锌对镉在河南华溪蟹鳃组织亚细胞中富集的影响

为了研究锌对镉在河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)鳃中富集的影响,本文选择不同浓度镉锌联合处理14 d和28 d后,采用亚细胞分离法将鳃组织分为热稳定蛋白(HSP)、富含金属颗粒(MRG)、生物活性部分(BAM)和细胞碎片部分(CD),其中,热稳定蛋白(HSP)和富含金属颗粒(MRG)组成生物解毒部分(BDM),利用火焰原子吸收分光光度法(AAS)测定各个亚细胞组分中镉的含量.结果显示,BDM是镉富集的重要场所,镉在其中所占比例达到50%.其中,BDM包括热稳定蛋白(HSP)和富含金属颗粒组分(MRG).随着镉处理浓度的增加,锌对镉在HSP和MRG中的蓄积表现为先促后抑的作用.在BAM中,加锌促进镉的蓄积,且相较于高浓度锌(1000μg·L-1),低浓度锌(100μg·L-1)的促进作用更为显著.研究表明,锌对镉在河南华溪蟹鳃中的富集及分布有一定影响.     

钙信号对镉诱导河南华溪蟹细胞凋亡的调控

以河南华溪蟹(Sinopptamon henanense)为研究材料,采用生理生化和酶学组织化学等方法,通过不同时间(12、24、48、72和96 h)不同镉浓度(0、14.5、29、58 mg·L-1)处理,首先研究了镉对肝胰腺细胞内钙调素(CaM)含量、钙ATP酶(Ca2+-ATPase)活性和细胞凋亡的影响;然后用Ca2+抑制剂EGTA和LaCl3预处理河南华溪蟹后再进行镉处理,以分析Ca2+信号对镉诱导肝胰腺细胞凋亡的影响.结果显示,镉处理引起肝胰腺细胞CaM含量和Ca2+-ATPase活性显著升高,并且Caspase-3和Caspase-9被激活.用Ca2+抑制剂EGTA和LaCl3预处理华溪蟹4 h后,再用镉处理48 h,镉诱导的肝胰腺细胞Caspase-3和Caspase-9活性上升都被阻断.结果表明:镉处理引起河南华溪蟹肝胰腺细胞Ca2+浓度发生变化,并通过CaM等信号分子调控Caspase-3/9活性,进而引发细胞凋亡.     

镉诱导华溪蟹不同组织金属硫蛋白表达及镉蓄积的研究

为了系统研究镉诱导华溪蟹不同组织(肝胰腺,腮)金属硫蛋白(MT)表达及镉蓄积状况,并探讨二者之间的关系,采用体外镉暴露法处理华溪蟹,用镉-血红蛋白饱和法和火焰原子吸收分光光度法(AAS)分别测定华溪蟹肝胰腺及腮中镉蓄积及MT表达含量.结果显示,暴露期间动物死亡率低于9.2%.体重未见显著变化.不同浓度镉暴露下.华溪蟹体内镉蓄积及金属硫蛋白表达具有明显组织差异,且呈现一定的时间-效应与剂量-效应关系.鳃中镉蓄积量高于肝胰腺且最高达到(15.41 ±3.21)μg·g-1;而肝胰腺中MT表达量高于鳃,最高达到(97.18±11.83)μg·g-1.通过鳃及肝胰腺中MT的镉结合率计算,显示肝胰腺中的镉可完全被MT结合,而鳃中镉蓄积量远远大于MT结合能力.     

急性与亚慢性镉胁迫对河南华溪蟹消化系统亚细胞结构的影响

本实验运用透射电镜技术,观察了河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)分别在镉29.0 mg·L-1急性染毒4 d和2.90 mg·L-1亚慢性染毒21 d后消化系统4种器官(食道、中肠、后肠和肝胰腺)亚显微结构的变化和损伤情况.结果显示:急性和亚慢性染毒均可导致各组织中细胞核变形、染色质浓缩边集、核固缩、核碎裂,线粒体空泡化、嵴缩短、融解甚至消失,但前者对各组织亚细胞的损伤更为严重;肝胰腺和中肠组织的病理变化较食道和后肠组织中的明显,镉胁迫后均可观察到上皮细胞内粗面内质网扩张变形、核糖体脱落,高尔基体形态结构异常,微绒毛排列紊乱、部分融解、断裂,出现大量的自噬溶酶体;食道和后肠的肌纤维水肿、肌原纤维排列疏松.急性与亚慢性镉处理均会对河南华溪蟹的消化系统产生毒害,造成各组织器官中细胞结构的严重损伤,且急性高浓度的镉暴露对机体造成的毒性影响较为严重.这些损伤会影响消化酶的合成和分泌等生理功能,导致机体失去正常的消化能力.     

镉对河南华溪蟹副性腺组织的氧化性损伤作用

为了探明慢性镉胁迫对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)副性腺的生殖毒性作用,实验设置了2个镉浓度组(0.725和1.45 mg·L-1)、1个对照组、3个处理时间(7、14和28 d),研究了镉在副性腺组织的积累,以及镉对副性腺组织细胞结构、抗氧化酶,如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性及脂质过氧化水平(MDA含量)、蛋白质羰基化(PCO含量)和DNA-蛋白质交联(DPC)的影响.结果显示,镉处理后在河南华溪蟹副性腺组织中的积累显著或极显著高于对照组,且随着时间的延长和镉浓度的增加,副性腺组织镉的积累逐渐增高;副性腺组织细胞结构发生了不同程度的改变,主要表现为上皮细胞与基膜分离甚至破裂导致细胞核丢失.镉浓度0.725和1.45 mg·L-1条件下处理28 d,基膜结构发生明显改变,上皮细胞和基膜之间出现较大空腔,上皮细胞细胞核变形.SOD和GPx活性先升后降,而CAT的活性则随着镉浓度的增加逐渐升高;PCO含量和DPC均随着时间的延长和浓度的增加而显著升高;MDA含量也呈明显的升高趋势,但在28 d有所下降.表明慢性镉胁迫对河南华溪蟹副性腺产生了明显的氧化损伤,可能会影响副性腺正常的生理功能.     

铅对河南华溪蟹卵巢抗氧化酶活力和脂质过氧化水平的影响

采用亚急性毒性实验方法,研究了铅(Pb2+)对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)卵巢组织抗氧化酶活性与脂质过氧化产物的影响.实验设置了5个Pb2+浓度组(3.675、7.35、14.70、29.40和58.80mg·L-1)和1个空白对照组,在3个染毒时间(5、10和15d)下对超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力和丙二醛(MDA)含量进行了测定.结果显示,在不同浓度和不同暴露时间下,铅对河南华溪蟹卵巢SOD、CAT、GPx活力及MDA含量均有明显的影响.SOD、CAT活力表现为低浓度诱导激活,高浓度抑制,即先升后降的变化规律,GPx活力在5d和10d时表现出先升后降的趋势,在15d时活力不断下降,且SOD在10d、14.70mg·L-1Pb2+浓度组,CAT在5d、7.35mg·L-1Pb2+浓度组,GPx在10d、3.675mg·L-1Pb2+浓度组分别升至峰值,而卵巢MDA含量随染毒时间的延长和染毒浓度的升高逐渐增多,且在15d、58.80mg·L-1Pb2+浓度组中较对照组差异极显著。结果表明,Pb2+暴露对河南华溪蟹卵巢产生了明显的氧化胁迫作用,且抗氧化酶和脂质过氧化物水平可以作为重金属对水生生物毒理学研究的生物标志物.     

香蒲吸收镉的途径及体内镉化学形态研究

香蒲(Typhaangustifolia L.)是一种重金属镉富集植物,通过水培实验,利用ATP酶抑制剂和离子通道抑制剂,探讨了香蒲根系吸收镉离子的途径,以及镉离子在香蒲根部的亚细胞分布特征和化学形态。研究结果显示:ATP酶抑制剂和非选择性阳离子通道抑制剂对香蒲吸收镉离子有显著的抑制作用(P细胞器>液泡,香蒲根细胞中镉形态以氯化钠提取态为主,香蒲根细胞可将大部分镉隔离在细胞壁中,香蒲的细胞壁是其体内累积镉的一个重要位点,香蒲根部细胞壁的区隔化作用是其对镉富集解毒的重要生理机制之一。     

镉对河南华溪蟹肝胰腺线粒体的影响

运用透射电镜技术、电镜细胞化学技术、酶组织化学技术和JC-1荧光染色,观察不同浓度镉对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)肝胰腺线粒体的损伤.实验设对照组和5个染毒组:3.56、7 12、14.25、28.49和56.98 mg·L-1,处理时间为72 h.透射电镜观察显示,在低浓度组,线粒体轻度肿胀,部分线粒体外膜破裂,随染毒浓度的增加,线粒体水肿增加,嵴缩短甚至消失,直至线粒体破裂.酶组织化学检测显示,琥珀酸脱氢酶(succinic dehydrogenase,SDH)主要在细胞浆中表达,呈蓝紫色颗粒.SDH活性在3.56、7.12和14.25 mg·L-1浓度组中比对照组显著增加(p＜0.05),而在28.49和56.98 mg·L-1浓度组中没有明显变化.SDH的亚细胞定位结果与酶组织化学检测的结果一致.JC-1荧光强度在3.56、7.12和14.25 mg·L-1浓度组比对照组显著增加(p＜0.05).线粒体膜电位与SDH的活性有正相关性(r=0.736,p＜0.05).结果显示,镉引起线粒体结构损伤、功能障碍,并与镉浓度具有剂量-效应关系.线粒体是镉细胞毒性的重要靶位.     

BaP和Cd单一复合对BaP蚯蚓亚细胞分配的影响

选用钙离子通道阻断剂氯化镧（LaCl₃）和巯基蛋白阻断剂N-乙马来酰亚胺（NEM）对赤子爱胜蚓进行预暴露,然后构建BaP单一或Cd-BaP复合污染,研究不同阻断剂对BaP在蚯蚓不同亚细胞组分（Fraction C：细胞溶质组分;Fraction D：固体颗粒组分;Fraction E：细胞碎片组分）中分配积累特征的影响.结果表明,无论单一或复合污染,BaP主要分布于细胞碎片组分中（占55.42%~69.96%）,其次为固体颗粒组分（占27.91%~32.90%）,在细胞溶质组分中的浓度最低（占2.13%~11.67%）.单一BaP污染下,两种阻断剂对BaP的作用相近,即LaCl₃和NEM的加入均能不同程度地促进3个亚细胞组分中BaP的积累.而在Cd和BaP复合污染下,两种阻断剂对BaP的分布积累的影响略有不同,LaCl₃能够促进复合污染下BaP在3个亚细胞组分中的积累,而NEM促进了复合污染下BaP在固体颗粒组分和细胞碎片组分中的积累,但抑制了BaP在细胞溶质组分中的积累,浓度从原来的0.99mg/kg降低至0.59mg/kg.因此,钙离子通道和巯基蛋白可能参与BaP在蚯蚓亚细胞的分配积累,相比单一污染,Cd的复合污会进一步改变BaP的积累分配特征.     

砷超富集植物蜈蚣草中磷和钙的亚细胞分布及其与耐砷毒的关系

为了在研究砷超富集植物蜈蚣草中磷和钙的亚细胞分布,并探讨其与蜈蚣草耐砷毒的关系进行了试验研究.结果表明,蜈蚣草吸收的磷主要分布在胞质组分中(平均占各部位总磷含量的44%以上),吸收的钙主要分布在细胞壁组分中(平均占各部位总钙含量的48%以上).与低钙(0.03和2.5 mmol·L-1)处理相比,高钙(5.0 mmol·L-1)处理时,根部的胞质组分和叶柄的细胞器组分中磷含量较高.各器官的亚细胞组分中钙含量随着介质中添加钙浓度的提高而增加.介质钙浓度过高会抑制蜈蚣草的生长.在加砷处理下,根部和叶柄细胞壁组分的磷含量有所减少,但地上部细胞器组分的磷含量及其含磷总量占植株含磷总量的相对比例、根部细胞壁组分的钙含量增加.蜈蚣草自主调节磷和钙的亚细胞水平分布可能是其耐砷毒的机制之一.     

扑草净降解菌的分离、筛选与鉴定及降解特性初步研究

从安徽农药厂废水处理系统的活性污泥中筛选扑草净(prometryne)降解菌.通过富集驯化和选择性培养筛选纯化细菌,分离到2株细菌,分别命名为P-1、P-2.根据表型特征、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析:P-1为G-,鉴定为苍白杆菌属(Ochrobactrum);P-2为G+,鉴定为芽胞杆菌属(Bacillus).GenBank登录号分别为HM004554和HM004555.通过12 d液体降解实验,菌株P-1、P-2对40 mg.L-1扑草净降解率分别达到46.5%和65.4%.该研究为扑草净的生物降解与污染土壤的生物修复提供了依据.     

凤眼莲化感物质对铜绿微囊藻、斜生栅藻生长及细胞数相对比例的影响

为探索化感物质在蓝藻水华治理方面的应用潜力,选取在凤眼莲根系分泌物中发现的5种化感物质（亚油酸、亚油酸甘油酯、丙酰胺、N-苯基—2-萘胺和壬酸）,研究了3种剂量下（0.1、1.0、10.0mg.L-1）其对单一、混合培养铜绿微囊藻和斜生栅藻生长的影响.结果发现,化感物质成分、剂量和藻类培养方式对铜绿微囊藻和斜生栅藻生长...     

双酚A对大豆、玉米和水稻叶绿素荧光反应的影响

双酚A(BPA)普遍应用在工业制成品中,因需求量递增而产生的环境安全问题引发各方关注.与BPA对植物生长影响的研究工作相比,BPA影响植物生长的机理的研究甚少.光合作用是植物生产的重要生理过程,可通过叶绿素荧光测定技术探测和分析.基于此,本文利用叶绿素荧光测定技术,研究了BPA对大豆、玉米和水稻幼苗叶绿素荧光反应的影响.结果表明,3.0 mg·L-1BPA可降低大豆和玉米初始荧光F0,增加原初光能转化效率F v/F m、实际光能转化效率ΦPSⅡ、电子传递速率ETR、光化学猝灭系数qP和非光化学猝灭系数qN,对水稻各荧光参数无影响,即3.0 mg·L-1BPA可改善大豆和玉米光合PSⅡ系统,增强光能吸收,提高光合电子传递和光能转化效率;6.0 mg·L-1BPA可增加大豆和水稻的ΦPSⅡ、ETR和qP,降低F0,除增加qN外不影响玉米的其它荧光参数,表明6.0 mg·L-1BPA能改善大豆和水稻光合PSⅡ系统,提高光能转化和电子传递效率;除10 mg·L-1BPA对水稻各荧光参数无显著影响及17.2 mg·L-1BPA增加玉米和水稻的qN外,10 mg·L-1和17.2mg·L-1BPA可增加3种作物F0,抑制其它各荧光参数,即高剂量BPA引起作物光抑制,PSⅡ中心受损,光能转化和电子传递效率降低.此外,对比3种作物荧光参数变幅可知,BPA对大豆各荧光参数的影响玉米水稻.总之,BPA对3种作物叶绿素荧光反应的影响在方式和效果上存在差异.     

Uptake of radioiodide by Paenibacillus sp., Pseudomonas sp., Burkholderia sp. and Rhodococcus sp. isolated from a boreal nutrient-poor bog

Radionuclides, like radioiodine(~(129)I), may escape deep geological nuclear waste repositories and migrate to the surface ecosystems. In surface ecosystems, microorganisms can affect their movement. Iodide uptake of six bacterial strains belonging to the genera Paenibacillus,Pseudomonas, Burkholderia and Rhodococcus isolated from an acidic boreal nutrient-poor bog was tested. The tests were run in four different growth media at three temperatures. All bacterial strains removed iodide from the solution with the highest efficiency shown by one of the Paenibacillus strains with 99% of iodide removed from the solution in one of the used growth media. Pseudomonas, Rhodococcus and one of the two Paenibacillus strains showed highest iodide uptake in 1% yeast extract with maximum values for the distribution coefficient(K_d) ranging from 90 to 270 L/kg DW. The Burkholderia strain showed highest uptake in 1% Tryptone(maximum K_d170 L/kg DW). The Paenibacillus strain V0-1-LW showed exceptionally high uptake in 0.5% peptone + 0.25% yeast extract broth(maximum K_d 1,000,000 L/kg DW). Addition of 0.1% glucose to the 0.5% peptone + 0.25% yeast extract broth reduced iodide uptake at 4℃ and 20℃ and enhanced iodide uptake at 37℃ compared to the uptake without glucose. This indicates that the uptake of glucose and iodide may be competing processes in these bacteria. We estimated that in in situ conditions of the bog,the bacterial uptake of iodide accounts for approximately 0.1%–0.3% of the total sorption of iodide in the surface, subsurface peat, gyttja and clay layers.     

海洋细菌Marinobacter adhaerens HY-3分离鉴定及对中肋骨条藻的化感作用

菌藻化感作用是一种极其复杂的生理、生态学现象.从虾蟹混养池分离得到1株海洋细菌,经16S rRNA序列比对确定为Marinobacter adhaerens HY-3,选择我国常见赤潮优势种中肋骨条藻(Skeletonema costatum)作为对象,研究海洋细菌与其种间化感效应,利用共培养和添加细菌胞外代谢物,以S.costatum生长量及叶绿素a含量为参数,研究细菌对S.costatum生长及光合作用的影响.结果表明,菌液浓度104以上对S.costatum生长产生抑制,培养至第10 d,104、106、108组藻生长量分别是对照组的70%、23%、22%;叶绿素合成量是对照组88%、62%、60%;抑制效应随菌浓度的增加有逐渐增加的趋势.添加细菌胞外代谢物,对S.costatum生长无影响;因此,M.adhaerens HY-3对S.costatum存在一定的化感作用,对其生长及光合作用均产生较大的影响;S.costatum与M.adhaerens HY-3的种间相互作用,是由菌藻细胞的直接接触进行,代谢物不存在化感作用因子.     

三种大型海藻对对氯苯胺的去除行为及光合生理响应

以龙须菜、坛紫菜和石莼3种大型海藻为实验材料,通过模拟实验,研究并比较了它们对不同浓度对氯苯胺(PCA)的去除行为,以及石莼对PCA的光合生理响应.实验结果显示,7d实验结束时,3种藻类对海水中PCA的最终去除率排序分别为:6mg·L-1PCA处理组,龙须菜(58.7%)<坛紫菜(75.7%)<石莼(94.9%);60mg·L-1PCA处理组,龙须菜(50.2%)<石莼(61.3%)<坛紫菜(74.9%);海藻的培植密度越大,PCA的去除率越高,在受PCA污染的海域中大面积种植大型海藻来有效地处理修复此类污染在理论上是可行的.在不同浓度PCA处理过程中,石莼的生长受到抑制,有效光化学效率、光合作用和呼吸作用呈现出低浓度(<5mg·L-1)促进、高浓度(>10mg·L-1)抑制的现象.叶绿素、类胡萝卜素和可溶性蛋白含量在各处理组之间没有表现出确定趋势,表明PCA对石莼生长的影响可能是由于呼吸速率的增加而引起的.     

底泥对洋河水库微囊藻和鱼腥藻生长影响的研究

采用批量培养的方法研究洋河水库底泥浸出液对洋河水库微囊藻和鱼腥藻生长的影响.结果表明,厌氧条件底泥浸出液对鱼腥藻生长速率有促进作用,添加2%、20%、50%的厌氧底泥浸出液的鱼腥藻生长速率比M11培养基中分别高出36.6%、47.2%、36.0%;而添加厌氧底泥浸出液对微囊藻生长有抑制作用,微囊藻最大生物量随底泥浸出液的添加量增加而减小.与添加厌氧底泥浸出液相比,添加好氧条件的底泥浸出液对鱼腥藻生长速率也有一定的促进作用,添加20%的好氧底泥浸出液的鱼腥藻生长速率比M11培养基中高出37.2%;而添加好氧底泥浸出液对微囊藻生长影响不明显.在添加厌氧底泥浸出液的培养基中增加铁,则微囊藻的最大生物量显著增加,表明底泥浸出液对微囊藻生长的影响可能是较高浓度的有机质与铁的结合影响了微囊藻对铁的利用.     

荔枝落叶对铜绿微囊藻生长和光合作用的影响

利用浮游植物荧光分类仪对暴露于不同浓度荔枝落叶浸出液下铜绿微囊藻的生长、最大光合作用效率(Fv/Fm)、实际光合作用效率(YⅡ)、光能利用效率(α)、最大相对电子传递速率(r ETRmax)和光饱和系数(Ik)进行了为期15 d的检测,研究浸出液对铜绿微囊藻生长和光合作用的影响.结果发现,浸泡5 d的荔枝落叶浸出液可以抑制藻的生长,呈明显的浓度抑制型变化,随着时间的延长,抑制作用下滑.荧光参数Fv/Fm、YⅡ和α与浸出液浓度由负相关转为正相关或保持正相关关系,浸出液可能早期对藻光合作用发生胁迫,或通过提高光能利用效率来度过胁迫环境,r ETRmax、Ik和叶绿素a浓度与浸出液浓度由负相关转为显著负相关关系.三维荧光图谱结果表明,第15 d时,在投量为2.0 g·L-1时,色氨酸及酪氨酸荧光峰强度约为1.2g·L-1投量情况下的1/3,同时腐殖酸的荧光峰强度减弱.进一步研究藻细胞生长的半抑制浓度EC50值表明,与传统的农作物秸秆控藻比较,其EC50值较低,可能荔枝落叶化感控藻效果较强,只需较低的浸出液浓度而能达到较好的控藻效果.     

带菌盐藻对不同形态砷的富集和转化研究

自然环境中藻和菌多是共生的,藻菌共生体对污染环境修复具有较好的应用前景.本研究通过16S rRNA序列分析方法从带菌盐藻中分离鉴定出1株芽胞杆菌(Bacillus solisalsi),并测定了不同浓度的亚砷酸盐[As(Ⅲ)]和砷酸盐[(As(Ⅴ)]胁迫13 d后,带菌盐藻对砷的吸收、吸附、转化情况以及培养液中的砷含量及其形态.结果表明,无菌盐藻对砷的耐性较强,在250μmol·L-1和500μmol·L-1As(Ⅲ)胁迫下,砷含量分别为3.78 g·kg-1和4.56 g·kg-1,但是培养液中的砷含量仅下降7.9%~8.3%,Bacillus solisalsi单独除砷的能力也不强(去除率为6.1%~19.9%).盐藻及其共生菌协同除砷的能力较强,25~100μmol·L-1As(Ⅲ)处理下能吸收0.99~2.79 g·kg-1的砷,25~500μmol·L-1As(Ⅴ)处理下能吸收1.22~3.46 g·kg-1的砷.25~100μmol·L-1As(Ⅲ)和As(Ⅴ)胁迫下砷去除率均在54.3%以上.带菌盐藻可以通过As(Ⅲ)氧化、As(Ⅴ)还原、As(Ⅲ)甲基化和排出胞外等途径降低砷的毒害.     

Bioreduction of vanadium (V) in groundwater by autohydrogentrophic bacteria: Mechanisms and microorganisms

As one of the transition metals, vanadium (V) (V(V)) in trace amounts represents an essential element for normal cell growth, but becomes toxic when its concentration is above 1 mg/L. V(V) can alter cellular differentiation, gene expression, and other biochemical and metabolic phenomena. A feasible method to detoxify V(V) is to reduce it to V(IV), which precipitates and can be readily removed from the water. The bioreduction of V(V) in a contaminated groundwater was investigated using autohydrogentrophic bacteria and hydrogen gas as the electron donor. Compared with the previous organic donors, H₂ shows the advantages as an ideal electron donor, including nontoxicity and less production of excess biomass. V(V) was 95.5% removed by biochemical reduction when autohydrogentrophic bacteria and hydrogen were both present, and the reduced V(IV) precipitated, leading to total-V removal. Reduction kinetics could be described by a first-order model and were sensitive to pH and temperature, with the optimum ranges of pH 7.5–8.0 and 35–40°C, respectively. Phylogenetic analysis by clone library showed that the dominant species in the experiments with V(V) bioreduction belonged to the β-Proteobacteria. Previously known V(V)-reducing species were absent, suggesting that V(V) reduction was carried out by novel species. Their selective enrichment during V(V) bioreduction suggests that Rhodocyclus, a denitrifying bacterium, and Clostridium, a fermenter known to carry out metal reduction, were responsible for V(V) bioreduction.