基于杀螨剂靶标朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶体外表达的新型杀螨活性化合物筛选

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是保证神经信号在生物体内正常传递的关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的作用靶标.本研究在前期朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶基因原核表达及最适反应条件摸索的基础上,大规模表达纯化朱砂叶螨AChE,进一步研究其酶学性质.研究结果显示,在温度为25℃、其他条件最适的情况下,测定酶K_m值为0.67 mmol/L,K_(cat)/K_m值为13.53 mmol L~(-1) s~(-1).随后,从SPECS化学库筛选到了55个候选AChE抑制性化合物,获得了9个抑制活性优于或相当于毒扁豆碱的朱砂叶螨AChE抑制化合物,并且它们对朱砂叶螨有较好的毒性.本研究为乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选以及以乙酰胆碱酯酶为靶标的农药开发提供了理论依据和实验基础.     

高效氯氰菊酯急性暴露中斑马鱼相关酶活性和基因表达变化

高效氯氰菊酯广泛地应用于农业生产及日常生活中的害虫防治,但对水生生物却毒性极高。为探究高效氯氰菊酯对斑马鱼的急性毒性,以总超氧化物歧化酶(总SOD)、过氧化氢酶(CAT)和乙酰胆碱酯酶(ACh E)活性以及相关的基因表达量变化为检测指标,研究其对斑马鱼成鱼的影响。急性毒性试验结果显示,高效氯氰菊酯对斑马鱼属剧毒物质,斑马鱼的急性中毒症状为身体蜷曲、抽搐,鳃盖扇动加快,游动能力减弱,间歇性出现无规律急速游动和撞壁行为。酶活测定结果显示,斑马鱼组织中总SOD、CAT和ACh E活性与高效氯氰菊酯呈现低浓度诱导、高浓度抑制的剂量效应关系;相关基因表达量的检测结果显示,高效氯氰菊酯会诱导斑马鱼肝脏、肠和脑中Sod1、Cat以及Ache的m RNA表达上调。研究表明,高效氯氰菊酯的神经毒性和氧化损伤共同造成了斑马鱼的中毒甚至死亡。     

重组BALB/C鼠冷诱导RNA结合蛋白CIRP多克隆抗体的制备与鉴定

冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)是第一种在哺乳动物细胞中被发现的冷休克蛋白,伴随着细胞冷应激过程过量表达.为进一步研究冷诱导RNA结合蛋白CIRP的生物学功能,构建重组BALB/C鼠CIRP的原核表达载体,重组BALB/C鼠CIRP蛋白经NI-NTA亲和树脂纯化后免疫獭兔制备抗CIRP多克隆抗体,以间接ELISA和Western blot检测抗体效价和抗原特异性.本实验成功构建了CIRP的原核表达载体,在E coli XL-1-blue得到了高效表达,利用原核表达包涵体蛋白免疫獭兔获得了高效价的CIRP多克隆抗体,该抗体能识别肝脏和睾丸中天然的CIRP蛋白.图5参14     

急性铜胁迫对海陆蛙蝌蚪抗氧化效应及金属解毒能力的影响

海陆蛙(Fejervarya cancrivora)是红树林半咸水生境中唯一的两栖动物,为了解铜离子(Cu2+)对该蝌蚪的毒性效应,测定了Cu2+对海陆蛙蝌蚪(38-39期)96 h内半数致死浓度LC50;在此基础上,模拟其野外生存环境,分别设计3个铜暴露组(Cu SO4含量分别为80、160、300μg L-1)和对照组,检测海陆蛙蝌蚪在Cu2+暴露24 h、48 h、72 h、96 h后抗氧化能力、乙酰胆碱酯酶(ACh E)活性及金属硫蛋白(MT)表达量的变化。结果显示,海陆蛙蝌蚪对Cu2+24 h、48 h、72 h、96 h LC50分别为5.69、3.37、1.34、0.95 mg L-1。在急性胁迫试验中,各暴露组蝌蚪体内超氧化物歧化酶(SOD)、ACh E活性以及MT表达均被抑制,在同一暴露时间下,处理组SOD、ACh E活性和MT含量显著低于对照组;而在Cu2+胁迫下,蝌蚪体内脂质过氧化反应加剧,表现为丙二醛(MDA)含量显著增多,且染毒浓度越大、暴露时间越长,MDA含量越多。除ACh E外,其他指标组染毒时间与浓度间具有显著的互作效应。本研究表明海陆蛙可作为红树林生境质量评价的指示物种,其中SOD、ACh E活性及MDA含量可作为重金属Cu2+毒性效应评估较敏感的评价指标。     

测定化学物对乙酰胆碱酯酶抑制毒性的微板吸光法研究

随着化学污染物种类与数量的日益增多,高通量测试方法显得越来越重要。基于乙酰胆碱酯酶(ACh E)抑制法原理,以多功能酶标仪为测试设备,96孔微板为暴露反应载体,建立了测定化学物对ACh E抑制毒性的微板吸光法。系统研究了ACh E浓度、碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)浓度、二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)浓度对显色吸光度、吸光度变化速率、化学物测试毒性的影响。结果表明,随着ACh E、DTNB、ATCI的浓度增加,吸光度均增加;吸光度变化速率与ACh E浓度呈正相关,与DTNB浓度基本无关,与ATCI浓度呈现先增后减的双相关系;随着ATCI浓度增加,灭多威剂量-效应曲线(DRC)向右移动。最终建立的优化测试条件为DTNB 0.2 g·L~(-1)、ATCI 0.2 g·L~(-1)、ACh E 0.04 U·m L~(-1)、p H 6.8、反应温度29℃及暴露时间15 min;并与国标方法进行了对比与验证,发现试剂加样顺序对毒性测定结果有显著影响。基于ACh E的微板毒性测试结果表明,灭多威的DRC呈现良好的S型曲线,可用Weibull函数有效表征,拟合决定系数R2大于0.97,空白变异控制在了±10%以内。此方法可用于化学污染物的高通量毒性检测。     

新烟碱类杀虫剂吡虫啉和啶虫脒对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的毒性作用

吡虫啉和啶虫脒是目前使用较广的2种新烟碱类杀虫剂,它们在环境、食品和人体样品中的普遍残留,对人体健康构成威胁,但目前关于其对人的神经毒性仍知之甚少.本文以人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞为模型,采用体外细胞实验,研究不同浓度吡虫啉和啶虫脒暴露对细胞活力、细胞形态、烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)α7亚基的mRNA和蛋白表达、乙酰胆碱酯酶活性以及氧化应激的影响,为这2种杀虫剂的健康风险评价提供依据.实验中,先将SK-N-SH细胞分别暴露于不同浓度的吡虫啉和啶虫脒24 h,通过测定细胞活力,确定2种杀虫剂的10％抑制浓度(IC10)值.在此基础上,设定3个梯度的低暴露浓度(0.01、0.1和1 mmol· L-1)和溶剂对照,研究吡虫啉和啶虫脒对SK-N-SH细胞其他指标的影响(暴露24 h后).细胞活力、氧化损伤和乙酰胆碱酯酶活性分别用相应的试剂盒测定,细胞形态用倒置光学显微镜观察,nAChRs α7亚基的mRNA和蛋白表达分别用RT-qPCR和Western Blot测定.结果 表明,吡虫啉和啶虫脒的IC10值分别约为1.5 mmol· L-1和2.0 mmol· L-1.1 mmo1·L-1吡虫啉对nAChR α7的mRNA表达和蛋白表达均显著提高,对乙酰胆碱酯酶活性有显著抑制,并引起细胞显著的氧化应激(P＜0.05).0.1 mmol· L-1吡虫啉对乙酰胆碱酯酶活性有显著抑制(P＜0.05).1 mmol· L-1啶虫脒对nAChR α7的mRNA表达和蛋白表达均有显著提高(P＜0.05).为进一步揭示吡虫啉的影响,对0.1 mmol· L-1吡虫啉暴露组和溶剂对照组细胞进行了转录组分析,发现吡虫啉暴露对一些神经退行性疾病相关基因及其他一些重要通路相关基因有显著影响.本研究证明,吡虫啉和啶虫脒在非致死浓度条件下会对细胞产生一系列显著影响,吡虫啉的影响大于啶虫脒.     

2种新烟碱类杀虫剂对秀丽隐杆线虫神经毒性研究

新烟碱类(neonicotinoids)是一种类似于烟碱的内吸性杀虫剂,选择性作用于昆虫的中枢神经系统。目前,有关新烟碱类杀虫剂对非靶标生物的生态风险引发了全球的广泛关注。本文采用土壤生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)作为受试生物,探究2种新烟碱类杀虫剂吡虫啉(imidacloprid)和呋虫胺(dinotefuran) 24 h暴露(1μg·L~(-1)～10 mg·L~(-1))后,对秀丽线虫运动行为、摄食行为以及乙酰胆碱酶(ACh E)活性和相关基因(ace,mtl)转录水平的影响。结果表明,2种新烟碱类杀虫剂均对秀丽线虫的生理指标具有随着浓度增加而抑制的效应,其中头部摆动是最为敏感的生理指标,10μg·L~(-1)吡虫啉暴露水平和100μg·L~(-1)呋虫胺暴露水平时,线虫头摆频率相较于对照组有显著减少(P 0.01),其次是身体弯曲摄食AChE活性(吡虫啉)和摄食AChE活性身体弯曲(呋虫胺),相关基因转录水平没有发现与浓度具有相关的效应,但在环境浓度下的暴露有明显的变化。新烟碱类杀虫剂对秀丽线虫的神经毒性作用表明了其对土壤中非靶标生物具有一定的生态风险。     

抗柑桔溃疡病菌可溶性单链抗体的表达及鉴定

前期采用核糖体展示技术筛选了抗柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)高亲和力单链抗体(Single chain variable fragment,scFv)GX13、GX44和GX95,为高效表达具有生物活性的单链抗体,本研究将前期筛选的高亲和力单链抗体基因转入大肠杆菌HB2151中进行可溶性表达,点印迹和Western印迹检测可溶性单链抗体的表达水平,亲和层析纯化表达的单链抗体,酶联免疫吸附法(ELISA)检测纯化单链抗体的抗原结合活性.结果显示,3株抗柑桔溃疡病菌可溶性单链抗体在大肠杆菌HB2151中均获得成功表达,表达产物分子量(Mr)约为32.0×103,主要集中于细菌周质腔中.ELISA检测纯化的单链抗体都具备抗原结合活性,可进一步应用于柑桔溃疡病菌的免疫诊断和病害防治.图4参14     

盐藻LHCB3蛋白的表达纯化及抗体制备

为了解盐生杜氏藻(Dunaliella salina)主要光捕获蛋白LHCB蛋白的功能,将已获得的盐藻Lhcb3基因构建到原核表达载体pET32a-DsLhcb3,通过优化表达条件,建立了高效的重组系统.pET32a-DsLhcb3在大肠杆菌中的优化表达条件为1 mmol/L IPTG在37℃下诱导4 h.采用镍离子亲合层析纯化获得LHCB3蛋白,并以此为抗原制备了多克隆抗体,经琼脂糖扩散检测效价,在1:16处有明显沉淀.提取盐藻总蛋白,经过制备的LHCB3抗体杂交,在29 000处获得两条明显的杂交条带,为进一步研究盐藻LHCⅡ蛋白表达机理奠定了基础.     

氨基甲酸酯类农药对蛋白核小球藻联合毒性作用特点及机制

氨基甲酸酯类农药广泛应用于农业生产中,其在环境中的残留及其对非靶标生物的毒性作用引起关注。以5种氨基甲酸酯类农药包括残杀威、灭多威、抗蚜威、涕灭威和呋喃丹为研究对象,以蛋白核小球藻为受试生物,应用微板毒性分析法系统测定每种农药及其五元混合物对蛋白核小球藻在不同暴露时间(12、24、48、72和96 h)的生长抑制作用,并同步分析农药对蛋白核小球藻的生理特性如叶绿素含量、蛋白质含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明,5种农药对蛋白核小球藻的浓度-效应均具有明显的时间依赖性,农药抗蚜威在中低浓度促进绿藻生长,呈现非单调J型浓度-效应曲线(CRC)特征,其余4种农药的CRC呈现经典S型;以半数效应浓度的负对数(p EC50)为毒性大小指标,5种农药在96 h时毒性大小为:呋喃丹(p EC50=3.43)残杀威(p EC50=2.76)抗蚜威(p EC50=2.12)灭多威(p EC50=2.11)涕灭威(p EC50=1.89)。浓度为EC50的5种农药处理后的蛋白核小球藻中叶绿素和蛋白质含量随暴露时间的延长而减少,但不同农药处理的绿藻中叶绿素和蛋白质含量减少率随暴露时间延长变化趋势稍有不同; SOD酶活性随着暴露时间延长逐渐下降,MDA含量逐渐增加,这说明藻细胞受到破坏,脂质过氧化的损害程度超过细胞修复能力,SOD活性被抑制,细胞的抗氧化能力下降,藻细胞内的H2O2不断积累,导致MDA含量升高。五元混合物对蛋白核小球藻的毒性也具有一定的时间依赖性,并表现出刺激作用,即hormesis现象,且混合物毒性与组分浓度比具有良好的线性相关性;暴露于混合物的小球藻均在96 h出现了刺激效应,其叶绿素与蛋白质含量随暴露时间延长不断增加,SOD活性不断升高,MDA含量不断减少;五元混合物均在96 h呈现出拮抗作用,且与混合物的浓度和组分浓度比相关。     

抗HER2/neu单链抗体增强TNF-α对卵巢癌细胞的抗肿瘤活性

为了探索抗HER2/neu单链抗体与TNF-α联合应用对表面过度表达HER2/neu卵巢癌细胞的生物效应,同时构建了抗HER2/neu单链抗体scFvC6.5的原核表达载体和人TNF-α的原核表达载体,将上述两种重组子分别转化入感受态宿主菌BL21(DE3),得到稳定表达.表达产物主要以包含体形式存在;包含体经过溶解、变性、复性和纯化,得到了分纯的产物.SDS-PAGE和Western-blot检测结果证实,蛋白表达正确.ELISA法验证了scFvC6.5和人TNF-α具有与卵巢癌细胞SKOV-3的结合活性.MTT细胞毒活性试验进一步表明,相对于单独使用TNF-α,联合应用上述两个重组蛋白细胞毒效应明显提高,SKOV-3细胞对TNF-α的敏感性增强.这将为抗HER2/neu抗体的联合抗肿瘤疗法提供一种新的途径,具有潜在的临床应用价值.图5参23     

六溴环十二烷暴露对红鳍笛鲷脑乙酰胆碱酯酶和组织氧化应激的影响及评价

六溴环十二烷(C_(12)H_(18)Br_6,简称HBCD)是近年来在环境中广受关注的优先污染物和高产量化学品。实验室条件下以红鳍笛鲷为研究对象,选取其脑组织非特异性生物标志物超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferases,GST)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)及特异性生物标志物乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,ACh E)为指标研究了不同浓度HBCD溶液(8.6μg·L~(-1)、43.0μg·L~(-1)和215μg·L~(-1))暴露96 h对红鳍笛鲷脑组织的氧化损伤和神经毒性效应,同时结合综合生物标志物响应指数(integrated biomarker responses index,IBR),对HBCD造成的胁迫水平和毒性效应进行评价。结果表明:HBCD对红鳍笛鲷脑组织中SOD活性和GST活性表现出不同程度的诱导效应,其中暴露初期SOD活性与HBCD浓度呈正相关,但随暴露时间延长与HBCD浓度呈负相关;HBCD对MDA含量和ACh E活性表现出诱导或抑制且存在剂量依赖性,低浓度组MDA含量表现为先抑制后诱导的过程,ACh E活性表现为先诱导后抑制;中浓度组MDA含量和ACh E均表现为抑制效应;高浓度组MDA含量表现为先诱导后抑制的过程,ACh E活性表现为先抑制后诱导。IBR分析结果表明4种生物标志物对HBCD胁迫的敏感性分别为SODGSTACh EMDA,且中、高浓度组的胁迫效应最明显。     

耐辐射奇球菌RecR和SSB蛋白的克隆表达及抗紫外功能

RecR和SSB蛋白是耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)同源重组修复RecFOR途径的关键蛋白.以耐辐射奇球菌基因组为模板,PCR扩增recR和ssb基因片段,以质粒pET32a(+)为载体,构建重组质粒pET32a(+)-recR和pET32a(+)-ssb,并转化到Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG诱导蛋白表达,表达产物采用SDS-PAGE鉴定,同时,应用平板菌落计数法检测紫外辐照前后各组细菌生存率变化,研究RecR和SSB蛋白在E.coli BL21(DE3)抗紫外线辐射中的作用.结果表明,RecR和SSB能够克隆至pET32a(+)载体并在E.coli BL21(DE3)中诱导表达.紫外辐照生存率实验结果提示,RecR和SSB蛋白能增强E.coli BL21(DE3)对紫外线辐射的抵抗能力.RecR和SSB的成功表达及紫外抗性特点将为耐辐射奇球菌超强耐辐射机制的研究提供实验基础.     

重组钝顶节旋藻藻蓝蛋白基因在聚球藻中的表达

藻蓝蛋白(Phycocyanin)具有抗氧化、消炎、抗癌、增强免疫等生理活性和荧光特性.本研究从钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)中克隆藻蓝蛋白基因,构建重组藻蓝蛋白并在聚球藻7942(Synechococcus sp.PCC 7942)中表达.利用PCR技术克隆钝顶节旋藻藻蓝蛋白α亚基(cpc A)与β亚基(cpc B)基因,在cpc A的5’端及3’端加入编码6×His标签基因,克隆Hiscpc A基因,并构建同源重组表达载体p U BCA3D-1.通过自然转化法将p UBCA3D-1转入聚球藻中,经筛选鉴定获得了转基因藻株.PCR验证结果表明,目的基因整合到聚球藻基因组中的概率为86.6%.转基因聚球藻在无抗生素筛选条件下连续培养2个月,仍能稳定表达重组Cpc A.以上结果表明,重组钝顶节旋藻藻蓝蛋白在聚球藻中稳定表达;研究结果为节旋藻cpc A基因改造、重组Cpc A进一步分离纯化以及重组藻蓝蛋白的生产奠定了基础.     

冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)过表达载体的构建及鉴定

为构建携带冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)的过表达载体,首先从4℃条件下冷处理8 h的SD大鼠睾丸组织中获得CIRP基因的c DNA序列,然后扩增CIRP基因的编码区,将其克隆到真核表达载体p Lenti6/V5中,酶切鉴定并测序.将克隆成功的质粒转染HEK293T细胞,用Western blot检测CIRP的表达水平.成功扩增CIRP编码区,并将其克隆至载体p Lenti6/V5中;当将CIRP过表达载体转染HEK293T细胞后,Western blot检测结果显示CIRP蛋白表达水平明显增加(P<0.01).本研究成功构建了CIRP过表达载体,为进一步研究CIRP的作用机制提供了基础工具.     

六种农药对乙酰胆碱酯酶活性的体外毒性效应

通过体外毒性试验,研究乙酰甲胺磷、巴丹、高效氯氰菊酯、甲基硫菌灵、异菌脲和哒螨灵6种农药对乙酰胆碱酯酶活性的毒性效应。结果表明,在体外反应体系中, 6种农药均对乙酰胆碱酯酶活性有明显的抑制作用,其中乙酰甲胺磷对乙酰胆碱酯酶活性抑制率随着浓度增高先下降后上升, 1mg·L-1时抑制率最低,为10. 07%;甲基硫菌灵对乙酰胆碱酯酶活性抑制率随着浓度增高先上升后下降, 0. 125mg·L-1时抑制率最高,达60. 32%;巴丹、高效氯氰菊酯、异菌脲、哒螨灵对乙酰胆碱酯酶活性抑制率随浓度增高而上升。     

腺苷酸环化酶抑制剂体外筛选模型的建立及应用

腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)通过调节环磷酸腺苷(cyclic adenosine cyclophosphate,cAMP)的合成从而调控细胞相关功能.在卵巢中,cAMP调控卵母细胞的发育及卵子的成熟,cAMP含量变化影响下游芳香化酶的表达,进而影响雌激素的生物合成.为开发靶向AC的候选药物,根据AC1、AC2两个活性区域,利用大肠杆菌系统克隆表达可溶ⅠC1-ⅡC2重组融合蛋白,使用ATP检测试剂盒,检测ⅠC1-ⅡC2的催化活性,从而建立有效的ⅠC1-ⅡC2蛋白体外筛选抑制剂模型.利用该模型筛选了由2 861个化合物组成的文库.化合物来那替尼(neratinib)可明显抑制ⅠC1-ⅡC2蛋白活性,且呈浓度依赖性,其IC50为10.2±0.152 2μmol/L.进一步研究发现,来那替尼可显著降低人卵巢颗粒细胞KGN细胞中芳香化酶的表达,并且抑制雌激素的生物合成.本研究通过建立蛋白体外筛选模型发现来那替尼具有抑制AC的活性,结果可为开发新的靶向芳香化酶治疗多囊卵巢综合征等疾病的候选药物提供参考.(图5表1参28)     

中药青蒿鲨烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定

利用PCR方法,将经RACE方法克隆到的中药青蒿鲨烯合酶cDNA(AF302464)开放阅读框的3′末端截短99bp,插入到原核表达载体pET30a( )的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间,构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的鲨烯合酶重组表达载体pETSSA.将pETSSA转入大肠杆菌BL21(DE3),0.5mmol/LIPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside)28℃诱导重组鲨烯合酶的表达.表达产物经镍琼脂糖柱纯化.纯化蛋白加入酶促反应体系(含FPP和NADPH),GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物,结果显示重组鲨烯合酶可以催化FPP向鲨烯的转化.青蒿鲨烯合酶的功能鉴定为进一步利用反义或RNAi技术限制甾类生物合成,从而提高青蒿中的青蒿素含量提供了基础.图5参15     

重组人白血病抑制因子的表达、包涵体复性、纯化及其活性

白血病抑制因子(LIF)是一种在生物体内具有独特活性和重要调节作用因而广泛应用的多功能细胞因子.利用基因工程技术表达重组人白血病抑制因子(Recombinant human leukemia inhibitory factor,rhLIF)并进行包涵体的复性及纯化,将rhLIF基因克隆到原核表达载体pET32a中,成功构建重组hLIF基因工程菌,并研究该菌株发酵条件和纯化工艺.先将种子液进行发酵培养,诱导表达,收集诱导后的细胞;对细胞破碎,收集包涵体沉淀,洗涤包涵体;用6 mol/L盐酸胍变性重溶包涵体,镍离子亲和层析柱上直接复性及纯化,并用阴离子交换进一步纯化,复性率为75%,纯度达97%.结果显示基因序列与理论序列一致,SDS-PAGE分析结果表明其表达的外源蛋白质分子量与预期的目的蛋白质相对分子量大小相一致,均为35×10~3;Western blotting、MTT活性检测结果表明,此重组hLIF融合蛋白具有良好的抗原性和免疫原性.本研究成功建立了rhLIF原核表达、复性和纯化体系,可为进一步研究LIF生物学活性及产品开发提供试验基础.     

有机氯类农药在残留剂量下联合诱导乳腺癌MCF-7细胞增殖的机制研究

有机氯类农药为已确定的环境雌激素,易在体内蓄积产生慢性毒性危害人体健康。选择单一存在时无明显雌激素效应的残留剂量进行联合试验,观察联合作用后雌激素效应的增减。选取乳腺癌MCF-7细胞作为研究对象,对残留剂量下六氯苯(HCB)、β-六六六(β-BHC)和p,p’-滴滴涕(p,p’-DDT)联合后的雌激素效应机制进行了研究。首先,运用MTT法观察3种有机氯类农药残留剂量下单独和联合作用对MCF-7细胞生长的影响;然后,运用流式细胞仪测定有机氯类农药联合对MCF-7细胞周期的影响;之后,采用Western Blot法测定有机氯类农药联合后ERα、ERβ、ERK1/2、p-ERK1/2、Ki67、c-Myc和Cyclin D1蛋白表达的变化。结果显示,β-BHC+p,p’-DDT组、HCB+β-BHC+p,p’-DDT组作用24 h后细胞增殖率为115.0%、120.1%,作用48 h后增殖率为121.2%、126.3%,其他联合组与对照相比未发生明显变化;β-BHC+p,p’-DDT组、HCB+β-BHC+p,p’-DDT组中MCF-7细胞的G1期细胞比例下降,S期细胞比例上升,细胞呈高增殖状态;β-BHC+p,p’-DDT组、HCB+β-BHC+p,p’-DDT组和雌二醇(E2)组作用48 h后,均降低ERα的蛋白表达,升高ERβ的蛋白表达,促进p-ERK1/2、Ki67、Cyclin D1和c-Myc的蛋白表达。研究表明,在单一作用时不具有雌激素效应的残留剂量下,仅β-BHC+p,p’-DDT联合组和HCB+β-BHC+p,p’-DDT联合组具有明显雌激素效应,其效应机制为经雌激素受体途径,激活ERβ蛋白表达,抑制ERα蛋白表达,促进p-ERK1/2、Ki67、c-Myc和Cyclin D1等相关蛋白的表达。