发生和未发生连作芦蒿枯萎病土壤的尖孢镰刀菌数量、产毒能力和致病力

尖孢镰刀菌引起的枯萎病是芦蒿连作障碍主要病害.对芦蒿不同种植年限发病和未发病土壤中尖孢镰刀菌数量、产毒素(镰刀菌酸)能力、致病力等开展研究.对采集的11份土壤样品分析结果显示:相较于不发病土壤,发病率≥40%的土壤尖孢镰刀菌数量显著增加;不发病和发病率≤25%的土壤尖孢镰刀菌数量没有显著差异(P>0.05).发病率为85%和40%的土壤尖孢镰刀菌高产毒素(镰刀菌酸产量>500μg L-1)的菌株比例显著(P<0.05)高于发病率为11%和不发病土壤.致病力测定显示发病率为85%和40%土壤中高致病力菌株比例显著(P<0.05)高于发病率为11%的土壤和不发病土壤,不致病菌株比例显著(P<0.05)低于发病率为11%的土壤和不发病土壤.土壤尖孢镰刀菌数量与连作年限没有显著相关性(P>0.05).发病土壤中,发病率、尖孢镰刀菌高产毒素菌株比例和高致病力菌株(病情指数>2)比例与连作年限显著(P<0.05)相关;未发病土壤中,尖孢镰刀菌高产毒素菌株比例和高致病力菌株比例与连作年限没有显著相关性(P>0.05).随着连作芦蒿发病率的增加,土壤中尖孢镰刀菌菌株数量、高产毒素菌株比例、致病菌株比例均显著增加(P<0.05),未发病连作土壤尖孢镰刀菌菌株数量、高产毒素菌株比例、致病菌株比例均没有显著变化.本研究结果可为连作芦蒿枯萎病发病机理的研究及其防治提供理论基础.     

粉葛根腐病的病原鉴定

近年来发现一种严重为害粉葛块根的土传病害。经显微镜直接检查、病原菌分离培养观察、致病性测定及田间病害调查，初步鉴定该病为粉葛镰刀菌根腐病，病原菌为腐皮镰刀菌(Fusarium solani，属半知菌亚门真菌)；该病的发生是由于腐皮镰刀菌与植物线虫复合感染所致。该报道在中国尚属首例。     

具有抑菌促生作用的植物内生细菌的筛选

从168株分离自茄科作物体内的对黄瓜枯萎病菌或番茄青枯病菌有拮抗作用的细菌中，筛选出19株对辣椒疫病菌有较好拮抗作用的菌株，其中2号、13号、20号、TL6、TMS2、TB2和QEL17个菌株对以上3种病原菌都有一定的拮抗作用．从拮抗辣椒疫病菌的菌株中筛选出20号、22号、TL6、TB1、TB2和EPL8共6株对番茄有较好促生作用，对辣椒采后果实疫病有一定控制效果，且能进入番茄和辣椒体内的菌株．试验结果表明，防病作用最佳的TB2菌株菌液喷雾处理后接种病菌，4～10d防治辣椒采后果实疫病的效果达55．56％～100％；促生作用最佳的TB1菌株可使番茄苗鲜重增长105．84％，干重增长66．25％．经鉴定，6株有抑菌、促生的内生细菌均为芽孢杆菌(Bacillus sp．)，其中EPL8和22号菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(B．subtilis)．表5参8     

尖孢镰刀菌致病相关因子及其分子生物学研究进展

由致病性尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)侵染引起的植物枯萎病是一种世界性的土传真菌病害,对农业生产造成了巨大经济损失.研究表明,尖孢镰刀菌的致病与多种致病因子相关,包括信号传导系统(环腺苷酸单磷酸-蛋白激酶A和促分裂素原活化蛋白激酶信号途径)、细胞壁降解酶(木聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、细胞毒素、纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶等)、克服植物防御响应系统(降解抗真菌化合物和破坏植物细胞壁的化学修饰)以及其它(细胞毒素和过氧化物酶)等.此外对今后的研究工作提出展望.参26     

高原土壤中稻瘟病拮抗细菌的抑菌效果及抗菌机理

利用平板稀释法从西藏7个不同地点的土壤中分离筛选细菌,并通过平板对峙法对所分离菌株的稻瘟病菌抑制效果进行初筛,获得一株拮抗细菌YN01,对其进行生理生化和分子生物学鉴定、最适生长和发酵条件筛选,分泌IAA和铁载体能力检测及稻瘟病菌孢子抑制实验.经形态、生理生化特征和分子生物学鉴定,确定菌株YN01为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus).YN01对稻瘟病菌丝生长的抑制率超过90%,最适生长碳源、氮源分别为蔗糖和酵母粉,在pH值低于6时不能正常生长,最适生长温度为30-35℃;碳源及氮源分别为乳糖和谷氨酸、pH值为8以及培养温度为30-35℃时发酵液抑菌活性最强;YN01能够分泌IAA,浓度达到4.287 mg/L,同时能够产生铁载体,可溶性指数为1.72;与阴性对照相比,菌悬液和发酵液对稻瘟病菌的孢子萌发起到显著的抑制效果.拮抗菌菌体通过与病原菌丝进行营养和空间位点竞争以及产生有抑菌效应的代谢产物,从而导致稻瘟病菌的孢子萌发缓慢,菌丝发育停滞,扰乱其生理活动,达到抑菌目的.综上,拮抗细菌YN01具有较强的抑菌活性,是潜在的植物病原真菌生防菌资源,具有一定的开发与应用价值.     

抑制多重耐药致病菌的丹参内生真菌的筛选、鉴定及次生代谢产物分析

对四川道地药材丹参内生真菌的抑菌活性及其次生代谢产物进行研究,以期寻找出抑制多重耐药致病菌的新型抗菌物质.通过分离纯化丹参茎和叶中的内生真菌,得到145株菌株,将菌株发酵液分别进行普通致病菌(肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌)和多重耐药致病菌(沙门氏菌耐药株、金黄色葡萄球菌耐药株和大肠杆菌耐药株)的抑菌试验,筛选得到3株具有显著抑菌效果的菌株.其中抑菌效果最显著的一株菌株S4,经形态学观察和18S rDNA序列分析确定其为Phomopsis sp.对S4发酵液的乙酸乙酯萃取相进行大类成分、LC-MS和GC-MS分析,结果显示发酵液中富含酚性物质、生物碱、对羟基苯乙醇等重要生物活性物质.本研究表明丹参内生真菌抑菌效果显著,富含活性物质,为耐药菌的控制提供了新的资源.表5图4参20     

天祝高寒草地三线镰孢的分离鉴定及β-tubulin基因序列分析

按30 m的梯度将海拔2 880～3 360 m分为16个采样点,在同一海拔高度按照"Z"字形取样,共取5个点,对16个采样点的土样混匀后以根残体分离法在镰刀菌选择性培养基上进行分离,对分离得到的镰刀菌菌落进行纯化和单孢分离后,以形态学为基础,参照Nelson分类系统进行鉴定.结果表明:在分离到的212个镰刀菌菌株中,有5个菌株为三线镰孢(Fusarium tricinctum).随机选取2株三线镰孢菌株进行β-tubulin基因序列分析,将PCR产物回收测序后在Genbank上比对,菌株TZh-4-3-7和TZh-11-5-2与GenBank上登记的6个新西兰菌株的亲缘关系最近,同源性达96%.利用DNAStar软件绘制其系统发育树状图,结果显示,菌株TZh-4-3-7和TZh-11-5-2与以上6个F.tricinctum菌株均位于系统发育树的同一分支,聚为一类.本研究采用的β-tubulin基因序列分析结果验证了利用形态学鉴定镰刀菌的准确性;将β-tubulin基因序列分析应用于三线镰孢的鉴定中,拓宽了鉴定途径,提高了鉴定的准确性;并了解了三线镰孢在天祝高寒草原不同海拔高度的分布,丰富了我国草原镰刀菌资源库,为进一步探讨镰刀菌与草原退化的关系奠定了基础.     

蚯蚓粪中拮抗微生物分析

实验证明，蚯蚓对有机废弃物进行生物降解的产物一蚯蚓粪，在一定程度上能够控制一些蔬菜类植物苗期土传病害的发生．对此现象的一种解释是蚯蚓粪中含有一些拮抗微生物．从以牛粪为饵料生产的蚯蚓粪中分离出两株拮抗活性强、范围广的拮抗微生物并得到鉴定：0103A球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)和0104A丁香苷链霉菌(Streptomyces syringini),该菌及其发酵液对多种病原菌的抑菌谱及胚根、盆栽生物测定实验表明：两株拮抗菌在蚯蚓粪对蔬菜苗期病害的控制中起重要作用．表8参17     

宁杞1号枸杞健康株与根腐病患病株的土壤微生物群落和功能差异

根腐病严重制约着枸杞产业的发展,而土壤微生物多样性和物种组成的变化与植株根腐病的发生有密切的关系,因此了解宁夏枸杞根腐病发生与根表、根际和根围土壤微生物群落结构的关系十分必要。应用Illumina MiSeq高通量测序技术对枸杞健康株和根腐病患病株的根表、根际及根围土壤中16S rDNA V3+V4区和ITS1片段进行测序,将结果质控后比对相关数据库进行注释和分析。真菌群落中丰度最高的门和属分别是子囊菌门(Ascomycota)和镰刀菌属(Fusarium),细菌群落中优势门依次为放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi),节杆菌属(Arthrobacter)是丰度最高且在根表的丰度显著高于根际和根围土壤,根表、根际和根围3个部位的优势物种组成和占比均不相同。健康株根表的真菌群落丰富度、多样性及均匀度指数均高于患病株(P0.05),而二者的细菌群落α多样性指数无显著差异。功能预测也同样表明健康株和患病株之间的土壤细菌群落功能差异较小,真菌群落中镰刀菌属的功能丰度较高,其在患病株根表和根际的丰度均大于健康株。综上,枸杞健康株和患病株之间,各样品中真菌群落多样性的差异比细菌群落大,二者根表真菌的差异最显著,患病株根表和根际的镰刀菌属的占比和功能丰度最大。该研究分别从土壤真菌和细菌两个角度阐述了宁杞1号枸杞健康株和根腐病患病株的土壤微生物群落和功能的差异,对宁夏枸杞根腐病的认识具有重要意义。     

华重楼内生菌Iun35的分离及其抗菌蛋白的性质

从华重楼(Paris polyphylla Smith var.chinensis)块茎中分离纯化得到一株具有较强抑菌活性的内生细菌Iun35,经形态特征、生理生化特性及16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).将分离得到的Iun35菌株发酵培养,培养液上清经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-75凝胶柱层析和DEAE-32纤维素柱层析分离纯化出一种抗菌蛋白UD35.用该蛋白对多种植物病原菌进行拮抗测定,结果显示,UD35对玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani Kuha)、小麦赤霉病菌[Gibberelle zeae(Schw.)]等多种菌有强烈抑制作用.测定其相对分子质量约为55 000,氨基酸分析结果表明其由17种氨基酸组成.图3表4参16     

海绵体上具有抗肿瘤活性的细菌B2817的分离与鉴定

建立了镰刀菌-细胞毒组合筛选模型,并运用该模型对232株从海绵体上分离出的细菌进行筛选,得到4株抗肿瘤活性较好的细菌.经活性检测,发现菌株B2817的发酵液在稀释100倍时对人肝癌细胞SMMC-7721、人鼻咽癌细胞CNE和小鼠肉瘤细胞S180的抑制率分别为92%、90%和95%,而对正常的人肝细胞的抑制率仅为8%.经多相分类学鉴定,发现B2817是弧菌属中一个种,与弧菌属中的产气弧菌Vibriogazogenes亲缘关系最近,但两者在形态、生理生化特征、分子遗传等方面存在很大差异,故认为B2817可能是弧菌属的一株未被认识的新种.图1表3参9     

链霉菌S227抗耐药性物质的分离及其活性研究

在抗耐药性活性筛选过程中,发现分离自四川峨嵋山森林土壤的一株链霉菌S227(Streptomyces sp.)的发酵液具有抗细菌抗生素耐药性生物活性.利用已建立的抗耐药性的活性检测方法(专利号:ZL01128969.4)[1]为跟踪手段,采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析以及薄层层析等方法,对该菌发酵液中抗耐药性活性物质进行分离纯化,得到了具有抗耐药性的活性单体S227-4,初步鉴定为四聚糖.利用MIC法对该样品的抗耐药活性进行研究:在证明该样品本身不具有抗菌活性的基础上,以临床分离的耐药菌株为指示菌,考察了该样品与抗生素联合使用时对耐药菌抗生素MIC(最小抑菌浓度)值的影响,结果表明,S227-4在不影响耐药菌生长的浓度下与不同的抗生素联合使用,可以明显提高不同耐药菌对不同抗生素的敏感性,如S227-4(200μg/mL)可以使S.aureus12334对红霉素的敏感性提高128倍.图2表2参8     

八种镰刀菌毒素的电子捕获气相色谱分析

通过对各种反应条件的选择,建立了八种主要镰刀菌毒素同时检测的电子捕获气相色谱分析方法(GC-ECD法).在SE-54涂布的弹性石英毛细管交链柱上,八种镰刀菌毒素达到完全分离。T-2毒素,HT-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇、二乙酰蘸草镰刀菌烯醇,玉米赤霉烯酮等的最低检测限为5×10~(-11)g,脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、镰刀菌烯酮-X的最低检测限为3×10~(-12)g.     

生防放线菌剂对魔芋根域微生物区系的影响

为从微生态角度探索接种生防放线菌剂对魔芋根域微生物区系的影响,以生防放线菌娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)、濑里予链霉菌(S.senoensis)和M(肉质链霉菌S.carnosus和密旋链霉菌S.pctum按质量比1:1的固态发酵混合制剂)为接种剂,采用基质拌菌法接种生防菌剂进行盆栽试验,通过稀释平板法测定魔芋根区、根表土壤和根内放线菌、细菌及真菌数量并采用分子生物学技术对优势真菌和细菌进行分类鉴定.结果显示:(1)3种菌剂接种164 d,魔芋根域检出的接入放线菌活菌数量高达106 CFU g-1以上,根表土壤中放线菌数量较对照增加24.6%-263.1%;(2)供试3种菌剂接种164 d后,魔芋根域真菌数量减少18.9%-100.0%,且接种处理魔芋根域有害优势真菌腐皮镰孢菌(Fusarium solani)和红球丛赤壳菌(Nectria haematococca)较未接种对照大幅度降低;(3)不同菌剂接种处理,魔芋根区土壤和根内细菌数量较对照减少21.5%-73.3%,但根内芽孢杆菌(Bacillus sp.)数量增加414.0%-1015.0%.本研究表明供试生防菌具有较稳定的定殖能力,亦能改善魔芋根域土壤微生物区系.     

木霉菌辅助合成纳米银对甜瓜的防病促生作用研究

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)侵染甜瓜引起的枯萎病造成甜瓜减产、品质下降,生产上多采用化学农药防治枯萎病,但频繁使用农药容易造成镰刀菌抗药性增强和对生态环境造成影响,甚至危及人类健康。因此,新型生防制剂的研制是解决甜瓜枯萎病绿色防控的急需措施。纳米银(Silver Nanoparticles,Ag NPs)由于其强杀菌性和不易使病原菌产生抗药性的特点,在农业病虫害防治中越来越受到关注。利用不同木霉菌(T.atroviride、T.crassum、T.longbranchunes、T.spirale、T.virens、T.afroharzianum、T.koningiopsis、T.hamatum、T.citrinoviride和T.velutinum)发酵液与Ag NO_3生物合成Ag NPs,通过Ag NPs(25、50、100、200 mg·L~(-1))对尖孢镰刀菌的抑制作用筛选优势Ag NPs并对其进行表征分析,最后使用不同浓度的优势Ag NPs对甜瓜种子萌发及甜瓜防病进行探究。结果表明,木霉菌合成的Ag NPs对镰刀菌均有抑制作用,其中Ag NPsT.longbranchunes的抑菌作用显著高于其他Ag NPs。UV-Vis显示Ag NPs-T.longbranchunes表面等离子体共振发生在417 nm处有最大吸收峰;XRD证明了Ag NPs-T.longbranchunes高度结晶;FTIR研究证实Ag NPs-T.longbranchunes包含稳定的封闭剂;TEM观察到大多数Ag NPs-T.longbranchunes粒子是分散的,直径大小为5—15 nm。低浓度Ag NPs-T.longbranchunes(25 mg·L~(-1))可促进甜瓜种子萌发及生长,而高浓度(大于25 mg·L~(-1))则有抑制作用。Ag NPs-T.longbranchunes可有效降低甜瓜枯萎病发病率和病情指数。木霉菌生物合成Ag NPs为甜瓜枯萎病的防治提供了新材料,为新型生防制剂的研制奠定了基础。     

九层塔内生细菌系统发育分析及生物学功能

九层塔(Ocimum basilicum L.)为一年生唇形科药食两用植物.为研究野生九层塔植株内生细菌的多样性及生物学功能,采用LB、VM、DN和CCM4种培养基从植物不同部位中分离纯化内生细菌,利用IS-PCR插入序列指纹图谱技术进行聚类分析,通过16S rRNA基因测序分析对内生细菌进行分子鉴定及系统发育分析,进一步采用传统方法鉴定各类群代表菌株的生物学功能,并选取功能性较强的菌株进行水稻种子萌发及盆栽促生试验.结果显示,从九层塔中分离获得48株内生细菌,聚为13个类群,表现出九层塔内生菌的多样性;生物学功能测定显示所获得内生菌功能丰富:9株具有固氮功能,8株具溶磷功能,10株具有解钾能力,12株具有分泌生长素的能力,7株具有分泌铁载体功能;筛选出2个促生功能优良的菌株,分别为H1041和H4039,其发酵液能显著地促进水稻种子萌发和水稻生长.本研究表明从野生植物九层塔中分离所得的内生菌具有种群多样性和功能多样性,这些兼具不同功能的菌株具有农业应用开发的价值和意义.(图6表3参62)     

青海高原土壤拮抗性放线菌的生态分布

采用琼脂块法测定了分离自青海高原不同生态环境下的 1 007株代表性放线菌的拮抗性.结果表明:①供试菌中对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假丝酵母、青霉、辣椒疫霉、西瓜枯萎菌、棉花枯萎菌及黄瓜枯萎菌有拮抗性的放线菌占供试菌总数的比率分别为 9. 1%、27. 2%、2. 1%、2. 6%、13. 8%、10. 1%、7. 1%及 7. 4%;在青海高原(西部)土壤的拮抗性放线菌中,抗细菌放线菌多于抗真菌放线菌,抗G+细菌的放线菌多于抗G-细菌放线菌,抗丝状真菌放线菌多于抗单细胞真菌放线菌.②耕作土壤中,拮抗性放线菌株数占放线菌总株数的百分率 (拮抗菌百分率 )是自然土壤的3. 5倍,且耕作土壤拮抗菌百分率按菜地(71. 7% ) >粮田(40. 6% ) >绿肥地(32. 8% ) >果园(25. 0% )的顺序排列.旱地土壤拮抗菌百分率明显高于水地.③不同类型土壤拮抗菌百分率均不同,且不同类型土壤拮抗菌百分率按黑钙土>栗钙土>灰钙土>砂土的顺序排列.④拮抗性放线菌的数量、拮抗菌百分率与土壤有机质、全氮、碱解氮、全磷及磷酸酶活性有关.其中有机质和全氮与拮抗性放线菌株数和拮抗菌百分率的相关性达极显著水平 (P<0. 01).抗细菌与抗真菌拮抗性放线菌的出现频率与土壤有机质、全氮及放线菌总数量的相关性分别达到了极显著(P<0. 01)与显著水平(P<0. 05),且土     

硅酸盐细菌解钾兼拮抗活性菌株的筛选

从紫色土壤中分离筛选出具有解钾拮抗双重活性的硅酸盐细菌CS1和CS29菌株。接菌处理,其水溶性钾分别增加75％和65％,转化率达0．82％和0．72％。两株菌对革兰氏阳性的蜡样芽孢杆菌,金黄色葡萄球菌,藤黄八叠球菌等和革兰氏阴性的大肠杆菌均有较强的抑菌活性。筛选菌株中91．2％具有解钾活性,但拮抗活性菌株只占总数的11．6％,表明二性状之间无相关关系。表4参7     

拮抗放线菌T111菌株鉴定、发酵液理化性质测定及发酵条件优化

为明确放线菌T111在植物病害生物防治中的应用潜力,通过形态观察、生理生化测定结合16S rDNA序列分析确定了其分类地位,采用平板打孔法测定了发酵液的理化性质,并采用单因素试验与正交设计方法筛选出该菌株的优化发酵配方和发酵条件.结果表明,T111与黄色链霉菌Streptomyces flaveus strain NBRC3359(AB184749)序列的同源性最高,初步鉴定为黄色链霉菌(Streptomyces flaveus).该发酵液对黄瓜菌核、黄瓜蔓枯、棉花红腐病菌等有较高的抑制活性;贮存稳定性和热稳定性良好,4℃贮存60 d,抑菌活性为对照的88.3%,80℃处理60 min抑菌活性为对照的90.9%;对pH值较敏感,在pH 5～7时活性较高;对紫外线稳定,紫外光照射12 h,其活性基本不受影响.培养基优化组合为:可溶性淀粉20 g,大豆蛋白胨5 g,NaNO3 20 g,FeSO4 0.5 g,去离子水1 000 mL;优化发酵条件为:发酵温度27℃,发酵时间5 d,初始pH 6.0,接种量5%,装液量75 mL/250 mL,摇床转速150 r min-1.图6表2参18     

甘薯块根腐烂真菌的分离和鉴定

从腐烂甘薯块根中分离到4株丝状真菌,分别编号为SP-1、SP-2、SP-3和SP-4,它们都能在甘薯块根片上快速生长.将这4株真菌接种在PDA培养基上,观察其菌落形态和结构特征.提取4株菌的总DNA,利用真菌的18S rDNA通用引物进行扩增、克隆和测序,其18S rDNA序列的长度分别为1 810 bp、1 769 bp、1 768 bp和1 770 bp.将这些序列在GenBank中进行序列比对,获得的同源性较高的序列用于构建系统进化树.根据分子鉴定和形态观察的结果,SP-1菌株是匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)SP-1,SP-2是尖镰孢(Fusarium oxysporum)SP-2,SP-3是康宁肉座菌(Hypocreakoningii)SP-3,SP-4是肉座菌属(Hypocrea),命名为Hypocrea sp.SP-4.