渗透压调控启动子表达木糖醇脱氢酶基因XYL2对重组酿酒酵母木糖代谢的影响

渗透压调控启动子在高底物浓度或盐类物质诱导下可实现目标基因的高表达和可控表达,因此可用于构建新的代谢工程菌株.利用来源于可耐高渗的产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)的渗透压调控启动子PCgSTL3、PCgZWF和PCgGPD,在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中控制木糖醇脱氢酶基因XYL2的表达水平,并研究其在NaCl诱导下对木糖醇脱氢酶活性及重组酿酒酵母木糖代谢流的影响.结果显示,以组成型强启动子PTPI为对照,添加0.4 mol/L NaCl作为渗透压诱导剂后,渗透压调控启动子控制下的木糖醇脱氢酶活性均得到增强,其中在PCgGPD控制下其活性变化最为明显,酶活提高了2.8倍.同时,以PCgGPD控制XYL2基因表达的重组菌木糖消耗量、乙醇产量和产率均为最高,与无诱导剂相比分别提高了62.3%、30.7%和9.7%,副产物木糖醇产率最低,下降了53.3%.本研究表明,渗透压调控启动子PCgGPD可显著提高木糖醇脱氢酶活性,通过添加NaCl作为渗透压诱导剂可实现对XYL2基因的可控表达,显著降低木糖醇积累,提高乙醇产率.     

根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化

通过构建质粒pCAM3300-zeocin,将其电击转化到根癌农杆菌LBA4404中.将含有目的质粒pCAM3300-zeocin的根癌农杆菌和工业化产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5共培养,利用zeocin抗性基因为筛选标记,实现了pCAM3300-zeocin对产甘油假丝酵母的转化.并根据产甘油假丝酵母的生长特性,对转化条件进行了优化,在共培养时间为24h,产甘油假丝酵母和根癌农杆菌的细胞比例为1∶(500～1000)时最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞.初步建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的转化方法.     

粘红酵母△12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

Δ12-脂肪酸脱氢酶一般特异性催化在油酸的Δ12位引入双键转变成亚油酸.为了从粘红酵母YM25079中克隆全长Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列,参考已知的Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列设计基因特异性引物,通过PCR扩增获得到全长为1 353 bp的c DNA序列,序列分析结果表明该序列具有一个编码450个氨基酸的完整开放阅读框,所编码蛋白质的大小为50.9×103.与报道的Δ12-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区,表明该序列为一个新的编码Δ12-脂肪酸脱氢酶的基因.为了验证其功能,把开放阅读框序列亚克隆到表达载体p YES3/CT,构建重组表达载体p YRGD12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达.脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,该序列所编码的蛋白质具有Δ12-脂肪酸脱氢酶活性,能将油酸转化为亚油酸,亚油酸的含量占酵母总脂肪酸的4.31%.以上结果表明,PCR所获得序列是新的Δ12-脂肪酸脱氢酶基因.     

产甘油假丝酵母抗逆转录因子的过表达对酿酒酵母耐酸胁迫性的影响

以具有优良环境耐受性的产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)为研究对象,考察其抗逆转录因子对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酸胁迫耐受性的影响.分别克隆获得C.glycerinogenes和S.cerevisiae的转录因子基因haa1和asg1,在S.cerevisiae W303-1A中分别过表达这4个基因,继而进行摇瓶试验考察重组菌株的酸耐受性.结果显示,过表达不同转录因子均能提高细胞酸耐受性,其中90 mmol/L乙酸时重组菌S.cerevisiae/Cghaa1和S.cerevisiae/Cgasg1的生物量与S.cerevisiae/Schaa1和S.cerevisiae/Scasg1相比分别提高了44.3%和18.9%.q RT-PCR发现,与Schaa1和Scasg1相比,过表达Cghaa1和Cgasg1能够显著上调下游酸耐受相关基因的表达水平.酸胁迫下乙醇发酵结果显示,相比对照组,重组菌S.cerevisiae/Cgasg1的乙醇产量提高11.1%.上述结果表明转录因子HAA1和ASG1均能提高酿酒酵母酸耐受性和酸胁迫下乙醇产量,其中Cghaa1和Cgasg1效果更为明显,结果可为提高酿酒酵母酸耐受性提供新的基因资源和思路,为进一步挖掘C.glycerinogenes抗逆基因提供借鉴.     

海洋破囊壶菌△~5-延长酶和△~4-脱饱和酶在酿酒酵母中的共表达

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA C22:6n-3)是具有各种重要生理功能的高度不饱和脂肪酸.分别以质粒pYTFD5和pYFAD4为模板,扩增获得860 bp的△5-延长酶基因(elo5)和1 600 bp的△4-脱饱和酶基因(fad4).利用重叠延伸PCR构建elo5-fad4融合基因,Hind Ⅲ/Sph Ⅰ双酶切后连接到经同样处理过的pYES2.0载体,构建重组表达质粒pYEL05-FAD4.转化酿酒酵母尿嘧啶缺陷型菌株INVScl,通过缺少尿嘧啶的选择性培养基筛选阳性克隆子.添加外源脂肪酸C20:5底物.半乳糖诱导表达.气相色谱-质谱分析表明,重组酵母总脂肪酸中出现了DHA(二十二碳六烯酸,C22:6n-63)新产物,融合基因elo5-fad4在酿酒酵母中得到了表达.图7表1参18     

产甘油假丝酵母甘油分解代谢CgGCY1、CgGCY2和CgDAK基因的克隆、敲除及其功能

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)能够利用甘油大量生长菌体而无有机酸、醇等代谢物积累,是潜在的优良宿主细胞.为了解C.glycerinogenes甘油分解代谢途径,成功克隆得到二羟基丙酮(DHA)途径的编码基因Cg GCY1、Cg GCY2和Cg DAK.利用"Ura-Blaster"敲除盒分别构建的缺失突变菌Cggcy1?/gcy2?和Cgdak?均不能在甘油培养基中生长.q RT-PCR及酶活测定结果显示,与葡萄糖培养相比,甘油培养下细胞通过强化糖异生、HMP途径积累生物量,下调EMP途径和副产物合成关键酶表达以弱化有机酸、醇的合成,同时上调TCA循环以补偿EMP途径下调带来的能量和还原力不足,使得生物量提高24.5%而不积累有机酸、醇等代谢物.以甘油为共底物进行木糖发酵,木糖醇产量和转化率达到39.4 g/L和89%,与葡萄糖为共底物相比分别提高了79%和32.8%.本研究表明C.glycerinogenes甘油分解代谢仅依赖于DHA途径,以甘油为共底物更有利于木糖醇的合成和转化;结果可为代谢改造C.glycerinogenes以甘油为共底物合成高附加值化合物打下基础.     

促进氰钴胺素转化为腺苷钴胺素的基因表达与鉴定

辅酶B12作为甘油脱水酶(GDHt)的辅酶参与到Klebsiella pneumoniae代谢甘油生成1,3-丙二醇(1,3-PD)和3-羟基丙酸(3-HP)的途径中.前期研究表明底物甘油可以导致辅酶B12分子中Co—C键的断裂,进而引起GDHt的失活.为进一步研究非活性的维生素B12(CNCbI)转化为具有活性的辅酶B12(AdoCbI)的过程,从K.pneumoniae中克隆得到了ATP:钴(I)胺素腺苷转移酶(ACA)基因btuR和还原酶基因yciK,并成功构建了双启动子表达质粒pUC18-tac-btuR-tac-yciK,将表达质粒转化Escherichia coli JM109获得了一株重组菌.利用改进的分析方法,结果表明:1)重组蛋白具有腺苷转移酶的活性;2)重组菌可以很好地将非活性的钴胺素,如维生素B12,转化生成具有活性的辅酶B12.     

乳酸片球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

与其它微生物相比,用大肠杆菌进行发酵生产乳酸有许多优势,但大肠杆菌没有L乳酸脱氢酶基因,不能利用糖发酵生产L乳酸.本文采用PCR技术,以乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)基因组DNA为模板,克隆得到L乳酸脱氢酶(Llactatedehydrogenase)基因,将该基因的ORF连接到表达质粒pET22b( ),获得重组质粒pETldhL.将pETldhL质粒转化大肠杆菌BL21株,实现了ldhL基因的表达;对含有ldhL基因的重组菌株进行表达研究,在30℃以IPTG诱导8h后,SDSPAGE分析可见明显特异性条带,酶活力达到6.49u/mL,是野生菌酶活力(2.82u/mL)的2.3倍.对重组表达的L乳酸脱氢酶生物学特性研究显示,它们的最适反应温度为27～30℃,最适反应pH为5.0～5.3.图5参15     

一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1是课题组前期通过基因工程改造得到的一株核黄素高产菌,为了进一步提高核黄素的产量,需要对该菌株进行进一步的基因工程改造.本研究首先将编码的链丝菌素乙酰基转移酶基因sat克隆到p MA5质粒上,构建具有诺瓦丝菌素Norseothricin(NTC)抗性的重组质粒p MA5-sat,实验证实该重组质粒能够用于B.subtilis RF1的抗性筛选.随后将核黄素合成相关的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf克隆到重组质粒p MA5-sat上,获得重组质粒p MA5-sat-zwf,并成功构建重组菌B.subtilis RF1/p MA5-sat-zwf.结果显示,重组菌胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力比原始菌提高了近50倍,说明葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在重组菌中成功过量表达;根据发酵特性分析,重组菌B.subtilis RF1/p MA5-sat-zwf最终核黄素产量达到12.01 g/L,比原始菌B.subtilis RF1提高了30.3%.综上,本研究构建的新型抗性质粒能够成功运用于核黄素生产菌枯草芽孢杆菌的基因工程改造.     

利用纤维二糖的酵母工程菌构建

以扣囊复膜孢酵母染色体DNA为模板,通过PCR方法扩增到其β-葡萄糖苷酶基因bgl1,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切并和经相同酶切的穿梭表达载体pYX212连接,构建了重组质粒pYX-sbgl,转化酿酒酵母W 303-1A,bgl1基因获得了活性表达,β-葡萄糖苷酶活力为0.504 IU/mL.转化子能以纤维二糖为唯一碳源生长,并能应用于同时糖化和发酵纤维素底物生产乙醇,使乙醇产量较宿主酵母有了一定的提高.图6表1参14