壤中分离获得37株细菌.菌株氧化氢能力测定结果表明,8株菌氧化氢和自养生长能力较强,初步确定为氢氧化细菌类群;根据其形态特征、培养特征和生理生化特性,鉴定为7个不同属:假单胞菌属(Pseudomonas)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、脂肪杆菌属(Pimelobacter)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、勒米诺氏菌属(Leminorella)、地杆菌属(Terrabacter)和稀有杆菌属(Rarobacter);其中氧化氢能力最强的优势菌株WMQ-7 16S rDNA序列(GenBank登录号为EU807744)长度为1 451bp,GC含量为53.8%,其核苷酸序列与假单胞菌属同源性高于99%,在系统发育树上位于同一分支,将WMQ-7菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas).图2表5参16     

应用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记技术验证含羞草根瘤菌的结瘤能力

对云南省热带及亚热带地区的含羞草根瘤菌进行了分离,选择其中40株菌为接种菌株,通过结瘤试验并采用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记方法研究了其结瘤能力.经过结瘤试验,发现除菌株SWF66075和SWF66093没有结瘤外,其它38株菌株均与含羞草植物结瘤.结瘤率为95%.从结瘤试验所获根瘤中,分离得到结瘤菌株,采用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记对结瘤菌株与接种菌株进行了比较研究.蛋白图谱及聚类分析显示,26株接种菌株与其结瘤菌株的全细胞蛋白分子图谱完全相同,在100%的相似水平上与其结瘤菌株聚在一起,说明宿主植物所形成的根瘤确系接种菌株侵入所致,因而可将这些菌株确认为根瘤菌菌株;而SWF66012、SWF66029、SWF66044和SWF66058等12株菌株的结瘤菌株与其各自接种菌株的全细胞蛋白图谱存在较大差异,推测这12株接种菌株与其结瘤菌株可能不是同一菌株,尚不能确定它们与含羞草植物的结瘤能力,这些菌株是否为根瘤菌菌株仍需进一步验证.研究结果表明,全细胞蛋向SDS-PAGE分子标记技术是一种快速、准确地验证根瘤菌结瘤能力的方法.该方法进一步完善了结瘤试验,并初步揭示了根瘤菌的竞争结瘤能力,适用于对大量根瘤内分离菌株进行根瘤菌的证实研究.图2参28     

四川省部分豆科植物根瘤菌的遗传多样性

从四川省豆科植物鸡眼草属、合欢属、豇豆属、葛属、金合欢、杭子梢分离获得了103株根瘤菌,采用AFLP、BOXAIR-PCR研究了这些菌株的遗传多样性.结果表明,分离自四川省豆科植物6个属的根瘤菌存在明显的遗传多样性,AFLP分析中,全部供试菌株的相似性为21%,全部供试菌株可分为26个AFLP遗传群;BOXAIR-PCR聚类分析结果表明,103个菌株分在70%相似性水平处,供试菌株被分为18个BOX遗传群.除部分菌株外,多数根瘤菌按宿主类型聚群,同一宿主而地理来源不同的根瘤菌分布于不同的遗传群,表明宿主和地理环境对根瘤菌具有深刻影响.图3表1参9     

嗜盐光合细菌的分离鉴定及其营养成分分析

从大连海岸的海泥中分离到 4株海洋光合细菌 :菌株C4 10、菌株DS2、菌株E3 和E4,它们都能在厌氧光照下营光异养生长 ,菌株C4 10还能够利用还原性硫化物营光自养生长 .依菌对NaCl的需求 ,菌株C4 10、DS2归属于嗜盐光合细菌 ,菌株E3 和E4属于耐盐光合细菌 .根据形态和培养特征、生理生化特征、光合作用内膜结构、泛醌组成、(G +C)的摩尔百分比等指标 ,菌株C4 10鉴定为Rhodovulumsulfidophilus (嗜硫小红卵菌 )、菌株DS2鉴定为Rhodobiummarinum (海红菌 )、菌株E3 和E4鉴定为Rhodobacterazotoformans.4株菌的营养成分分析表明 ,它们的细胞的最大生长量为 4× 10 9mL-1.粗蛋白含量占细胞干重的 5 5 %左右 ,菌株DS2高达 6 4 .2 % .4菌株所含氨基酸种类齐全 ,特别具备人和动物所必需的氨基酸 .4株菌均含有辅酶Q10和类胡萝卜素 .其中菌株C4 10的类葫萝卜素含量最高 .图 1表 6参 14     

两株吡啶降解菌的分离与鉴定

为了研究石油污染土壤中含氮杂环化合物的降解情况,该研究选择吡啶作为目标污染物,采用选择性富集培养的方法,从45份石油污染土壤样品中,分离得到260株降解吡啶污染物的高效降解菌株,选择降解效率最高的2株吡啶降解菌命名为菌株4-11和2-13,进行种属鉴定、细菌的生长情况和吡啶降解性能的考察.实验证明,60 h菌株4-11和2-13对质量浓度为1000 mg·L-1吡啶的降解率分别达到65.5%和64.1%.通过形态学、生理生化鉴定和16S rDNA序列比对分析,确定菌株4-11属于产硫酸杆菌(Thiobacillus)与Thiobacillus intermediu 同源性最高,为99.8 %,菌株2-13属屈挠杆菌(Flexibacter)与 Flexibacter giganteus同源性最高,为99.9 %.     

低温纤维素降解菌的分离与鉴定

对内蒙古部分地区土壤中低温降解纤维素的微生物进行研究,以期获得一些高酶活的低温纤维素酶产生菌.采用纯培养的方法,在10℃下培养获得纯培养物.以细菌16S rDNA通用引物PCR扩增后进行序列同源性比对确定种属.以DNS法测定纤维素酶活性,并对酶活较高的菌株进行产酶条件的优化.结果共分离得到55株可低温降解纤维素的菌株,16S rDNA序列分析表明它们分别属于γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及β-变形菌纲(β-Proteobacteria).该55株菌的纤维素酶活性均在22℃下最高.其中菌株CF11在10℃下的酶活在分离得到的55株细菌中最高.通过优化,菌株CF11产纤维素酶的最佳条件初步确定为pH值为6.5,培养时间为10 d,并且是以酵母提取物作为氮源,其纤维素酶活为58.091 IU.因此菌株CF11是一株极具开发潜力的低温纤维素酶产生菌.     

几株光合细菌的表型特征及DNA－NDA同源性分析

对５株新分离的光合细菌从形态、生理生化及ＤＮＡ－ＤＮＡ同源性等方面进行了研究．结果表明，菌株８与深红红螺菌（Ｐｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ）的模式菌株ＡＴＣＣ１１１７０的ＤＮＡ－ＤＮＡ同源性为９７％，菌株３７与沼泽红假单胞菌（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ）的模式菌株ＡＴＣＣ１７００１的ＤＮＡ－ＤＮＡ同源性为８０％；菌株５５与球形红杆菌（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）的模式菌株ＡＴＣＣ１７０２３的ＤＮＡ－ＤＮＡ同源性为７１％；菌株４０和５２分别为另外两个ＤＮＡ同源群．根据各菌株形态、生理生化等表型特征以及ＤＮＡＧ＋Ｃｍｏｌ％和ＤＮＡ－ＤＮＡ同源性分析结果，确定了几株光合细菌的分类地位．     

慢生根瘤菌交叉结瘤及其系统发育关系的研究

选用包括6株花往根瘤菌[Bradyrhizobium sp.(Arachis)]在内的13株慢生根瘤菌，进行了6种豆科植物结瘤试验及共系统发育分析。研究结果表明，慢生根瘤菌与试验的豆科宿主植物间普遍存在交叉结瘤，还发现有些菌株在原宿主外的豆科植物根部形成类根瘤的现象。16S rDNA和23S rDNA的PCR－RFLP分析揭示出这些菌株rDNA基因的差异性，不同宿主来源的慢生根瘤菌株可以同属一个rDNA类型，而从同一宿主中分离的根瘤菌菌株可分属多种不同的rDNA类型，研究结果表明，采用rDNA PCR-RFLP等遗传背景分析的手段，可能筛选出广谱的根瘤菌力株，表4参8。     

扑草净降解菌降解特性、降解基因保守序列的扩增及同源性分析

从受污染农田中分离到一株补草净降解菌FR，经鉴定属于假单胞菌，考察了温度及pH对其降解能力的影响，确定pH7.0,32℃为最适作用条件；设计引物，通过PCR扩增到一条长度约为500bp的降解基因保守片段，通过对该片段部分序列测定及同源性搜索，证实该片段与atzA,triA等均三嗪化合物水解酶基因具有很高的同源性。     

DNA同源性分析最终确定新疆中华根瘤菌（Sinorhizobium xinjiangensis）为一独立种

针对S.xinjiangensis分类地位的争议，从新疆再次分离获得34株快生大豆根瘤菌，在16SrDNAPCR-RFLP分析和SDS全细胞蛋白电泳分群的基础上，进行了16SrDNA全序列相似性和DNA同源性分析.所测4个菌株和S.fredii模式菌株USDA205的16SrDNA全序列有很高的相似性.而DNA同源性分析说明新分离的菌株代表与原定的S.xinjiangensis为一个DNA同源群.其模式菌株CCBAU110与S.fredii的2株参比菌株USDA194、2048之间的DNA同源性分别为31.5%和28.7%.S.fredii的模式菌株USDA205与新分离的菌株代表及原定的S.xinjiangensis的模式菌株和2个参比菌株之间的DNA同源性为20.8%～39%，远低于70%.属于种水平上的差异.按照国际细菌分类委员会以DNA同源性≥70%且△Tm≤5℃作为定种的标准，S.xinjiangensis是Sinorhizobium属中不同于S.fredii的一个独立的种.表3参20     

费氏中华根瘤菌lrp基因的克隆、突变与功能

通过分子克隆技术,从费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HN01基因组文库中克降到一个lrp基因.该基因与已报道的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)1021的lrp基因在核苷酸水平上有89%相似性,在氨基酸水平上有99%相似性.利用自杀质粒pK18mob构建含有lrp基因部分片段的重组质粒,通过三亲本结合后导入原始菌株HN01中,经过同源单交换,获得发生正向插入突变的突变株GXHNLTA和反向插入突变的突变株GXHNLTB.将lrp基因ORF连接到载体pLAFR3上,获得用于互补的质粒pGXHNL100,将该质粒通过三亲本接合导入突变株中,获得互补株GXHNWA、GXHNWB.对野生型菌株、突变株、互补株进一步研究发现,在以脯氨酸、亮氨酸、丝氨酸等氨基酸为唯一碳、氮源的MM培养基中培养时,突变体GXHNLTA、GXHNLTB的生长均滞后于出发菌株HN01.植株试验表明,突变菌株GXHNLTA、GXHNLB比野生菌株HN01开始结瘤的时间提前1 d,在结瘤效率、单株瘤数、瘤重、固氮酶活性方面并无显著差别.     

紫色土硅酸盐细菌的表型特征及溶磷解钾能力

对40株分离自四川、重庆等地的代表笥紫色土中的硅酸盐细菌和1株参照菌株进行了52个表型性状的数值分析，探讨了硅酸盐细菌液体振荡培养后pH值、菌数变化与溶磷、解钾量之间的关系，结果表明：紫色土硅酸盐细菌绝大部分属于胶胨样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus），但在个体和群体生长特征、碳氮源利用、硝酸盐还原能力、耐Ⅰ菌株在86％相似水平分为2个亚群，不同的硅酸盐细菌菌株的溶磷、解钾特性差异较大，具有溶磷解钾双重特性的菌株约占供试菌株（含参考菌株）的22％，只具溶磷特性的约占29％,其溶磷效果较显著（有效磷增加最高达40.64%），而解钾效果不明显（有效钾增加最多的只有7.9%）。供试紫色土硅酸盐细菌的溶磷、解钾特性与菌株生长过程中产酸有关，其溶磷、解钾量与培养液中pH值的降低呈正相关，图5表3参20。     

无苯酚培养基分离到的降酚菌多样性的分子分析

用3种不含苯酚的培养基(YPG、10%YPG和LB)从上海焦化厂废水处理系统(A2/O法)好氧池的悬浮污泥分离到24株降酚菌株.通过16SrDNAPCR扩增产物的限制性酶切分析(amplifiedribosomalDNArestrictionanalysis,ARDRA)、ERICPCR指纹图谱分析、多组分苯酚羟化酶大亚基(thelargestsubunitofthemulticomponentphenolhydroxylase,LmPH)基因的PCR扩增及16SrRNA基因测序的方法对这些降酚菌株进行表征.通过ARDRA分型,将这24株降酚菌株分为8个类型;利用ERICPCR可以将这24个菌株分为17种类型,说明同一ARDRA类型内菌株具有多样性.对17个ERIC类型代表菌株的16SrDNA扩增产物进行克隆并测序,测序结果在GenBank和RDP中进行比对.结果表明,与这17个代表菌株同源性最高的菌中,有6株是未见报道具有降酚功能的菌株.在这24株降酚菌中,有19株在苯酚含量为200mg/L的MP培养基中培养5d,苯酚降解率为20%左右,其余5株苯酚降解率达到100%,且均属于Rhodococcus属.本研究在降酚菌生物多样性上作了有益的探索.图2表1参20     

九层塔内生细菌系统发育分析及生物学功能

九层塔(Ocimum basilicum L.)为一年生唇形科药食两用植物.为研究野生九层塔植株内生细菌的多样性及生物学功能,采用LB、VM、DN和CCM4种培养基从植物不同部位中分离纯化内生细菌,利用IS-PCR插入序列指纹图谱技术进行聚类分析,通过16S rRNA基因测序分析对内生细菌进行分子鉴定及系统发育分析,进一步采用传统方法鉴定各类群代表菌株的生物学功能,并选取功能性较强的菌株进行水稻种子萌发及盆栽促生试验.结果显示,从九层塔中分离获得48株内生细菌,聚为13个类群,表现出九层塔内生菌的多样性;生物学功能测定显示所获得内生菌功能丰富:9株具有固氮功能,8株具溶磷功能,10株具有解钾能力,12株具有分泌生长素的能力,7株具有分泌铁载体功能;筛选出2个促生功能优良的菌株,分别为H1041和H4039,其发酵液能显著地促进水稻种子萌发和水稻生长.本研究表明从野生植物九层塔中分离所得的内生菌具有种群多样性和功能多样性,这些兼具不同功能的菌株具有农业应用开发的价值和意义.(图6表3参62)     

陵水普通野生稻(Oryza rufipogon)内生菌的固氮及溶磷特行

从陵水普通野生稻中分离了36株内生菌,经乙炔还原法确定22株菌为内生固氮菌,并测定了其溶磷特性.在22株内生固氮菌中,除菌株Ls2不具有溶磷能力外,其余21株菌溶磷能力差异较大,为(0.002±0.01)~(12.7±0.04)μgmL-1.将这些内生固氮菌接种籼型水稻华航1号,除菌株Ls23外,其余菌株均能使接种水稻苗的根、茎长度增加(在α=0.05水平上差异显著).以上研究结果表明,这些菌株在水稻菌肥研制方面具有较大的开发潜力.图2表3参21     

紫云英根瘤菌的系统发育多样性

在筛选根瘤菌与不同紫云英品种高效结瘤的基础上,通过16S rRNA基因序列分析,对13株共生结瘤效果好的菌种进行了系统发育研究.结果表明,13株菌属于3个主要聚类群,分别与Mesorhizobium、Agrobacterium和Stenotrophomonas亲缘关系最为接近,种类多样性较为丰富;其中编号为ACCC13065株的菌株与S.rhizophila16S rDNA序列相似性为100%,位于γ-变形菌纲,这是除α-变形亚纲、β-变形亚纲外所发现的一类新的根瘤菌类型.     

云南腾冲热泉极端嗜酸热硫化叶菌多样性研究

硫化叶菌(Sulfolobus)是极端嗜热古菌遗传机制研究的重要模式菌株,广泛分布于酸性热泉中.对分离自云南腾冲酸性热泉的11株极端嗜酸热菌株进行16S rRNA基因序列测定,并通过菌体形态观察、16S rRNA基因可变区序列比较、菌株16S rRNA基因相似性比较及系统发育分析,研究腾冲热泉硫化叶菌的多样性.结果表明,分离自腾冲热泉的11株硫化叶菌的16S rRNA基因序列与分离自世界上其它地区的8个硫化叶菌的标准菌株的相似性为85.8%～94.9%,与同样分离自腾冲热泉的S.tengchongensis标准菌株的相似性为96.6%～97.5%,在分类学上具有形成新种的可能.在16S rRNA基因高可变区序列上,与分离自世界上其它地区的8个硫化叶菌的标准菌株存在明显的差异.系统发育分析表明,分离自腾冲热泉的硫化叶菌在系统发育树上形成两个亲缘关系较为紧密的簇群,可见腾冲热泉硫化叶菌不仅具有一定的多样性,同时具有较明显的地域性特征.