龙眼miR159家族成员进化特性及时空表达

为了解植物miR159家族成员的进化特性及其在不同组织部位的表达规律,以龙眼miR159家族为例对miRNA家族进行探讨.通过龙眼miR159家族前体与成熟体序列比对、前体二级结构预测、系统发育进化树的构建、靶基因预测及实时荧光定量等手段,对龙眼miR159基因家族进行研究.结果显示:龙眼miR159家族存在7个前体成员和6个成熟体成员,序列比对发现5个成熟体可以高度定位于7个前体序列中一个共有的、约20个碱基的保守区域,推测miR159成熟体主要来源于该区域;进一步分析发现6个成熟体序列中仅2个可定位于pre-MIR159中.mfold预测结果显示miR159家族7个前体的最小折叠自由能在-56.54--92.53 kal/mol之间,均能自发形成典型、稳定的茎环二级结构.系统发育进化树显示龙眼miR159家族前体与成熟体成员均具有保守性与多样性.靶基因预测发现龙眼miR159家族所有成员共预测出14个不同靶标,其中3个成员也可以作用于同一靶标.实时荧光定量PCR显示,龙眼pre-MIR159家族成员间在不同组织部位表达量差异显著,但表达趋势却几乎一致,其中花器官中表达量最高,提示了dlo-miR159在生殖器官形成过程中具有重要的作用,尤其是在雄花中作用显著.本研究表明龙眼miR159家族在进化过程中形成了保守性与多样性并存的进化特性,并且可能在花器官形成过程中发挥了重要的作用.     

龙眼miR167家族分子特性及其潜在靶标在体胚发生早期的表达模式

为了解miR167家族成员的分子特性及其可能互作的靶标在龙眼体胚发生早期的调控机制,采用生物信息学分析方法进行龙眼miR167基因家族序列分析、二级结构预测、分子进化树分析、靶基因预测及其靶标特异表达的FPKM值分析,并采用实时荧光定量PCR技术(quantitave real-time PCR,qPCR)检测miR167家族在体胚发生早期的转录水平.结果显示,龙眼miR167前体序列存在一个长为20 nt的重叠区域,miR167b的中间序列区域和3’端与此区域存在多个碱基差异;龙眼miR167前体成员均能形成茎环结构,且最小折叠自由能介于-79.95--46.90 Kal/mol之间;分子进化树显示龙眼miR167前体成员分别与番木瓜(Carica papaya)、番茄(Solanum lycopersicum)、高粱(Sorghum bicolor)和大豆(Glycine max)亲缘关系最近,miR167a、c、d、f在成熟体进化树中聚于同一支,靶标预测结果显示它们可能调控6个相同的靶基因,即E3泛素连接酶BIG BROTHER(BB)、AIRP2,MYB转录因子和生长素应答因子(ARF6、ARF8、ARF6-3),miR167b则单独分布于另一支中,并可能调控2个特异靶标,即赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)和细胞周期素(cyclin-C1-2-like);qPCR结果显示dlo-miR167a、c、d的表达均呈上调趋势,dlo-miR167d、f在3个阶段的表达水平较低;FPKM值显示ARF6/8、BB在体胚发生早期的表达模式与dlo-miR167a、c、d趋于一致,与AIRP2呈负相关.本研究表明在体胚发生早期ARF6/8和BB可能不受龙眼miR167的靶向调控,miR167可能通过靶向AIRP2参与早期体胚发生的形态建成,提示龙眼miR167基因功能的协同性和独立性并存.(图9表3参54)     

eTM、microRNA319及其调控靶标在龙眼体胚发生早期的表达模式

MicroRNA319作为最保守的miRNA家族之一,在植物器官形态建成、激素信号转导、抵抗外界胁迫等途径中均有重要作用.为了解miR319在植物体胚中的调控途径,利用龙眼转录组数据库筛选miR319成熟体(miR319)和前体序列(pre-miR319),并通过DNAMAN 6.0和Mfold分析miR319的定位和pre-miR319的二级结构;进而采用TAPIR和psRNAtarget预测选定的miR319成员的内源诱捕靶标(endogenous target mimics,eTM)及候选靶标,并通过RLM-RACE验证靶标裂解位点,最后分析eTM、miR319及其靶标在龙眼体胚发生早期的表达模式.结果显示,龙眼4个miR319成员有1个定位于miR319a scafflod517,有3个定位于miR319a scaffold225.因此,以miR319a scaffold225为研究对象,将其命名为pre-miR319a,其上的成熟体分别命名为miR319a-3p.1、miR319a-5p.1和miR319a-5p.2.裂解位点显示龙眼miR319a 3个成员中,miR319a-3p.1的靶基因为TCP2和TCP4(Dlo_022819.1,Dlo_026743.1),miR319a-5p.1的靶基因为吲哚-3-甘油磷酸合成酶(IGS)和ABI3-5抑制因子,miR319a-5p.2未验证到靶基因.qPCR显示,在龙眼早期体胚发生过程中,miR319a 3个成员的表达模式基本一致,呈显著上调趋势.另外,除eTM8637外,其余eTM的表达模式与其相应的miR319a成员基本呈现为负相关趋势,均为下调趋势. miR319a-3p.1与其靶基因基本呈现为负调控趋势,miR319a-5p.1与ABI3-5抑制因子在龙眼早期体胚发生后期呈现负调控,与IGS没有明显负相关.本研究初步验证了"eTM-miR319a-靶基因"信号途径可能参与到龙眼早期体胚发生的形态建成.(图4表3参46)     

龙眼Hsf基因家族全基因组鉴定及体胚发生过程中的表达分析

基于龙眼基因组数据库对龙眼Hsf(DlHsf)基因家族进行全基因组鉴定,并对其基因结构、启动子作用元件和CpG岛分布情况、编码蛋白的理化性质和进化情况以及它们在不同体胚发生阶段和不同组织器官的表达情况进行研究,同时对靶定DlHsf的miRNA进行预测分析.结果表明:DlHsf基因家族共20个成员,基因结构高度保守.它们编码的蛋白具有典型的DNA结合域(DBD),且均为不含信号肽的不稳定蛋白.启动子分析发现,该基因家族成员的启动子除典型的热激元件(HSE)外,还含有MYB元件等与逆境胁迫及生长发育相关的元件,DlHsfA1d、DlHsfA9a、DlHsfA9b和DlHsfC1启动子存在典型的CpG岛.进化树分析表明DlHsf可分为DlHsfA、DlHsfB和DlHsfC三类. qRT-PCR结果表明,DlHsf在胚性阶段(EC)和球形胚阶段(GE)表达量较高,在不完全胚性紧实结构阶段(ICpEC)表达量较低,在龙眼体胚发育过程中呈现"V"状趋势,表明DlHsf可能主要在EC、GE阶段发挥作用.此外,DlHsf家族成员在花芽和花蕾中表达量较高,其次是在果肉中,推测DlHsfs可能与龙眼花发育等生长过程相关. psRNA Target预测结果表明DlHsf基因家族受到miRNA调控,且调控方式多样.本研究表明DlHsf功能多样,可能在龙眼生长发育、胁迫响应、DNA甲基化、组织器官特异表达等生物学过程中发挥作用.(图8表5参38)     

龙眼漆酶家族成员全基因组结构与功能分析

为了解龙眼漆酶(DlLAC)家族的生物学功能,采用生物信息学分析方法进行龙眼基因组LAC基因成员鉴定,蛋白结构域及特性、启动子顺式作用元件、分子进化树分析、体胚发生过程和组织器官特异表达的FPKM分析以及可能互作的mi RNA预测.结果显示:DlLAC家族基因包含42个基因成员,分为7大类;基因家族成员内含子数量1-8个不等,以5个为主,其中DlLAC15-1中存在600 bp短串联重复序列;DlLAC蛋白结构域共存在5种类型,均属于铜蓝蛋白,以3个铜蓝氧化酶结构域为主;DlLAC蛋白均为分泌型蛋白,亚细胞定位预测在胞外,包含2个以上糖基化位点,具有多个保守的motif;5端调控序列预测分析,DlLAC可能具有多个转录起始位点;DlLACp启动子序列均包含大量非生物胁迫应激响应元件、胚乳特异表达元件及MYB结合位点,推测MYB可能通过DlLAC进而调控龙眼胚胎发育.DlLAC9-1p、DlLAC12p、DlLAC17-2p含黄酮类化合物合成调控的MYB结合位点,可能参与龙眼生长发育过程中种子成熟和果皮成色的色素合成途径;DlLAC家族成员可能参与不同体胚发育过程和不同组织器官形态建成.42个龙眼漆酶成员共有28个受miRNA调控,13个成员受miR397调控,可能与木质素合成相关,8个成员受miR1535调控.非miR397调控的成员可能发挥其他重要的生物学功能.本研究表明,DlLAC家族成员在龙眼生长发育过程中除了参与木质素合成以外,还可能参与胚胎发育、胚乳发育、色素合成、组织器官特异表达等重要生物学功能,表现其功能上的多样性.     

龙眼miR403及其候选靶标对外源激素的响应模式以及在龙眼体胚中的表达模式

MicroRNA403(miR403)为双子叶植物特有的miRNA家族,其在双子叶植物抗病、逆境胁迫和生长发育中具有重要作用.为了解miR403及其候选靶标对外源激素的响应模式以及在龙眼体胚发生过程中的表达模式,利用psRNAtarget对miR403潜在靶标进行预测,采用改良RLM-RACE技术验证其裂解位点,通过qPCR技术检测miR403及其候选靶标对外源激素的应答及在龙眼体胚中的表达模式.结果显示,共获得41个龙眼miR403的潜在靶标,包含4个PPR(Pentatricopeptide repeat protein)和3个PCNT115(Auxin-induced protein PCNT115),却未发现AGO2(Argonaute2).4个PPR中Dlo_014588.1和Dlo_014589.1序列一致,而3个PCNT115基因序列在所预测的miR403结合位点上下游序列基本一致.裂解位点显示,miR403不具备裂解AGO2 mRNA的能力,但介导PPR(Dlo_014588.1)和PCNT115 mRNA的裂解,裂解位点位于miR403 5′端的第2和第3个碱基之间. qPCR显示,miR403响应脱落酸(ABA)信号并显著上调,PPR和PCNT115对不同浓度的ABA呈现不同的表达模式,PPR和PCNT115在5μg/L ABA时显著上调,随后,PPR先显著下调(50μg/L ABA),而后显著上调(5 000μg/L ABA),而PCNT115呈显著下调趋势;miR403不响应赤霉素(GA3)信号,而PPR和PCNT115随着GA3浓度升高而上调;miR403可以响应不同浓度的水杨酸(SA)和2,4-D信号显著下调,而其靶基因显著上调.不同胚性培养物中qPCR显示,miR403仅在龙眼胚性愈伤组织(EC)高度表达且在龙眼体胚发生过程中显著下调,PPR在EC和子叶胚(CE)高度表达,PCNT115在CE和成熟胚(ME)高水平表达,三者之间并未呈现明显的负调控趋势.本研究表明在龙眼体胚中miR403并不靶向调控AGO2,而是调控PPR和PCNT115;另外,miR403可能响应ABA、SA和2,4-D调控PPR和PCNT15参与到龙眼体胚发生过程中.(图5表2参48)     

龙眼BRI1基因家族的全基因组鉴定及光照响应表达

为了解龙眼BRI1基因家族的生物学功能及响应光照机制,对其BRI1基因成员鉴定、基因结构、蛋白保守结构域、启动子顺式作用元件、互作miRNA预测、不同体胚发生阶段和不同组织器官的FPKM值及其响应光照表达模式等进行分析.结果表明:DlBRI1基因家族包含4个成员,分别命名为DlBRI1-1、DlBRI1-2a、DlBRI1-2b和DlBRI1-3.DlBRI1是一种无内含子基因,无内含子基因在转录的过程中不需要经历内含子的剪切步骤,是响应外界因素的一种快速应答基因.龙眼BRI1蛋白家族为植物富亮氨酸重复类受体蛋白激酶的一种,其在植物激素信号转导和非生物胁迫中具有重要调控作用.龙眼BRI1四个家族成员启动子均含有大量的光响应元件、激素应答元件、非生物胁迫响应元件,表明龙眼BRI1家族基因可能是连接光信号转导与激素信号转导的重要纽带. DlBRI1-3为miR390e的靶基因. FPKM值分析表明,DlBRI1-1和DlBRI1-3在体胚发生过程和不同组织部位中均呈现高表达,推测DlBRI1-1和DlBRI1-3可能在龙眼整个生长发育过程中起到更为关键的作用.荧光定量PCR结果推测,蓝光信号使得miR390的表达量显著减少,导致靶基因BRI1-3的表达量增加,从而影响油菜素内脂从属基因BZR1、转录因子PIF4,进而影响龙眼功能性代谢产物积累.本研究表明DlBRI1具有功能多样性,可能在龙眼响应光信号、激素信号、非生物胁迫及代谢调控中发挥作用.(图8表3参46)     

植物miR408家族的进化与分子特性

miR408家族在植物上已有报道,但其进化规律与分子特性研究很少.利用miRbase数据库提供的34种植物49个miR408的前体序列和64个成熟体序列,采用分类统计、进化树构建、序列比对、二级结构预测、染色体定位分析及靶基因预测等手段,进行进化规律与分子特性分析.结果显示:miR408家族成员分布在34个植物物种中,分布较为广泛,并且苔藓类植物可能是植物miR408家族进化的祖先;物种特异性是影响miR408前体进化特性的重要因素,而序列保守性是影响成熟体进化特性的主要因素;由5p臂上形成的miR408成熟体的序列特异性较大,由3p臂上形成的miR408成熟体的序列保守较高;Mfold预测表明植物miR408家族具有典型的茎环二级结构,茎序列的保守性高于环序列,3p臂上茎序列的保守性高于5p臂上茎序列;靶基因预测表明miR408广泛参与植物生长发育和逆境胁迫的应答.综上表明植物miR408家族成员在进化过程中保守性与特异性并存,这对进一步研究植物miR408的生物学功能具有参考价值.     

龙眼GRF家族全基因组鉴定及表达模式

生长调节因子(growth regulating factor,GRF)是植物体内特有的一种转录因子,在植物生长发育、渗透胁迫中发挥重要的作用.基于龙眼基因组和转录组数据,采用生物信息学分析的方法对龙眼GRF(DlGRF)家族成员进行鉴定命名;分析其基本理化性质、基因结构、蛋白结构域、启动子序列顺式作用元件;构建系统进化树、预测可能直接调控DlGRF的miRNAs;分析DlGRF家族在龙眼非胚性及胚性培养物、组织器官、光质与激素处理下的表达水平;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测DlGRF的表达模式.结果显示,龙眼DlGRF家族包含9个成员,均含有QLQ和WRC保守结构域;包含2-5个外显子,以3个为主;分布于四大分支上,与甜橙、拟南芥GRF亲缘关系较近;DlGRF蛋白包含7个motif;启动子序列中包含众多光响应、激素应答、厌氧感应、胁迫响应及其他与生长发育相关的作用元件.转录组结果显示,DlGRF家族8个成员在球形胚阶段表达量高于其他阶段;各成员均在种子中有较高表达量,对蓝、白光及激素响应明显. qRT-PCR结果显示,DlGRF1-2、DlGRF2-1、DlGRF2-2、DlGRF4、DlGRF5-1及DlGRF7在球形胚阶段表达量最高;DlGRF1-1、DlGRF1-2、DlGRF2-2及DlGRF5-2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和赤霉素(GA3)等激素处理中表达上调.此外,DlGRF可能受miR396a调控,调控方式为裂解靶标.本研究表明DlGRF在进化过程中保守性较高,且可能受到蓝光和激素的诱导,参与龙眼非胚性及胚性培养物尤其是球形胚及种子发育形成的过程.(图6表3参42)     

龙眼胚性愈伤组织Cu/Zn-SOD分子伴侣基因CCS的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

为了解Cu/Zn超氧化物歧化酶分子伴侣基因(CCS)在龙眼体胚发生过程中的表达调控机制,以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR法,克隆了长960 bp含有完整开放阅读框的龙眼DlCCS核酸序列,其编码一个含有319个氨基酸的蛋白质(GenBank登录号:FJ973472).生物信息学分析显示:该蛋白为亲水的、稳定的、含有跨膜结构域的酸性蛋白质,定位于叶绿体;与毛果杨、葡萄、拟南芥、水稻和锦鸡儿具有较高同源性,含有植物CCS蛋白所特有的3个保守结构域;预测其通过不同的磷酸化方式,改变酶活性及蛋白构象,参与龙眼体胚中超氧化物代谢以及金属离子转运等生物学过程,在氧化还原过程中发挥作用.利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术研究该基因在龙眼体胚发生发育过程中的表达情况,结果显示,从松散型胚性愈伤组织(Stage 1)到胚性紧实球形结构阶段(Stage 4),DlCCSmRNA的转录水平较低且波动小;当胚性紧实球形结构进一步发育到子叶形胚阶段(Stage 8),其表达量迅速增加,在成熟胚阶段(Stage 9)达到最高峰,提示DlCCS可能在龙眼体胚的中晚期起主要作用     

龙眼胚性愈伤组织维生素C过氧化物酶基因(apx)及NADH脱氢酶基因(nad2)部分序列的克隆

采用PCR技术从龙眼胚性愈伤组织中扩增出维生素C过氧化物酶基因 (apx)的部分cDNA序列longan1及NADH脱氢酶基因(nad2)的部分cDNA序列longan31,其中longan31是首次从体胚中克隆到的NADH脱氢酶基因(nad2).杂交结果显示,longan1与胚性愈伤组织和球形胚的RNA具有明显杂交信号,说明longan1在胚性愈伤组织和球形胚阶段特异表达. 图 3参 19     

龙眼Aquaporin家族的全基因组鉴定及其在体细胞胚发生早期的表达

水孔蛋白(AQP)是生物调控水跨膜运输的重要通道.为了解龙眼AQP基因家族的生物学功能,利用本实验室的龙眼基因组数据库,结合生物信息学的分析方法进行龙眼全基因组范围内AQP家族成员的鉴定,并对其蛋白质理化性质、系统进化关系、共线性、选择压力、基因结构、保守基序、蛋白质保守结构域、顺式作用元件、蛋白质互作和体细胞胚早期不同阶段的基因表达情况进行分析.结果显示,龙眼AQP基因家族共有35个成员,蛋白分子量在17.77×10~3-44.30×10~3 kD之间,分布在14条染色体上;经系统发育树分析,可将其分为5个不同亚家族:PIPs、TIPs、NIPs、SIPs和XIPs;不同亚家族间等电点、磷酸化位点、内含子数量和motif分布差异较大;AQP家族成员间共有6对共线性基因,与拟南芥基因组间有28对共线性基因,且在进化过程中都受纯化选择作用;龙眼AQP家族蛋白质都含有MIP保守结构域;其家族成员可与SYP、PP2A和BOR发生互作,PIP亚家族内的蛋白互作关系最强;基因组的FPKM值分析发现,大部分AQP成员可在龙眼胚胎早期不同阶段进行表达,其中DlTIP4的表达量在所有阶段远高于其他成员,可能在整个过程中发挥着重要作用.本研究表明龙眼35个AQP家族成员基因可能在体细胞胚胎发育阶段发挥重要作用,并且可能响应干旱、低温等非生物胁迫和脱落酸、生长素等植物激素的调控,在功能上具有明显的多样性.(图9表3参55)     

野生蕉miR395a前体克隆与进化特性及启动子分析

植物miR395参与硫代谢调控,并在应答逆境胁迫等方面起重要调控作用.为了解香蕉miR395的分子特性和进化规律,在参考香蕉基因组信息的基础上,结合RT-PCR技术,从三明野生蕉(Musa itinerans)叶片中获得81 nt miR395a前体序列,包含21 nt miR395a成熟体序列.进化特性分析表明,植物miR395a前体存在于27个物种中,野生蕉pre-miR395a序列与双子叶耧斗菜(Aquilegia viridiflora Pall.)最为接近,与单子叶的水稻、玉米、高粱最远,表明野生蕉pre-miR395a的起源比较特殊;前体序列长度差异较大(57-226 nt);miR395a成熟体序列分析发现,来自5p臂上的miR395a序列特异性较大.野生蕉miR395a前体能形成典型的发卡结构,miR395a成熟体位于前体的3p臂上.转录起始位点分析表明,野生蕉pri-miR395a转录起始区域位于-87 bp--38 bp,A为转录起始位点.启动子顺式作用元件预测分析表明,野生蕉miR395a启动子包含多个激素、胁迫、生物钟及光响应元件,可能与响应胁迫密切相关.qPCR检测结果也发现miR395a的表达量在低温胁迫下极显著下调,表明响应低温胁迫.综上表明三明野生蕉在响应低温胁迫过程中miR395a起着重要调控作用,这对于进一步研究野生蕉miR395a在低温胁迫中的作用机制具有参考价值.     

黑斑蛙Dmrt1基因的克隆及在不同组织中的表达

Dmrt基因家族是新近发现的一个与性别决定相关的基因家族,该家族成员都含有一个新的具有DNA结合能力的保守基序——DM结构域.本文采用简并PCR技术,扩增并克隆了黑斑蛙基因组中的DM结构域,经序列分析,获得了Dmrt家族成员rnDmrt1;进一步根据获得的rnDmrt1序列,设计一对特异引物,采用RT-PCR技术对成蛙不同组织Dmrt1基因的表达进行了研究.结果发现,rnDmrt1只在精巢中特异表达,在卵巢、脑、肝、心、肾及肌肉组织中无表达,显示Dmrt1基因在性别决定和分化中有重要功能. 图4参9     

西番莲查尔酮合成酶(CHS)基因家族全基因组鉴定及表达模式北大核心CSCD

为了解西番莲(Passiflora edulis Sims f.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因家族的分子进化特性及其在果皮着色与非生物胁迫中的功能,从Pfam数据库下载CHS蛋白HMM模型,并使用HUMMER 3.0、Blast工具和CDD-search鉴定出西番莲基因组中的CHS基因.采用TBtools、EXPASy、MEGA 7.0、MEME、PRAB、SWISSMODEL和PlantCARE等软件对其氨基酸与碱基序列进行生物信息学分析,采用qRT-PCR的方法检测西番莲CHS(PeCHS)基因家族成员进行表达模式分析.研究结果显示西番莲基因组中共有11个PeCHS基因家族成员,分布在6条染色体上,可分为4个亚族,基因结构分析显示2个PeCHS(PeCHS5和PeCHS9)基因具有3个外显子,其他PeCHS基因只具有2个外显子.西番莲物种内共线性分析结果显示两个PeCHS基因对具有片段重复特征:PeCHS3-PeCHS6和PeCHS7-PeCHS9.多物种共线性分析结果显示,只有PeCHS10基因与其他物种具有进化关系.启动子顺式作用元件分析表明该基因家族成员启动子上含有大量逆境胁迫和激素、响应元件.qRT-PCR结果显示PeCHS基因在紫色果皮中的表达量明显高于黄色果皮,且大部分PeCHS基因的表达量在紫色西番莲果皮转色后显著增加.此外,分别有5个(PeCHS3、PeCHS4、PeCHS6、PeCHS8、PeCHS10)和6个(PeCHS1、PeCHS3、PeCHS4、PeCHS7、PeCHS8、Pe CHS11)基因的表达量在高温与低温胁迫下显著提高.本研究表明西番莲的CHS家族成员序列相对保守,并且部分成员可能在果皮花青素积累与温度胁迫中发挥重要作用.(图10表4参53)     

文心兰15个miRNAs及其候选靶标的表达特性

为了解miRNAs及其候选靶标在文心兰不同组织部位及假鳞茎受软腐病病原菌侵染中的表达规律,基于文心兰转录组和miRNA数据库进行分析,从中筛选获得15个miRNAs,结合生物信息学法对其候选靶标进行预测和功能注释,并利用实时荧光定量技术检测miRNA及候选靶标在文心兰不同组织部位和假鳞茎受软腐病病原菌侵染的表达情况.结果表明,文心兰miRNA数据库的miRNA reads分析提示15个miRNAs不同成员可能在文心兰正常植株和感病不同阶段中差异表达. psRNATarget靶标预测显示,文心兰15个miRNAs有828个候选靶标,其中67个可能与抗病相关,包括丝氨酸/苏氨酸蛋白、F-box蛋白基因、锌指蛋白、RGA抗病蛋白等.基于文心兰miRNAs读取次数(Reads)和Unigene候选靶标RPKM值,发现miRNAs及其候选靶标在文心兰正常植株和假鳞茎不同感病时段表达均存在差异.实时荧光定量PCR分析显示,在文心兰不同组织部位中,miR159a、miR167b、miR168a、miR169a、miR171a和miR172a均在假鳞茎和叶中均大量表达,并与对应候选靶标的表达呈负调控关系,推测它们参与假鳞茎和叶的发育和形态建成.在软腐病病菌侵染文心兰假鳞茎中,miR159a、miR168a、miR169a、miR171a和miR172a在8 h处理时表达量高,并且与对应的候选靶标在侵染0-8 h表达呈负调控关系,推测上述miRNAs通过负调控候选靶标在中期响应软腐病病原菌侵染过程;而miR167b在处理0h高表达,并且与候选靶标在侵染0-8h表达呈负调控关系,推测其通过下调表达参与软腐病病原菌侵染过程的响应.上述研究表明,文心兰miRNAs通过介导候选靶标的裂解可能广泛参与文心兰不同组织的发育及软腐病病原菌侵染过程的响应.     

Identification and expression of the COI1 gene family in Camellia sinensis and its expression in oolong tea processing北大核心CSCD

茉莉酸受体蛋白COI1(coronatine insensitive 1)是茉莉酸信号转导途径的重要组成部分,为鉴定分析茶树茉莉酸受体COI1基因家族,预测其潜在的分子功能,了解茉莉酸受体COI1基因在乌龙茶加工中应答胁迫的分子机制,利用生物信息学方法对茶树茉莉酸受体COI1进行家族成员鉴定,氨基酸序列、结构域、基因结构、进化分析以及启动子顺式元件分析,结合实时荧光定量分析CsCOI1基因在乌龙茶加工中的表达.结果显示,茶树茉莉酸受体CsCOI1家族有两个成员,均含有F-box和富亮氨酸重复序列(LRRs)两个结构域;单子叶、双子叶的COI1蛋白各聚一支,且与蜜柑进化关系较近;茶树COI1基因家族两个成员均含有3个内含子,启动子顺势元件主要有胁迫响应元件、激素响应元件以及光响应元件;转录组数据说明茶树CsCOI1基因具有较强的组织表达差异性.实时荧光定量分析表明,CsCOI1a基因在室内萎凋后表达显著上调,且15 min、30 min日光萎凋后CsCOI1b基因的表达水平显著上调,同时茉莉酸含量发生显著变化.本研究推测CsCOI1基因可能通过茉莉酸信号转导途径参与乌龙茶加工中萎凋的胁迫响应过程,该结果可为乌龙茶加工品质调控奠定基础.(图8表2参30)     

基于全基因组预测莱茵衣藻的新miRNA及其靶基因

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种重要的模式生物,其miRNA的发现相对较晚.为系统化地预测分析莱茵衣藻的miRNA,采用比较基因组和同源比对相结合的方法,根据mi Rbase中已知的莱茵衣藻miRNA序列以及前体的特点,并且基于莱茵衣藻的全基因组对其miRNA的前体序列和成熟miRNA进行系统的分析和筛选,使用unigene和JGI的莱茵衣藻相关序列数据库对预测结果进行靶基因预测和功能的分析.最终发现可能存在的miRNA 36条,其前体结构符合miRNA前体的基本特征且具有高度的同源性,两个数据库所得相匹配靶基因分别为64和32条,其中部分是与莱茵衣藻各项生命活动相关的基因.本研究表明莱茵衣藻的基因组中具有可能存在的新miRNA家族,并且部分有高度匹配的靶基因,为其后续研究提供了可靠的理论支持.     

植物中3-磷酸甘油脱氢酶基因家族的物种特异性进化分析

3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)是一种在磷酸甘油酯的代谢过程中起重要调节作用的关键酶,研究植物中3-磷酸甘油脱氢酶基因家族的进化历史及其多样性对进一步探索其作用机制具有重要意义.以20个已报道的GPDH基因作为查询序列,与19种代表性的植物物种的基因组分别进行BLASTP和t BLASTN比对以及隐马尔科夫模型搜索,获得基因家族新成员,构建系统发育树,并对其进行基因结构、蛋白模体、功能差异性以及适应性进化分析.预测得到了75个新的GPDH基因家族成员,系统发育分析表明,植物中的GPDH基因属于3个单系类群(命名为族群I、族群II和族群III),并且在进化过程中主要分为两个进化枝,说明GPDH基因家族源自两个GPDH祖先基因;功能差异性分析表明,氨基酸特异性位点的选择性约束作用于不同族群的GPDH基因上,并且导致了不同族群多样化之后的特异性进化,同时,在族群I/III和族群II/III中也发现了Type-II功能差异性,表明氨基酸的理化性质也发生了本质的改变;适应性进化分析以及ka/ks比值分析表明,GPDH基因家族在物种特异性复制之后的进化过程中受到了纯化选择作用.因此,GPDH基因家族在其进化过程中受到不同的选择压力而出现了不同的进化方向,形成了多样化的族群.此外,对该基因家族进行的系统的分子进化探索为植物中GPDH基因家族的进一步生物化学和遗传方面的研究以及基因组分析提供了数据基础,在GPDH基因家族分析中的结果与发现也为研究其他基因家族提供了有力的帮助.     

中华猕猴桃EIN3/EIL转录因子家族的成员鉴定、系统进化和基因表达模式

EIN3/EIL家族是一类非常重要的转录因子,调控植物包括果实成熟在内的众多生长发育过程.对中华猕猴桃EIN3/EIL家族进行系统的生物信息学和比较基因组学研究,在中华猕猴桃基因组中鉴定得到8个EIN3/EIL转录因子;其蛋白序列包括1个酸性氨基酸富集区、1个脯氨酸富集区以及5-7个碱性氨基酸富集区.包括中华猕猴桃在内的20种植物的EIN3/EIL成员的系统进化树表明,EIN3/EIL基因在众多植物基因组中同时存在趋同和趋异的进化趋势.中华猕猴桃EIN3/EIL基因家族成员的增加主要源于其进化过程中发生的全基因组三倍化倍增事件.在果实成熟过程中,中华猕猴桃EIN3/EIL基因呈现组成型的高或低表达两种截然相反的基因表达趋势.本研究鉴定得到了中华猕猴桃EIN3/EIL家族的成员,系统揭示了其成员蛋白序列中的保守区域、在不同植物物种中的进化趋势,植物基因组倍增所导致的家族成员增加,以及果实发育过程中表现出的显著的基因表达水平差异,可为中华猕猴桃EIN3/EIL基因的功能研究提供候选基因以及数据基础.