稀有鮈鲫Dmrt基因家族13个成员的克隆与序列分析

已经发现果蝇Doublesex、线虫Mab-3、青DMRT1Y/DMY和人类DMRT1等性别决定与分化基因均含有一个具有DNA结合能力的保守基序--DM结构域,对性别决定和性别分化具有调控功能.利用简并PCR,从稀有鲫基因组DNA中克隆了13个具有不同DM结构域的Dmrt基因家族成员.基于DM保守基序,建立了各物种的进化树.结果表明,稀有鲫基因组存在多个Dmrt基因成员,该基因在脊椎动物和非脊椎动物中具有高度保守性,是一种理想的环境内分泌干扰物研究的分子模型,在分子生态毒理学研究中具有很好的应用前景.     

龙眼漆酶家族成员全基因组结构与功能分析

为了解龙眼漆酶(DlLAC)家族的生物学功能,采用生物信息学分析方法进行龙眼基因组LAC基因成员鉴定,蛋白结构域及特性、启动子顺式作用元件、分子进化树分析、体胚发生过程和组织器官特异表达的FPKM分析以及可能互作的mi RNA预测.结果显示:DlLAC家族基因包含42个基因成员,分为7大类;基因家族成员内含子数量1-8个不等,以5个为主,其中DlLAC15-1中存在600 bp短串联重复序列;DlLAC蛋白结构域共存在5种类型,均属于铜蓝蛋白,以3个铜蓝氧化酶结构域为主;DlLAC蛋白均为分泌型蛋白,亚细胞定位预测在胞外,包含2个以上糖基化位点,具有多个保守的motif;5端调控序列预测分析,DlLAC可能具有多个转录起始位点;DlLACp启动子序列均包含大量非生物胁迫应激响应元件、胚乳特异表达元件及MYB结合位点,推测MYB可能通过DlLAC进而调控龙眼胚胎发育.DlLAC9-1p、DlLAC12p、DlLAC17-2p含黄酮类化合物合成调控的MYB结合位点,可能参与龙眼生长发育过程中种子成熟和果皮成色的色素合成途径;DlLAC家族成员可能参与不同体胚发育过程和不同组织器官形态建成.42个龙眼漆酶成员共有28个受miRNA调控,13个成员受miR397调控,可能与木质素合成相关,8个成员受miR1535调控.非miR397调控的成员可能发挥其他重要的生物学功能.本研究表明,DlLAC家族成员在龙眼生长发育过程中除了参与木质素合成以外,还可能参与胚胎发育、胚乳发育、色素合成、组织器官特异表达等重要生物学功能,表现其功能上的多样性.     

基于转录组的‘三月李’及其红肉突变体ARF基因家族鉴定及分析

生长素反应因子(Auxin response factors,ARFs)是一类在植物生长发育过程中发挥着重要作用的转录调控因子.为鉴定ARF家族基因、了解成员特征及其在李果实成熟过程中表达模式,基于‘三月李’及其红肉突变体果实成熟过程的转录组数据,采用生物信息学分析方法进行PsARF家族基因鉴定,并对其蛋白质理化特性、亚细胞定位、系统进化树、蛋白质质保守结构域以及表达模式进行分析.共鉴定得到17个PsARF家族成员.生物信息学分析结果表明PsARF家族蛋白质长度在600-1 157 aa之间,分子量(Mr)在66.24×103-129.31×103之间,等电点介于5.44-8.31之间,均为位于细胞核的不稳定亲水蛋白质.系统进化树分析表明PsARF家族成员可分为4组. PsARF蛋白质均具有典型的B3和Auxin_resp结构域,且多数具有Aux/IAA结构域.保守基序分析表明,PsARF家族蛋白质包含15个保守基序,但非每个蛋白质均含有保守基序. 10个PsARF家族基因在‘三月李’及其红肉突变体果实成熟过程中差异表达,不同基因表达模式各不相同.其中,PsARF2和PsARF16在‘三月李’和红肉突变体中的表达模式相反;PsARF10在‘三月李’果肉中表达量显著高于红肉突变体果肉中的表达量.本研究表明PsARF家族成员可能在李果实成熟过程中具有不同的功能,结果可为深入研究PsARF家族基因在李果实成熟过程中的功能奠定基础.(图5表2参40)     

龙眼miR159家族成员进化特性及时空表达

为了解植物miR159家族成员的进化特性及其在不同组织部位的表达规律,以龙眼miR159家族为例对miRNA家族进行探讨.通过龙眼miR159家族前体与成熟体序列比对、前体二级结构预测、系统发育进化树的构建、靶基因预测及实时荧光定量等手段,对龙眼miR159基因家族进行研究.结果显示:龙眼miR159家族存在7个前体成员和6个成熟体成员,序列比对发现5个成熟体可以高度定位于7个前体序列中一个共有的、约20个碱基的保守区域,推测miR159成熟体主要来源于该区域;进一步分析发现6个成熟体序列中仅2个可定位于pre-MIR159中.mfold预测结果显示miR159家族7个前体的最小折叠自由能在-56.54--92.53 kal/mol之间,均能自发形成典型、稳定的茎环二级结构.系统发育进化树显示龙眼miR159家族前体与成熟体成员均具有保守性与多样性.靶基因预测发现龙眼miR159家族所有成员共预测出14个不同靶标,其中3个成员也可以作用于同一靶标.实时荧光定量PCR显示,龙眼pre-MIR159家族成员间在不同组织部位表达量差异显著,但表达趋势却几乎一致,其中花器官中表达量最高,提示了dlo-miR159在生殖器官形成过程中具有重要的作用,尤其是在雄花中作用显著.本研究表明龙眼miR159家族在进化过程中形成了保守性与多样性并存的进化特性,并且可能在花器官形成过程中发挥了重要的作用.     

Identification and expression of the COI1 gene family in Camellia sinensis and its expression in oolong tea processing北大核心CSCD

茉莉酸受体蛋白COI1(coronatine insensitive 1)是茉莉酸信号转导途径的重要组成部分,为鉴定分析茶树茉莉酸受体COI1基因家族,预测其潜在的分子功能,了解茉莉酸受体COI1基因在乌龙茶加工中应答胁迫的分子机制,利用生物信息学方法对茶树茉莉酸受体COI1进行家族成员鉴定,氨基酸序列、结构域、基因结构、进化分析以及启动子顺式元件分析,结合实时荧光定量分析CsCOI1基因在乌龙茶加工中的表达.结果显示,茶树茉莉酸受体CsCOI1家族有两个成员,均含有F-box和富亮氨酸重复序列(LRRs)两个结构域;单子叶、双子叶的COI1蛋白各聚一支,且与蜜柑进化关系较近;茶树COI1基因家族两个成员均含有3个内含子,启动子顺势元件主要有胁迫响应元件、激素响应元件以及光响应元件;转录组数据说明茶树CsCOI1基因具有较强的组织表达差异性.实时荧光定量分析表明,CsCOI1a基因在室内萎凋后表达显著上调,且15 min、30 min日光萎凋后CsCOI1b基因的表达水平显著上调,同时茉莉酸含量发生显著变化.本研究推测CsCOI1基因可能通过茉莉酸信号转导途径参与乌龙茶加工中萎凋的胁迫响应过程,该结果可为乌龙茶加工品质调控奠定基础.(图8表2参30)     

中华猕猴桃bZIP家族成员的比较基因组学分析

bZIP转录因子调控着植物的生长发育和逆境胁迫应答,是植物中一类重要的转录因子.基于系统的生物信息学方法,鉴定得到79个中华猕猴桃bZIP转录因子,进化分析结果揭示中华猕猴桃bZIP家族成员在J、K、L三个分组中出现了成员的缺失.中华猕猴桃bZIP家族成员的bZIP保守域主要由碱性结构域和亮氨酸拉链结构域组成,其亮氨酸拉链结构域的第4、5肽段的第7位的亮氨酸残基存在一定程度的变异.bZIP保守域之外,在中华猕猴桃的18个bZIP家族成员中,还发现包括bZIP_C保守域在内的8种其他类型的保守域,集中分布在A、C、D和G组bZIP成员中.通过与葡萄和番茄bZIP同源基因的比较,阐明中华猕猴桃基因组的两次三倍倍增是其bZIP基因数目增加的主要原因.中华猕猴桃不同发育时期果实的转录组揭示了参与调控果实成熟的57个bZIP基因的表达水平.本研究阐明了中华猕猴桃bZIP家族成员的进化特征、保守域组成、家族成员数目扩增的主要原因,提供了涉及果实发育的优良候选基因.(图6表2参28)     

高羊茅中一个DREB类转录因子基因的分离及鉴定分析

为了鉴定草坪草高羊茅(Festucaarundinacea Schreb.)中与低温、高盐和干旱胁迫相关的基因,我们构建了冷诱导(4℃)的高羊茅cDNA文库,并从这个文库中分离得到一个DREB类转录因子基因,FaDREB1A.序列分析表明,FaDREB1A具有一个717bp的开放阅读框和143bp的3’非编码区,推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的EREBP/AP2结构域.酵母单杂交结果表明,FaDREB1A蛋白能在体外特异结合DRE元件,并具有转录激活功能.Southern杂交结果显示,FaDREB1A在高羊茅基因组中可能是单拷贝或低拷贝基因.Northern杂交结果发现,FaDREB1A基因受低温、高盐和干旱的诱导表达,对ABA没有反应,说明FaDREB1A基因在高羊茅植株对低温、高盐和干旱的应答反应中起重要作用.图5参30     

龙眼GRF家族全基因组鉴定及表达模式

生长调节因子(growth regulating factor,GRF)是植物体内特有的一种转录因子,在植物生长发育、渗透胁迫中发挥重要的作用.基于龙眼基因组和转录组数据,采用生物信息学分析的方法对龙眼GRF(DlGRF)家族成员进行鉴定命名;分析其基本理化性质、基因结构、蛋白结构域、启动子序列顺式作用元件;构建系统进化树、预测可能直接调控DlGRF的miRNAs;分析DlGRF家族在龙眼非胚性及胚性培养物、组织器官、光质与激素处理下的表达水平;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测DlGRF的表达模式.结果显示,龙眼DlGRF家族包含9个成员,均含有QLQ和WRC保守结构域;包含2-5个外显子,以3个为主;分布于四大分支上,与甜橙、拟南芥GRF亲缘关系较近;DlGRF蛋白包含7个motif;启动子序列中包含众多光响应、激素应答、厌氧感应、胁迫响应及其他与生长发育相关的作用元件.转录组结果显示,DlGRF家族8个成员在球形胚阶段表达量高于其他阶段;各成员均在种子中有较高表达量,对蓝、白光及激素响应明显. qRT-PCR结果显示,DlGRF1-2、DlGRF2-1、DlGRF2-2、DlGRF4、DlGRF5-1及DlGRF7在球形胚阶段表达量最高;DlGRF1-1、DlGRF1-2、DlGRF2-2及DlGRF5-2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和赤霉素(GA3)等激素处理中表达上调.此外,DlGRF可能受miR396a调控,调控方式为裂解靶标.本研究表明DlGRF在进化过程中保守性较高,且可能受到蓝光和激素的诱导,参与龙眼非胚性及胚性培养物尤其是球形胚及种子发育形成的过程.(图6表3参42)     

龙眼Aquaporin家族的全基因组鉴定及其在体细胞胚发生早期的表达

水孔蛋白(AQP)是生物调控水跨膜运输的重要通道.为了解龙眼AQP基因家族的生物学功能,利用本实验室的龙眼基因组数据库,结合生物信息学的分析方法进行龙眼全基因组范围内AQP家族成员的鉴定,并对其蛋白质理化性质、系统进化关系、共线性、选择压力、基因结构、保守基序、蛋白质保守结构域、顺式作用元件、蛋白质互作和体细胞胚早期不同阶段的基因表达情况进行分析.结果显示,龙眼AQP基因家族共有35个成员,蛋白分子量在17.77×10~3-44.30×10~3 kD之间,分布在14条染色体上;经系统发育树分析,可将其分为5个不同亚家族:PIPs、TIPs、NIPs、SIPs和XIPs;不同亚家族间等电点、磷酸化位点、内含子数量和motif分布差异较大;AQP家族成员间共有6对共线性基因,与拟南芥基因组间有28对共线性基因,且在进化过程中都受纯化选择作用;龙眼AQP家族蛋白质都含有MIP保守结构域;其家族成员可与SYP、PP2A和BOR发生互作,PIP亚家族内的蛋白互作关系最强;基因组的FPKM值分析发现,大部分AQP成员可在龙眼胚胎早期不同阶段进行表达,其中DlTIP4的表达量在所有阶段远高于其他成员,可能在整个过程中发挥着重要作用.本研究表明龙眼35个AQP家族成员基因可能在体细胞胚胎发育阶段发挥重要作用,并且可能响应干旱、低温等非生物胁迫和脱落酸、生长素等植物激素的调控,在功能上具有明显的多样性.(图9表3参55)     

水稻花药绒毡层特异表达启动子的分离与表达载体构建

从籼稻川75A(OryzasativaL.)黄化苗叶片中直接提取基因组总DNA.根据文献报道的水稻花药绒毡层特异启动子Osg6B序列设计引物,采用TouchdownPCR技术获得水稻花药绒毡层特异表达的启动子Tsp1,将该片段克隆在载体pMD18-TVector上转化到大肠杆菌JM109,并酶切和PCR验证.序列分析发现,该片段与Osg6B启动子同源性为96%,且具有真核生物启动子的多种特征序列,表明启动子Tsp1为来源于籼稻川75A中的水稻花药绒毡层特异表达的启动子.利用该启动子对本实验室保存的质粒pIB467和pIB009进行改造,构建了一个可产生新型雄性不育系的双元植物表达载体pJH401.图7参13     

全氟辛烷磺酸盐(PFOS)及替代品对两栖类蝌蚪的急性毒性

PFOS及其4种替代品对两栖动物非洲爪蟾和黑斑蛙蝌蚪的急性毒性结果为:用调聚法合成的织物三防整理剂对非洲爪蟾蝌蚪和黑斑蛙蝌蚪的96h-LC50分别为8和21mg·L-1,而PFOS对两种蝌蚪的96h-LC50分别为92和81mg·L-1。此实验结果说明织物三防整理剂的急性毒性高于PFOS。用电解氟化法合成的C4、C6织物三防整理剂和50%的全氟丁基有机铵盐阳离子表面活性剂浓度在100mg·L-1时,对两种蝌蚪都没有毒性。这说明,从急性毒性的角度,C4、C6织物三防整理剂和表面活性剂可作为PFOS的替代品使用,但是织物三防整理剂的急性毒性比PFOS大,作为替代品使用应慎重考虑。另外,PFOS和织物三防整理剂对黑斑蛙蝌蚪的急性毒性与对非洲爪蟾蝌蚪的急性毒性存在差异。出于保护我国本土两栖动物的目的,使用黑斑蛙开展毒性评价比使用非洲爪蟾更有现实意义。     

中药材哈蟆油PCR鉴定的初步研究

从中国林蛙 (Ranachensinensis)、中华大蟾蜍 (Bufogargarizans)以及鳕鱼 (Gadusmacrocephalus)等组织材料中提取DNA ,扩增出约 340bp的 12SrRNA基因片段 ,测定其序列 ,并参考有关序列 ,设计一对哈蟆油的鉴别引物HsmL1、HsmH1,用该鉴别引物扩增蛙类原动物的模板DNA时 ,只有中国林蛙和黑龙江林蛙的模板能得到阳性扩增 ,其余样品为阴性 .因此该对引物能用于哈蟆油药材来源的鉴别 .对购自 5个不同药材商店的哈蟆油PCR鉴定结果表明 ,现市售商品哈蟆油有不同的材料来源 .图 3表 1参 9     

拟南芥SHI基因在烟草中的表达和矮化、延迟开花的烟草植株的获得

利用聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥基因组DNA中克隆了拟南芥SHOTINTERNODS(SHI)基因,并进行了序列测定.以载体pBI121为基本骨架构建了SHI的植物表达载体,并导入根癌农杆菌EHA105.通过农杆菌介导的叶盘法将拟南芥SHI基因转入烟草.PCR和RT-PCR检测证明,拟南芥SHI基因已整合到烟草基因组中并得以表达,获得了矮化、延迟开花的烟草植株.图5参12     

番茄ARF4基因果实特异RNAi载体的构建及遗传转化

构建ARF4基因果实特异表达的RNA干涉载体,对转基因番茄果实进行初步分析,可为采用基因工程方法改良番茄果实品质做出新尝试.利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增SlARF4基因全长,将番茄ARF4基因正反向重复序列片段导入到植物表达载体pBI121上,启动子是番茄果实特异表达的TFM7.将构建的ARF4基因果实特异RNA干涉载体pBI121-TFM7-A4Ri通过根癌农杆菌介导转入到野生型番茄中,进而对转化获得的植株进行了阳性鉴定.分别以转基因番茄和野生型番茄为材料,分析ARF4在果实中的表达水平,测定绿熟期果实叶绿素含量、果实的单果重量和果皮厚度.酶切证实pBI121-TFM7-A4Ri果实特异表达载体构建成功,而且,PCR检测也得到阳性转基因株.半定量RT-PCR分析显示,转基因番茄果实中ARF4的表达量明显低于野生型果实.转基因番茄果实的叶绿素含量、单果重量和果皮厚度都比野生型有提高.因此,ARF4果实特异表达的RNAi方法能够改良番茄果实品质.     

桃ACC合酶基因组DNA（pACSG01）的序列分析及其表达

以桃基因组DNA为模板，用套式PCR技术扩增并克隆了桃ACC合酶基因片段，将其克隆（定名为pACSG01）并进行序列测定，表明该自然全长1320bp，并富含HindⅢ和EcoRⅠ位点，与其它ACC合酶基因结构序列有一定的相似性，内含有两个内含子，编码的氨基酸序列与已克隆桃ACC合酶cDNA推导的氨基酸序列的同源性分别为57．4％和56．8％，pACSG01与我们已克隆的两个桃ACC合酶cDNA基因表达有所不同，RNA点杂交和RT－PCR结合Southern杂交分析表明，该基因在成熟和乙烯处理的果实均不表达，伤处理、LiCl和生长素处理也不能诱导核基因的表达，在衰老花瓣中也不表达，图3参18。     

两种龟类Sox基因的PCR扩增及SSCP分析的研究

采用ＰＣＲ技术,扩增了平胸龟、黄缘盒龟的Ｓｏｘ基因,扩增产物与人ｐＹ５３．３ＳＲＹ基因探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,证实了扩增产物是人ＳＲＹ基因的同源片段;采用ＳＣＰ分析技术,显示龟类该基因片段的序列与人有较大差异,而龟类种间差异则较小,种内雌雄个体间则无差异．本文结果支持Ｓｏｘ基因在系统演化上十分保守的结论．     

恒河猴piwil1基因的表达

为了解人类近亲恒河猴piwil1基因的结构、表达和功能差异,利用RT-PCR方法克隆了恒河猴piwil1基因,并对其编码产物进行了相应的生物信息学分析,随后检测了piwil1 mRNA在成年恒河猴10种组织中的表达情况,最后利用免疫组化方法比较了PIWIL1蛋白在成人、成年恒河猴和幼年恒河猴睾丸组织中表达的异同.结果表明,恒河猴piwil1基因全长2 586 bp,编码861个氨基酸,氨基酸数目与人类piwil1基因相同.恒河猴PIWIL1蛋白与人的PIWIL1蛋白序列同源性达99%,均含有PAZ结构域和Piwi结构域.在成人和成年恒河猴的睾丸组织中,PIWIL1蛋白均在精母细胞和精细胞的胞浆中表达,而在幼年恒河猴睾丸组织中,PIWIL1表达与成年恒河猴相比存在差异,表达量相对较低,且主要表达于生精小管的细胞的细胞核上.上述结果提示,PIWIL1蛋白在成人和成年恒河猴可能具有相同作用,但是在不同的发育阶段中PIWIL1蛋白的功能不同.