Quantitative Detection of Virulence Genes eaeA and rfbE of Pathogenic Escherichia coli in Municipal Wastewater by Real-Time PCR

针对病原性大肠埃希氏菌EHEC和EPEC的毒力基因eaeA和rfbE,选用特异性引物,建立了实时荧光定量PCR检测方法.利用从污水中分离出的目的核酸片段构建重组质粒,通过测序和BLAST比对分析,确定了PCR扩增的特异性.将重组质粒作为模板,分别测定标准曲线,在eaeA基因模板量8.77～8.77×105 copy,rfbE基因模板量4.98 ～4.98×105copy的范围内,Ct(循环阈值)与模板量的对数值具有良好的线性关系[ R2为0.997( eaeA)和1.000(rfbE)].结合膜吸附洗脱浓缩方法,对于实际水样,eaeA和rfbE基因的检测限分别为1.75×102和9.96×101copy/100 mL.利用该方法对城市污水处理厂进、出水进行检测的结果显示,污水二级处理工艺对这2种毒力基因的去除效果明显.     

聚磷激酶基因在假单胞菌中的整合和表达

为了构建高效除磷的微生物,将来源于大肠杆菌的聚磷激酶基因(ppk)插入广宿主载体pBBR1MCS-2多克隆位点区,得到质粒pBBR1MCS-2-ppk.以该质粒为模板,通过PCR扩增出携带有载体启动子和终止子序列的ppk基因,插入自杀型质粒pUTmini-Tn5中得到重组质粒pUTmini-Tn5-ppk.pUTmini-Tn5-ppk经三亲接合作用进入Pseudomonas putidaKT2440,同时mini-Tn5通过转座作用将ppk整合到宿主菌株的染色体DNA中,获得基因工程菌Pseudomonas putidaKT2440-PPK,用于表达ppk.RT-PCR结果显示,ppk基因在KT2440-PPK中得到较高量的表达,而在原始菌株KT2440中表达微弱.人工模拟污水实验结果表明,接种1 h时KT2440-PPK中聚磷含量达到最大,为3.05 mg/g,约是对照菌株KT2440的15倍.测定模拟污水中磷酸盐的含量表明,KT2440-PPK可以去除该模拟污水中90%以上的磷酸盐.     

一般性问题

XSOZ 9903418用PCR技术检测生物硝化池污水中硝化细菌(Nitrobacteria)的研究/明镇寰…(浙江大学西溪校区生命科学学院)//浙江大学学报(理学版)/浙江大学一1999,26(2)一83一86 环信N一27 从生物硝化池污水水样中分离了硝化细菌DNA,以其为模板,针对其16SrRNA基因及23SrRNA基因而设计合成了两对引物并分别进行了PCR扩增,扩增产物的2%琼脂糖凝胶电泳结果显示,硝化细菌DNA模板得到了特异性扩增。参照分子量标准(Marker)的电泳结果,被扩增的DNA条带大小分别约为4oobp和73obp。实验结果表明PCR技术可用于污水中硝化细菌的快速检测。…     

制药废水受纳河流中四环素抗药基因及微生物群落结构变化研究

考察了含有土霉素制药废水的污水处理厂排放在冬季和夏季对受纳河流中四环素抗药基因及微生物群落结构的影响.利用PCR方法,对该河流中16种四环素抗药基因(TRGs)进行了检测,其中6种在排放口及下游被检出.通过Real-timePCR对其中的3种抗药基因(tet(L)、tet(W)和tet(X))及总细菌的16SrRNA基因进行定量分析(TRGs/16SrRNA基因),结果表明:tet(L)、tet(W)和tet(X)与16SrRNA基因的比值在排放口和下游(3.34×10-3～2.38×10-1)显著高于排放口上游(1.16×10-5～2.38×10-2),表明污水排放造成了抗药基因的增加.夏季河水中TRGs/16SrRNA基因明显低于冬季.利用PCR-DGGE对不同河流沉积物中微生物群落结构进行了研究,结果表明,污水的排放显著改变了河流中的微生物群落结构,一些代表性TRGs宿主细菌的条带在排放点和河流下游明显增加.     

水中轮状病毒实时定量PCR外标准品的构建

采用细胞培养和T-A克隆技术,在轮状病毒主要结构蛋白VP7基因序列上设计合成引物,经PCR扩增后将特异性产物连接入pGEM-T-easy载体中,经过酶切鉴定和测序分析获得轮状病毒cDNA标准品.利用常规PCR和实时定量PCR方法对所获得的cDNA标准品进行特异性、稳定性和重复性指标的检验.结果表明,利用此标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系(斜率为-3.353,R2=0.995);实时定量PCR熔解曲线分析表明,温度在81℃±0.5℃的PCR产物是轮状病毒VP7序列上的特异性产物,表明此标准品是轮状病毒特异性的;同时,所制备的标准品在实时定量PCR检测中具有较大的线性范围(9×100～9×1011 copies/μL,每个反应最低可以检测到9个拷贝数的轮状病毒cDNA,表明利用该标准品进行实时定量PCR分析时具有较高的检测灵敏性;此外,该标准品具有较高的稳定性和重复性(3次独立实验CV值在0.2%～0.9%之间),可长期稳定保存.构建的标准品可用作检测水环境中轮状病毒的实时荧光定量PCR的外标准品.     

工程菌及其固定化细胞对有机磷农药的降解

用抗性库蚊酯酶基因,引入原核表达载体pRL439,转化大肠杆菌HB101细胞,获得表达.通过酶切、Southern杂交鉴定重组质粒.研究了重组菌酯酶的活性,重组质粒pRL-B1表达的酯酶具有高酶活并能高效降解酯酶的特异性底物a-乙酸萘酯(a-NA)和β-乙酸萘酯(β-NA);经对重组菌进行细胞固定化后降解有机磷农药对硫磷(1605),反应时间短,降解效率高.     

铜陵市河流沉积物中硝化和反硝化微生物分布特征

矿区河流不仅受到矿业活动带来污染物的影响,还受到区域内生活污水及农田退水中氮、磷和有机物的污染.本研究以铜陵市河流表层沉积物为研究对象,采用荧光定量PCR技术分析季节和污染类型对沉积物样品中硝化(amo A)和反硝化(nir S和nir K)功能基因丰度的影响.结果表明,沉积物样品中氨氧化古菌(AOA)和细菌(AOB)基因丰度变化范围分别为1.74×105~1.45×108copies·g-1和1.39×105~3.39×107copies·g-1,AOA平均丰度是AOB的4.39倍;反硝化基因(nir S和nir K基因)丰度变化范围分别为1.69×107~8.55×109copies·g-1和4.45×106~1.51×108copies·g-1,nir S基因平均丰度为nir K基因的28.35倍.沉积物AOA丰度呈现春季和秋季较高,夏季和冬季较低的趋势,而AOB在春季和冬季沉积物中的丰度高于夏季和秋季;反硝化基因丰度则表现为春季(nir S)/秋季(nir K)夏季冬季秋季(nir S)/春季(nir K).矿区周围以重金属为主要污染物的河流沉积物中两种amo A和nir S基因的丰度高于毗邻农田区域主要受到氮、磷及有机物污染的河流,后者的nir K基因丰度更高.     

土壤环境中肠道致病菌的多重PCR检测研究初探

建立同时检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌等5种土壤常见肠道致病菌的多重PCR检测技术,为这些肠道致病菌感染的快速诊断提供实验依据.根据这些肠道病原菌的毒素基因、高度保守基因及特异性基因分别合成5对特异性引物,应用PCR扩增技术对目的菌株进行特异性检测.实验结果表明,5对寡核苷酸引物都具有较高的特异性和专一性,多重PCR检测限达到104cfu·g-1.多重PCR应用于土壤样品分析,极大的缩短了检测时间(仅需3～4h)、降低了检测成本,对控制病原菌的传播具有重要意义,可推广应用于环境监测、水源检测、食品卫生监督、商品检验检疫等领域.     

重组质粒DNA在热处理过程中的降解/变性规律研究

生物实验室产生的废弃重组基因片段的排放是造成.基因污染"的途径之一.热处理是目前生物实验室处置废弃重组基因片段、核酸等物质的主要手段.以pET-28b质粒为材料,采用定量PCR技术结合电泳和质粒转化等手段分析了重组基因片段在热处理过程中的降解与失活规律,以及不同离子强度对重组质粒热降解的影响.结果显示,100℃热处理过程中质粒 pET28b 的降解随时间变化较为明显,降解半衰期约为2.7min;处理30min后仍存在具有转化活性的质粒;实验结果表明,100℃热处理后的废弃重组基因片段排入自然生态系统后仍存在基因转移的可能性.     

环境水体中肠道病原细菌的定量PCR检测

采用通用引物,通过实时荧光定量PCR方法(QPCR),对西安市5处地表水体中肠道病原细菌的细胞密度进行4个月的连续检测,并将QPCR检测结果与滤膜法测得的大肠菌群CFU值进行比较分析.结果显示, QPCR法可信度为94%,最小检测值为每管未稀释DNA提取物含2.7个大肠杆菌细胞.5个水体(N=60)检测结果表明, QPCR检测结果是大肠菌群CPU的2.2～5倍.病原细菌的几何平均值范围, QPCR法在25～67 000 CCE/100 mL之间, MF法大肠菌群为3～45 000 CFU/100 mL之间.2种方法的离散和回归分析表明, QPCR检测结果与大肠菌群CFU显著正相关,秩相关系数为r=0.983.     

南海北部细菌丰度和细菌生产力分布及其与环境因子相关性

以2014年8月南海北部海水样品为研究对象,利用平板计数法和流式细胞仪计数法对南海北部表层和垂直海域可培养细菌和细菌总数分布状况进行研究,对细菌生产力进行测定,并结合环境因子进行相关性分析。结果表明:珠江口到南海北部海域,水平方向可培养细菌总数变化范围是3.70×102~1.42×103 CFU/mL,细菌总数变化范围是5.12×105~1.61×106 cells/mL,细菌生产力的变化范围是0.03~0.40 mg/m3/h;垂直方向上可培养细菌变化范围是1.08×103~9.00×103 CFU/mL,细菌生产力变化范围是0.01~0.08 mg/m3/h,其中表层海水中的细菌生产力明显高于底层。与环境因子相关性分析表明,水平方向上,影响南海北部表层海水细菌总数和细菌生产力的主要因素是温度、盐度、硝酸盐（NO₃-N）、硅酸盐（SiO₃-Si）、亚硝酸盐（NO₂-N）和磷酸盐（PO₄-P）（P < 0.05）;垂直方向上,影响南海北部可培养细菌总数的主要因素是NO₂-N（P < 0.05）,影响细菌生产力的主要影响因素是温度和盐度（P < 0.05）。可见,南海北部表层海水中细菌总数高于可培养细菌总数2~3个数量级,表明该海域表层海水存在大量不可培养细菌;细菌的生命活动在海水表层相较底层更为活跃。     

液液萃取-气相色谱法测定地表水中17种有机氯农药研究

建立了二氯甲烷液液萃取-气相色谱法同时测定地表水中17种有机氯农药的方法。标准曲线线性良好,17种化合物的相关系数R2均大于0.999。当取样量为200 mL时,方法检出限在0.015μg/L~0.062μg/L之间。以超纯水样品进行基质加标实验,重复测定6次的相对标准偏差为1.2%~6.2%,平均加标回收率为72.8%~93.5%。方法简单快捷,精密度良好,准确性高,适用于地表水中痕量有机氯农药的测定。     

工厂化养殖方斑东风螺消化道及养殖环境中细菌数量变动与理化因子的关系

为掌握秋冬季方斑东风螺养殖系统细菌数量变动情况及其与理化因子的关系,试验采用TCBS培养法分别检测方斑东风螺（Babylonia areolate）消化道及其养殖水体、底沙弧菌数量（Sediment Vibrio,SV）,用营养琼脂培养法检测螺消化道异养菌数量（Heterotrophic Bacteria of Alimentarytract,AHB）,用荧光显微镜法检测水体总细菌数量（Water Total Bacteria,WTB）,并对养殖理化因子（水温（T）、盐度（S）、pH、溶解氧（DO）、氨氮（AN）、亚硝酸盐氮（Nitrite））及底质营养盐（总氮（TN）、总磷（TP））进行监测。结果显示,消化道异养菌数量为4.3×104~5.9×106 CFU/g,弧菌（AlimentarytractVibrio,AV）为2.0×102~7.5×105 CFU/g;水体总细菌、水体弧菌（WaterVibrio,WV）数量分别为4.8×104~3.8×105 cells/mL、2.1×102~1.2×104 CFU/mL;底沙弧菌数量为6.0×104~1.9×106 CFU/g。消化道内异养菌及弧菌分别与亚硝酸盐氮呈极显著正相关（P < 0.01）,与pH、盐度均呈显著负相关（P < 0.05）;水体中总细菌数量与溶解氧呈显著负相关（P < 0.05）,弧菌与总磷呈显著负相关（P < 0.05）;底沙中弧菌数量与各理化因子无明显相关性。主成分分析（Principal component analysis,PCA）结果显示,东风螺消化道细菌、养殖水体总细菌及弧菌、底沙弧菌数量在秋季主要受温度、氨氮、亚硝酸盐氮的影响,而冬季受水体溶解氧的影响更多,在整个养殖期间,需加强对盐度及pH的监控。     

北运河沉积物中氨氧化微生物的群落特征

采用T-RFLP、RT-qPCR和克隆测序等分子生物学技术,以氨单加氧酶基因(amoA)为分子标记,研究了北运河表层沉积物中氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的群落多样性、丰度、系统发育及其与环境因子的响应关系.结果表明,沉积物中AOB的群落多样性和丰度均高于AOA,是北运河沉积物中氨氧化过程的主要功能微生物.沉积物中氨氧化微生物群落结构沿干流和支流存在明显的空间分异,而AOA的种类组成空间差异较小;沉积物的氨氮(NH4+)和硝态氮(NO3﹣+NO2﹣)是影响氨氧化微生物群落特征的主要因子,AOB对环境变化的敏感性更高;AOA和AOB的amoA基因拷贝数分别为1.32×105~1.91×106copies/g、5.39×105~8.3×106copies/g.闸坝下游沉积物的氨氧化微生物丰度最高.系统发育分析表明,amoA基因序列多属于土壤/沉积物分支,较多AOB的克隆序列与土壤亚硝化螺菌属(Nitrosospira)的类群相似性可达98%.受污水处理厂退水的影响,部分amoA基因序列与污水处理厂废水和活性污泥中发现的类群同源性高.污染物质来源、支流汇入和闸坝拦截对河流沉积物氨氧化微生物的群落特征影响显著.     

TiO2 nanotubes as solid-phase extraction adsorbent for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in environmental water samples

An analytical method based on TiO2 nanotubes solid-phase extraction (SPE) combined with gas chromatography (GC) was established for the analysis of seven polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): acenaphtylene, acenaphthene, anthracene, fluorene, phenanthrene, fluoranthene and pyrene. Factors a ecting the extraction e ciency including the eluent type and its volume, adsorbent amount, sample volume, sample pH and sample flow rate were optimized. The characteristic data of analytical performance were determined to investigate the sensitivity and precision of the method. Under the optimized extraction conditions, the method showed good linearity in the range of 0.01–0.8 g/mL, repeatability of the extraction (RSD were between 6.7% and 13.5%, n = 5) and satisfactory detection limits (0.017–0.059 ng/mL). The developed method was successfully applied to the analysis of surface water (tap, river and dam) samples. The recoveries of PAHs spiked in environmental water samples ranged from 90% to 100%. All the results indicated the potential application of titanate nanotubes as solid-phase extraction adsorbents to pre-treat water samples.     

免疫磁珠分离与实时定量PCR技术联合检测水中轮状病毒的研究

建立了一种免疫磁珠分离技术联合实时定量PCR快速定量检测水中轮状病毒的方法.通过制备能够分离水中轮状病毒的特异免疫磁珠,优化分离条件,建立了免疫磁珠分离前处理方法,并与逆转录、实时定量PCR结合,成功用于水中轮状病毒的检测.研究发现,在1 mL水样中加入10 μL轮状病毒免疫磁珠、0.25 μL Tween 20、孵育2 h可达到较好的分离效果;免疫磁珠可用于3%牛肉浸膏等常用病毒洗脱液中的轮状病毒的分离,表明该分离技术能与已有的病毒浓集方法良好地整合.免疫磁珠分离技术与实时定量PCR联合用于检测水中轮状病毒,全过程需时约5 h,检测限为1×10⁴　copies/mL(相当于3～4　PFU/mＬ),检测结果与细胞病变试验检测结果有良好的线性相关关系（R²=0.981 6）,表明其能较好地表征水样的病毒感染风险.对接种已知量的轮状病毒的污水处理厂二级出水、再生水、地表水、自来水等水样的实验表明,该法可用于各种水样中轮状病毒的检测.     

温榆河中硝化和反硝化基因的Real-time PCR定量

以温榆河为研究对象,采用real-time PCR研究了温榆河不同断面水样和沉积物样品中TB(总细菌)、硝化和反硝化(nosZ和narG)基因数量的变化. 水样中TB基因数量在丰水期为1.05×109~7.38×1011 copies/L,枯水期为1.06×109~2.69×1012 copies/L;氨氧化细菌(AOB)基因数量在丰水期和枯水期分别为nd(未检出)~4.11×108和nd~1.15×109 copies/L. nosZ和narG基因数量在丰水期分别为nd~2.37×108和3.61×108~1.13×1010 copies/L,枯水期分别为2.0×106~3.04×109和nd~1.39×1010copies/L. 枯水期沉积物样品中TB基因数量为1.35×109~7.32×1010 copies/g,nosZ基因数量为nd~1.06×107 copies/g,narG基因数量为1.99×107~1.02×108 copies/g. 枯水期TB基因数量略高于丰水期,枯水期水样中ρ(NH₄+-N)较高导致其AOB基因数量要远高于丰水期,nosZ和narG基因数量并没有明显的水期变化. 相关分析表明,沉积物样品中微生物基因数量与水样中微生物基因数量不相关,而是水质变化长期作用的结果. 冗余度分析表明,丰水期和枯水期水样中影响微生物基因数量的主要环境因子不同,丰水期微生物基因数量是温度、ρ(COD_Cr)、ρ(NH₄+-N)、ρ(NO₂--N)、ρ(NO₃--N)等共同作用的结果,而温度和ρ(COD_Cr)对枯水期微生物基因数量影响显著.      

静态顶空-气相色谱法测定水中二硫化碳

采用气相色谱法静态顶空进样,HP-1柱分离,FPD检测器检测,测定水中CS2,并对测定条件进行了探讨。实验表明,当取样量为10.0 mL,气液比为12.3,在40℃平衡25 min时,能获得满意的灵敏度,且稳定性很好。二硫化碳在0.63μg/L～502μg/L之间呈线性,相关系数为0.999 2,相对标准偏差为1.3%～5.7%、加标回收率为88%～105%,检出限可达0.3μg/L。干扰试验表明硫化氢、甲硫醇、甲硫醚不干扰二硫化碳的测定。本方法操作简便,测定快速,完全能够满足快速分析水中二硫化碳的要求。