青霉菌发酵生产β-葡萄糖苷酶培养基优化及纤维素酶可溶性诱导物制备

在纤维素酶生产过程中,常用的固体诱导物存在着诱导效率低、传质阻力大和不易于流加培养等局限性,所以利用β-葡萄糖苷酶催化葡萄糖生产槐糖等可溶性诱导物进行纤维素酶发酵具有重要意义.为实现β-葡萄糖苷酶的低成本高效生产,首先利用本实验室分离的β-葡萄糖苷酶生产菌Penicillium sp.YH02为产酶菌株,利用响应面法对麸皮、麦草和微晶纤维素3个参数浓度进行优化,优化后β-葡萄糖苷酶酶活提高15.03%.其次,利用菌株YH02所产的β-葡萄糖苷酶,以高浓度葡萄糖为底物进行转糖苷反应,合成诱导里氏木霉(Trichodema reesei)产纤维素酶的可溶性诱导物.结果表明,以10 g/L该可溶诱导物为碳源时,里氏木霉Rut-C30在48 h时滤纸酶活比未进行催化反应的葡萄糖对照高24.9倍.离子色谱分析结果表明,高浓度葡萄糖经过菌株YH02分泌的β-葡萄糖苷酶催化后产生具有诱导能力的槐糖、龙胆二糖和纤维二糖.本研究实现了β-葡萄糖苷酶的高效生产并成功制备了可溶性诱导物,为降低纤维素酶生产成本提供了参考.(图4表1参22)     

青霉木质纤维素降解酶系研究进展

越来越多的研究表明青霉属(Penicillium)真菌中的一些种类不仅能分泌组成齐全、酶活较高的木质纤维素降解酶系,而且具有易培养和生长快的优势.本文就国内外对青霉菌木质纤维素降解酶系研究的最新动态进行了综述,包括菌株的选育、纤维素酶系的特性与合成调控,以及基因分析与克隆.同时介绍了斜卧青霉纤维素酶系的生产与发酵工艺,以及酶解过程分析等相关研究进展.表4参48     

细胞表面展示木聚糖酶对纤维素酶水解底物的协同促进作用

为了解木质纤维素水解过程中木聚糖酶作为辅助酶对纤维素酶的协同促进作用,采用实验室保存的单展示3种纤维素酶(内切葡聚糖酶EGII、外切葡聚糖酶CBHII和β-葡糖苷酶BGLI)和2种木聚糖酶(β-D-1,4内切木聚糖酶Xyn II和β-D-1,4外切木聚糖酶Xyl A)的酿酒酵母功能菌群,以蒸汽爆破玉米秸秆为底物进行乙醇发酵实验(SSF).结果显示,以蒸汽爆破玉米秸秆为底物时,加入纤维素酶和木聚糖酶共发酵96 h的最高乙醇浓度达到0.695 g/L,乙醇产率为0.254 g/g,相当于理论值的49.8%,纤维素酶与木聚糖酶之间的协同因子(DS)最高达到1.16(始终大于1).本研究表明在细胞表面展示体系中适量添加木聚糖酶对纤维素酶水解底物具有较明显的促进作用,为直接以木质纤维素为原料制取纤维素乙醇提供了一定的可行性依据,可通过调节单展示酵母细胞在菌群间的动态比例实现对酶协同作用的优化调控.     

不同碳源对两株真菌纤维素酶合成的诱导和调控

定时测定B-6(Aspergillus sp.)、AS3.3711(Trichoderma sp.)在各类碳源中的纤维素酶活力，结果发现，酶的合成受培养基中碳源性质的调节控制。结构相对完整的纤维类物质（α-纤维素粉、微晶纤维素）诱导活性较高，电泳结果表明，纤维素酶系是协同表达的，但酶系各组分的百分比在不同的诱导条件下却各不相同。在测定糖耗与酶活力的关系中发现纤维二糖直接诱导B-6纤维素酶的合成，对AS3.3711则起了间接诱导作用，其经菌体代谢后的某种转化产物才是AS3.3711纤维素酶合成的真正诱导源。图6表1参14     

木质纤维素生产燃料乙醇的关键技术研究现状

木质纤维素是自然界广泛存在且廉价的可再生资源.其主要成分纤维索、半纤维素是潜在的燃料乙醇生产原料.虽然由木质纤维素生产燃料乙醇的技术路线已具可行性,但存在着具体工艺环节复杂、生产能耗高等局限,严重阻碍了其规模化生产.目前纤维素燃料乙醇生产主要围绕预处理、酶解、发酵三大关键步骤进行技术攻关,其中预处理的能耗和效率、发酵过程的五碳糖利用等问题成为该工艺的重要制约因素.本文在综述国内外纤维素乙醇生产关键步骤的基础上,着重分析了各种物理、化学和生物预处理的优缺点以及新兴的预处理思路,归纳了各类纤维素乙醇生产菌的特点,包括耐高温和五碳糖的利用,并介绍了当前主要的发酵方式和优化措施,以期为木质纤维素生产乙醇提供新的研究思路.表5参86     

低温纤维素降解菌的分离与鉴定

对内蒙古部分地区土壤中低温降解纤维素的微生物进行研究,以期获得一些高酶活的低温纤维素酶产生菌.采用纯培养的方法,在10℃下培养获得纯培养物.以细菌16S rDNA通用引物PCR扩增后进行序列同源性比对确定种属.以DNS法测定纤维素酶活性,并对酶活较高的菌株进行产酶条件的优化.结果共分离得到55株可低温降解纤维素的菌株,16S rDNA序列分析表明它们分别属于γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及β-变形菌纲(β-Proteobacteria).该55株菌的纤维素酶活性均在22℃下最高.其中菌株CF11在10℃下的酶活在分离得到的55株细菌中最高.通过优化,菌株CF11产纤维素酶的最佳条件初步确定为pH值为6.5,培养时间为10 d,并且是以酵母提取物作为氮源,其纤维素酶活为58.091 IU.因此菌株CF11是一株极具开发潜力的低温纤维素酶产生菌.     

一株嗜酸性产纤维素酶真菌的特性及产酶条件优化

从四川海螺沟原始森林腐土中分离到一株嗜酸性产纤维素酶的真菌X-13,其主要特点是产纤维素酶的最适pH及其纤维素酶最适反应pH均为2.0.在PDA培养基上培养时菌落呈浅黄色至肉桂色,反面呈黄色至棕褐色,产黄色色素;菌丝体透明有隔膜,分生孢子呈球形或近球形.根据菌株的形态特征以及ITS序列同源性和系统发育分析结果,鉴定该菌株为土曲霉(Aspergillus terreus Thom).该菌最佳产酶培养时间为8～10 d;最适产酶温度为30℃,纤维素酶最适反应温度为50℃;最佳碳源、氮源分别为纤维素粉和硫酸铵.通过响应面法对菌株产纤维素酶条件进行优化,使菌株X-13纤维素酶活从1.39 IU/mL提高到2.94 IU/mL,提高了111.5%.     

产纤维素酶菌株的选育分析及发酵工艺优化

对实验室6株产纤维素酶菌株进行酶活特性研究.首先通过观察纤维素平板的酶溶解透明圈大小进行初步分析,比较6株菌种子发酵液中纤维素酶含量.再根据不同种纤维素酶作用的底物化学键的不同,分别测定菌株的滤纸酶活(FPA)、纤维素内切葡聚糖酶(CMCase)活、纤维素外切葡聚糖酶(CBH)活和β-葡萄糖苷酶酶活,发现菌株中黑曲霉的各产酶指标均高于其它菌株.根据Box-Behnken原理对黑曲霉发酵工艺进行优化设计,得到最适碳源稻草粉含量9.47 g.L-1、麸皮含量49.33 g.L-1,氮源中(NH4)2SO4含量为2.0 g.L-1,发酵后黑曲霉产生的滤纸酶活力达到76.72 U.mL-1,比优化前酶活力提高88.69%.     

一株产耐热纤维素酶菌株的筛选及酶学性质

采用纤维素刚果红平板法从大田蘑菇种植场建堆的稻草样中分离得到了1株能产具有较好温度耐受性和pH稳定性的纤维素酶的放线菌DY3.综合形态、生理生化特征以及16S rDNA序列分析,将其初步鉴定为嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca).对该菌所产纤维素酶的性质研究表明:最适催化温度为65℃,在70℃保温60 min后仍有75%以上的活力;最适催化pH为7.5,在pH 5.5～10.0之间该酶的稳定性较好,pH 10.0的条件下仍有80%的活力;最适作用底物是羧甲基纤维素钠.研究可为木质纤维素的生物预处理提供一定参考价值.     

不同碳源条件下草菇内切型纤维素酶基因（eg1）转录表达的分析

利用Northernblot方法分析了不同碳源条件下草菇切型纤维素酶基因(eg1)的表达.结果发现,在含有纤维素的液体培养基中生长10d,eg1在草菇菌丝中有高效表达;纤维二糖、α-乳糖、β-乳糖,也能诱导eg1的表达,但和纤维素相比,eg1的表达量相对较低,并且它们的诱导效应在加入这类糖12h后迅速减弱;槐糖和龙胆二糖的诱导作用非常弱.在天然稻草为基质的固体栽培料生长时,草菇eg1的表达和草菇菌丝生长与出菇相对应,在菌丝生长期(d8)可见eg1的表达,d12时菌丝已长满,表达减弱,在出菇及菇体的分化及增大期,eg1的表达量逐渐增强,在成熟期达到最高水平;表明在草菇菇体发育中需要更多碳源及能源的补充,eg1在这方面起着非常重要的作用.图4参14     

不同碳源条件下草菇内切型纤维素酶基因(egl)转录表达的分析

利用Northern blot方法分析了不同碳源条件下草菇內切型纤维素酶基因(eg1)的表达.结果发现,在含有纤维素的液体培养基中生长10 d,eg1在草菇菌丝中有高效表达;纤维二糖、α-乳糖、β-乳糖,也能诱导eg1的表达,但和纤维素相比,eg1的表达量相对较低,并且它们的诱导效应在加入这类糖12 h后迅速减弱;槐糖和龙胆二糖的诱导作用非常弱.在天然稻草为基质的固体栽培料生长时,草菇eg1的表达和草菇菌丝生长与出菇相对应,在菌丝生长期(d 8)可见eg1的表达,d 12时菌丝已长满,表达减弱,在出菇及菇体的分化及增大期,eg1的表达量逐渐增强,在成熟期达到最高水平;表明在草菇菇体发育中需要更多碳源及能源的补充,eg1在这方面起着非常重要的作用. 图4 参14     

土壤宏基因组文库中纤维素酶的筛选与鉴定

纤维素酶是最重要的工业用酶之一,已广泛应用于食品、纺织、造纸、洗涤和生物燃料生产等多个领域中.为挖掘微生物来源的纤维素酶,基于功能宏基因组学的方法,筛选云南土壤宏基因组文库获得具有纤维素酶活性的阳性克隆;通过构建亚克隆和测序分析确定纤维素酶的编码基因,将其克隆到表达载体上并转化到大肠杆菌中构建重组表达系统,诱导蛋白表达后对纤维素酶酶学性质进行分析.通过筛选约65万个文库克隆,获得一个有纤维素酶水解活性的克隆,预测该纤维素酶基因全长为1 419 bp,编码蛋白分子量(Mr)为50.99×103,蛋白的氨基酸序列与Rhizobacter sp.S-16中的内切葡聚糖酶有88.66%的相似性,蛋白同源比对结果表明该酶属于糖苷水解酶第五家族(GH5),将其命名为YNEG5;对YNEG5的生化特性进行分析,确定其最佳反应温度为66℃,最适pH为4.8,该酶热稳定性良好且对工业试剂尿素具有较强的耐受性.本研究基于功能宏基因组学技术获得一个具有工业应用潜能的纤维素酶,可为不可培养微生物中纤维素酶的挖掘提供参考.(图10表1参36)     

一株产木聚糖酶嗜热真菌樟绒枝霉的鉴定及其产纤维质降解酶系分析

对分离得到的一株产耐热木聚糖酶的真菌CAU521进行鉴定,并对其产纤维质降解酶系进行研究.通过菌落形态、显微镜产孢结构以及18S rDNA序列同源性比对等分析,鉴定该菌为樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea),其最适生长温度为45℃,为一株嗜热真菌.该菌能以农业废弃物玉米芯为碳源液体发酵产耐热木聚糖酶,50℃下培养7 d,木聚糖酶的最高酶活力达到173 U/mL.SDS-PAGE和酶谱分析表明该菌株能同时分泌多种纤维质降解酶:4种木聚糖酶、2种纤维素酶、3种葡聚糖酶和1种甘露聚糖酶.结果表明樟绒枝霉CAU521在降解和利用纤维质材料方面具有潜在的应用价值.     

极端嗜热厌氧纤维素菌的分离鉴定、系统发育分析及其酶学性质的研究

从云南高温温泉、油井等热源地区采集的大量样品中,获得了一株特殊的极端嗜热厌氧纤维素分解菌B2.分离菌株直杆,革兰氏阴性(G-),未观察到孢子,细胞单个或成对出现.菌体大小为0.4μm×(2-4)μm,严格厌氧,生长温度范围50-70℃,最适生长温度65℃.pH范围4-8,最适pH 7.0.在纤维素粉琼脂上菌落直径2-4 mm,乳白色.分离菌株能利用纤维二糖、葡萄糖、蔗糖、松子糖、淀粉、覃糖等作为碳源,分离菌株还可利用纤维素滤纸、纤维素粉、微晶纤维素、纤维素粉MN300和甘蔗渣、水稻秸杆.发酵纤维素产生乙醇、乙酸.在菌株B2的纤维素酶系中,C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶的最适温度分别为80℃、80℃和70℃,其比值为1:9:10,同时发现Cx酶具有较高的热稳定性.部分长度的16S rDNA序列分析表明,分离菌株B2与Thermoanaerobacter ethanalicus具有99.8％相似性.分离菌株B2为Thermoanaerobacter属.图5表3参21     

不同糖发酵条件下酿酒酵母组成型启动子和诱导型启动子评价

木糖是秸秆等纤维素类生物质原料中含量仅次于葡萄糖的第二丰富的糖,构建可高效发酵木糖的酿酒酵母菌株是提高原料利用率、降低纤维素燃料乙醇生产成本的基础.外源基因的高效表达以及本源基因的调控都需要选择表达强度合适的启动子.基于比较转录组,在全基因组水平上比较解析酿酒酵母所有基因在发酵葡萄糖、发酵木糖、发酵混合糖(葡萄糖和木糖)条件下的表达强度,拟为构建木糖利用菌株提供一系列备选的启动子库.结果表明,碳源种类对酿酒酵母启动子的强度有显著影响,绝大多数启动子强度受碳源影响显著,有67个启动子的强度在不同碳源条件下保持了相对稳定;启动子P_(TEF1)和P_(TEF2)、P_(ADH1)、P_(CCW12)和某些核糖体蛋白基因启动子可在构建木糖利用菌株时作为组成型强启动子,另有中、弱强度的组成型启动子可用于基因表达优化;启动子P_(YNR071C)、P_(PUT1)、P_(DSF1)等可作为利用木糖时的诱导型启动子,使基因在有需要的时候才进行表达.本研究在系统解析全基因组启动子强度和碳源种类的关系基础上,为构建利用不同碳源的酿酒酵母菌株提供了具有不同表达特征的候选启动子库.(图1表6参24)     

秸秆污泥堆肥产纤维素酶细菌的筛选及产酶条件优化

从添加秸秆进行堆肥处理的污泥中采集样品,通过富集培养和刚果红平板染色法筛选分离出具有纤维素降解能力的细菌,再通过酶活力测定从中分离筛选出1株相对高活性的产纤维素酶细菌CI;通过基于16S rRNA基因序列的系统发育分析,初步确定该菌株为Devosia sp..利用单因素试验对目的菌株C1进行产纤维素酶发酵条件优化,结果表明菌株C1产纤维素酶的最佳发酵时间、培养温度、摇床转速以及最适初始pH值分别为60 h、30℃、130 r·min^-1和7.2～7.5,且在该条件下其滤纸酶（FPase）和羧甲基纤维素酶（CMCase）活力分别达23.10和54.97 U·mL^-1.     

黑胸散白蚁纤维素酶的体外酶学特性

采用DNS法研究了我国广泛分布的一种低等木食性白蚁——黑胸散白蚁纤维素酶的体外酶活特性以了解其纤维素降解机制.结果表明,内切β-1,4-葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)这3种酶的最佳反应时间均为15 min,最佳底物浓度为1%,最适反应pH为5.6,最适反应温度为35℃.在最适反应条件下,EG、CBH和BG的活性分别达到71.3(±13.9)U/mg、5.8(±0.8)U/mg和4.1(±0.7)U/mg.EG在体外的热稳定性较差,在50℃及更高温度酶活很低或完全失活,但该酶对pH稳定性较好,在pH 3.2～8.0范围内酶活力变化不大.Native-PAGE电泳检测到该白蚁体内至少有8种不同的EG活性条带,肠道不同部位纤维素酶活性条带种类不同.这些研究表明,木食性白蚁降解纤维素是一个复杂的过程,需要多种纤维素酶的共同作用.     

产中性纤维素酶芽孢杆菌Y106产酶条件优化

筛选得到一株高产中性纤维素酶的芽孢杆菌Ｙ１０６,并对其发酵条件进行了优化,麸皮能够较大幅度地促进产酶,果糖是良好的诱导物,有机氮流促进产酶的效果优于无机氮源,最优的有机氮源是蛋白胨。Ｆｅ＾３＋、Ｆｅ＾２＋、Ｎａ＾＋、Ｃａ＾２＋可以促进纤维素酶的合成,而Ｃｕ＾２＋、Ａｇ＾＋、Ｃｏ＾２＋、Ｈｇ＾２＋则对合成起遏制作用,在酶反应系统中Ｆｅ＾３＋、Ｆｅ＾２＋、Ｃａ＾２＋、Ｍｇ＾２＋能激活纤维素酶活性,Ｃｏ     

尖孢镰刀菌致病相关因子及其分子生物学研究进展

由致病性尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)侵染引起的植物枯萎病是一种世界性的土传真菌病害,对农业生产造成了巨大经济损失.研究表明,尖孢镰刀菌的致病与多种致病因子相关,包括信号传导系统(环腺苷酸单磷酸-蛋白激酶A和促分裂素原活化蛋白激酶信号途径)、细胞壁降解酶(木聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、细胞毒素、纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶等)、克服植物防御响应系统(降解抗真菌化合物和破坏植物细胞壁的化学修饰)以及其它(细胞毒素和过氧化物酶)等.此外对今后的研究工作提出展望.参26     

不同配方培养料生产双孢蘑菇过程中主要木质纤维素降解酶及物料组分的变化

为探讨双孢蘑菇生产过程木质纤维素的利用情况,以麦草秸秆、玉米秸秆和杂草秸秆为主料的3种不同配方的培养料为研究材料,分别测定各配方培养料不同时期主要胞外木质纤维素降解酶活性和木质纤维素组分(纤维素、半纤维素和木质素)的相对含量,并统计各配方产量.结果显示,麦草配方(FWS)的纤维素酶总活性和木聚糖酶活性不断升高,出菇期达到稳定;玉米秸秆配方和杂草配方堆肥期的纤维素酶总活性保持在1 U/g左右,发菌期大幅升高,出菇期先稳定后下降,木聚糖酶活性始终保持在7.97-23.85 U/g之间;3个配方的漆酶活性在堆肥期未检测到,发菌期升至最高,出菇期快速降低.3个配方堆肥期纤维素和半纤维素的相对含量明显下降,木质素相对含量则几乎不变.发菌及出菇期木质素与半纤维素的相对含量较纤维素的下降明显.3个配方双孢蘑菇的产量关系为麦草配方(30.00 kg/m~2)玉米秸秆配方(17.21 kg/m~2)杂草配方(16.67 kg/m~2).本研究表明堆肥期主要为堆肥微生物及物理化学作用降解纤维素和半纤维素,发菌期则主要是双孢蘑菇菌丝利用木质素;从播种至三潮菇清床,双孢蘑菇菌丝主要利用木质素和半纤维素;本研究中麦草配方是栽培双孢蘑菇的最佳培养料,而玉米秸秆配方和杂草配方有待进一步优化.