猴金属硫蛋白α域(MT-α cDNA)突变体的构建、表达及工程菌对重金属的吸附

采用PCR技术和同尾酶手段,构建了猴金属硫蛋白(mMT)α域的串连体,并构建了表达MT α串连体的工程菌,获得了表达二聚串连体(MTα2)、三聚串连体(MTα3)、五聚串连体(MTα5)的工程菌.结果表明,工程菌在0.1 mmol·L-1IPTG诱导3h后表达量最高.Cd2 浓度为0.5mmol·L-1时,对照菌pGEX-2T/BL21生长受到严重胁迫,工程菌表现出较强的抗性,MTαn/BL21(n=2、3、5)生长几乎不受到胁迫;Cd2 浓度为1.0 mmol·L-1时,MTα5/BL21表现出较强的耐受能力.Cd2 浓度为0.5 mmol·L-1时,工程菌对镉的富集能力明显高于对照,其中富集能力最强的是MTα3/BL21(76%).与对照pGEX-2T/BL21相比,MT/BL21对锌吸附能力显著提高.而转化有MTα串连体基因的工程菌对锌的吸附能力没有提高,说明工程菌对Cd2 的吸附特异性增强.结构预测显示,MTα、MTα2、MTα,的二级结构中α螺旋依次增加,推测突变蛋白的疏水性增强,三维结构稳定.MTα4、MTα5二级结构中,α螺旋数目减少,尤其是MTa5,其a螺旋几乎完全遭到破坏,疏水性大为降低.对基因工程菌吸附镉的实验表明,MTα3/BL21对镉具有较高的特异性和富集容量.     

嗜根寡养单胞菌DSM 14405~T对高浓度Cr(Ⅵ)的抗性及其还原特性分析

为了寻找植物-微生物联合治理Cr(Ⅵ)污染的合适微生物,分析了一株植物根际促生菌——嗜根寡养单胞菌DSM 14405~T(Stenotrophomonas rhizophila DSM 14405~T)对不同浓度Cr(Ⅵ)的还原能力、Cr(Ⅵ)还原最适培养条件、对连续投加Cr(Ⅵ)的还原能力及高浓度Cr(Ⅵ)处理不同时间的转录组变化.结果表明,嗜根寡养单胞菌DSM 14405~T在24 h内对10、50、200和500 mg·L~(-1) Cr(Ⅵ)的还原率分别为100%、92.4%、26.2%和16.5%,且在30℃、pH=7.5、转速180 r·min~(-1)条件下培养能最经济、高效地还原Cr(Ⅵ).该菌能在64 h内完全还原2次所投加的50 mg·L~(-1)的Cr(Ⅵ),第3次投加后仅能还原55.2%左右.比较转录组学分析可得,200 mg·L~(-1)Cr(Ⅵ)作用下,嗜根寡养单胞菌DSM 14405~T细胞表现出显著的抗性.具体表现为:大幅度上调胞内消除有毒自由基的相关基因、DNA修复相关基因以防止DNA因自由基受损,同时下调细胞组分及蛋白代谢等与细胞抗性相关性低的通路.并且,随着Cr(Ⅵ)的还原和细胞对环境的适应,Cr(Ⅵ)抗性相关基因及通路的调节在长时暴露中明显少于短时暴露.本研究为Cr(Ⅵ)污染的原位植物-微生物联合治理提供了可选菌株和理论依据.     

以梭鱼金属硫蛋白基因表达监测海洋重金属污染

分离了梭鱼金属硫蛋白132个碱基对应44个氨基酸的部分基因序列,以此为基础建立了分析梭鱼金属硫蛋白基因表达的实时定量PCR方法,并用于分析渤海南戴河和大神堂近岸海域野生梭鱼金属硫蛋白基因的表达.结果表明,南戴河野生梭鱼金属硫蛋白基因的表达水平(雄鱼:0.012 ± 0.0064 copies/copy β-actin;雌鱼:0.0099 ± 0.0042 copies/copy β-actin)明显高于大神堂野生梭鱼的表达水平(雄鱼:0.0017± 0.0011 copies/copy β-actin;雌鱼:0.0014 ± 0.00095 copies/copy β-actin).该结果与两地野生梭鱼体内重金属残留水平相一致,提示梭鱼金属硫蛋白基因可作为监测海洋重金属污染的敏感标志物之一.     

金属硫蛋白基因工程菌对Cd的去除研究

研究了金属硫蛋白基因工程菌对温度的耐受性,以及在一定温度条件下对Cd的去除率。通过10～50℃温度范围内的静态实验,表明枣金属硫蛋白基因工程菌的温度耐受范围为10～50℃,在工程菌的OD值能维持在2左右时,表明金属硫蛋白基因工程菌的最佳温度范围为25～45℃。通过陶瓷和活性炭两种填料的动态实验,考察了在不同温度条件下基因工程菌对Cd的富集情况,表明在陶瓷填料中基因工程菌下对Cd的去除率达到98.5%。     

转枣树金属硫蛋白基因拟南芥对镉的耐受性研究

对转枣树金属硫蛋白(MT)基因拟南芥植株与非转基因对照组拟南芥对重金属镉的耐受性进行了研究,为实现用转基因生物法治理环境中重金属污染提供依据。采用水培实验,比较了转基因拟南芥与对照组拟南芥对镉的吸收情况。实验表明:经0.1 mol/L镉处理24 h和48 h时,转枣树MT基因拟南芥根部对镉的吸收量分别为22,323 mg/L,地上部分为513,667 mg/L,明显超过对照组(根部93,107 mg/L;地上部分323,437 mg/L);0.001 mol/L镉浓度处理下,转MT基因拟南芥对镉的富集系数为92.0%,而对照组仅为47.3%;转枣树MT基因拟南芥对镉的转移系数为1.053~3.473,因此转MT基因拟南芥属于镉超富集植物,转枣树MT基因显著地提高了拟南芥对重金属镉的耐受性。     

蚯蚓金属硫蛋白定量PCR检测方法及其分子诊断

根据GenBank中蚯蚓(Eisenia fetida)金属硫蛋白(MT)基因序列设计合成引物,采用RT-PCR扩增出目的基因片段,将目的基因片段插入pEASY-Blunt中制备质粒标准品.通过不同梯度稀释倍数的质粒标准品,建立了目的基因MT与内参基因β-actin的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法.通过土壤染毒培养实验,将蚯蚓分别暴露于50,500,1000mg/kg 重金属Cd染毒的自然土壤中培养14,28d,研究蚯蚓体内MT mRNA转录水平的表达变化.结果表明,重组质粒测序后显示目的片段序列同源性好,证明所设计的MT、β-actin引物能成功用于蚯蚓MT mRNA的检测.两基因构建的荧光定量标准曲线线性关系分别为0.994,0.999,且PCR扩增效率也皆接近于100%.染毒实验发现,Cd可诱导蚯蚓体内MT mRNA的表达,其表达水平与Cd污染暴露呈现出剂量-效应和时间-效应关系,表明蚯蚓MT基因可作为潜在分子标志物,诊断环境中Cd污染及其暴露水平.     

二硫代羧基化小麦秸秆对水中Cr（Ⅵ）的吸附性能及机理

选取小麦秸秆(WS)为原材料，采用化学合成法向WS上引入了二硫代羧基，制备了一种新型重金属吸附剂二硫代羧基化小麦秸秆(DTWS)，考察了DTWS投加量、振荡速率、pH值、吸附温度以及Cr(Ⅵ)初始浓度等对DTWS吸附Cr(Ⅵ)性能的影响，并通过吸附动力学、吸附等温线、吸附热力学、FTIR、SEM-EDS等方法探究了DTWS对Cr(Ⅵ)的吸附机制.结果表明，在振荡速率为200 r·min^-1、吸附温度为30℃时，DTWS对Cr(Ⅵ)初始浓度为25 mg·L^-1、pH值为6.0的含Cr(Ⅵ)水样吸附效果最好，最高去除率可达99.12%.DTWS对Cr(Ⅵ)的吸附更加符合准二级动力学方程和Langmuir模型，且DTWS对Cr(Ⅵ)的整个吸附过程是一个自发的放热过程.DTWS对Cr(Ⅵ)的吸附过程中主要发生了静电吸附、物理吸附以及包括氧化还原反应、配位反应在内的化学吸附，其中小麦秸秆中引入的二硫代羧基发挥了很大的作用.     

含荧光素酶四膜虫B2086-LUC全细胞生物传感器的构建及其对重金属离子的响应

为了获得可用于快速检测环境中重金属污染的全细胞生物传感器,本研究将含有HA标签的萤火虫荧光素酶(LUC)基因重组到含有四膜虫金属硫蛋白MTT1启动子和微管蛋白终止子序列的载体pBX中,获得重组质粒pBX-LUC,用基因枪粒子轰击法将pBX-LUC转化入四膜虫细胞中,通过同源重组和巴龙霉素抗性筛选, LUC基因整合到四膜虫大核基因组MTT1 位点,获得含有LUC基因的细胞株B2086-LUC. B2086-LUC对重金属镉和汞的响应敏感,可检测的最低浓度为5~10ng/mL;对铜和锌的响应较弱,可检测的最低浓度为0.5~ 1mg/mL.因此,四膜虫B2086-LUC可作为环境中镉和汞污染快速检测的全细胞生物传感器.     

铬渣的细菌解毒实验研究

采用从铬渣堆埋场附近的污泥中分离到的高效还原Cr(Ⅵ)的Ch-1菌进行细菌浸出的摇瓶实验,分别考察了不同液固比,温度,初始pH值情况下浸出液的pH值变化,Cr(Ⅵ)浓度变化及浸出过程铬渣中六价铬的浸出率变化和最终渣浸出毒性.实验结果表明,在细菌的作用下,浸出液Cr(Ⅵ)浓度均能解毒为0ppm,同时,浸出液pH值降低到8～9之间, 细菌浸出渣毒性降低到0.05ppm以下,远低于GB5085.3-1996危险废物浸出毒性鉴别标准1.5ppm.同时,渣中的Cr(Ⅵ)也大部分被有效浸出后还原为Cr(Ⅲ) 沉淀.特别是在液固比10:1,温度28℃,初始pH＝10.0的条件下,铬渣中六价铬浸出率达到了95.43%,同时浸出液pH值＝8.20,Cr(Ⅵ)浓度为0ppm,浸出渣浸出毒性0.007 ppm,均达到国家排放标准,取得了较好的解毒效果.     

微生物还原Cr(Ⅵ)的机理研究进展

含铬工业废水排放到环境中会对人体的健康和环境带来严重的危害。其中重金属铬的毒性会随着价态的变化而变化。微生物在代谢过程中可以将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ),从而降低Cr(Ⅵ)的毒性。从微生物还原Cr(Ⅵ)的机理类型,相关还原酶的基因特性,可还原Cr(Ⅵ)的微生物,影响还原的因素,Cr(Ⅵ)还原过程中存在的问题及发展前景等方面进行了综述。     

华溪蟹功能性重组金属硫蛋白的表达及抗血清制备

采用SUMO融合表达系统表达河南华溪蟹金属硫蛋白(Metallothionein,MT),经Ni离子螯合柱分离纯化后,用SDS-PAGE、紫外光谱扫描鉴定,并对重组MT的金属结合及清除自由基能力进行了检测.同时,利用纯化的融合蛋白SUMO-MT免疫BALB/c小鼠制备抗血清,间接ELISA检测该抗血清的效价,Western blot和免疫组化染色检测其特异性.结果表明,河南华溪蟹MT以可溶形式获得表达,经金属螯合层析纯化后分析仍具有金属结合特性和清除羟自由基的生物学功能.免疫BALB/c小鼠后获得特异性的抗MT抗血清,该抗血清具有较高的效价和良好的特异性,可识别组织MT,用于免疫组化分析.     

Mn对超富集植物短毛蓼和水蓼生长、Mn吸收及氮素代谢的影响

采用水培的方法,研究了不同浓度Mn(0.0003、0.5、1、2、4、8 mmol · L^-1)对Mn超富集植物短毛蓼(Polygonum pubescens Blume)和水蓼(Polygonum hydropiper L.)叶片铵态氮、硝态氮、游离脯氨酸、可溶性蛋白质含量及氮素代谢关键酶:硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)和谷氨酸脱氢酶(GDH)活性的影响.结果表明,随着Mn处理浓度的增加,短毛蓼和水蓼的根、茎、叶中Mn含量显著增加(p<0.05),在相同Mn处理浓度下短毛蓼中Mn含量均大于同部位水蓼中Mn含量.在Mn处理浓度小于1 mmol · L^-1时,Mn对短毛蓼的株高、株重影响不显著,但对水蓼的影响显著(p<0.05),表明短毛蓼比水蓼更耐Mn污染.Mn处理显著降低了短毛蓼硝态氮含量(p<0.05),提高了可溶性蛋白质含量,浓度为8 mmol · L^-1的Mn处理显著提高了水蓼硝态氮、铵态氮、可溶性蛋白质含量及短毛蓼、水蓼游离脯氨酸含量(p<0.05).Mn引起了短毛蓼和水蓼氮素代谢关键酶活性的变化,显著降低了水蓼叶片NR、短毛蓼叶片GS活性(p<0.05);在Mn处理浓度为1 mmol · L^-1时,短毛蓼叶片NR活性最高,为对照的1.91倍,而2、4、8 mmol · L^-1 Mn处理显著降低了短毛蓼和水蓼GOGAT活性(p<0.05).另外,Mn处理显著提高了短毛蓼和水蓼叶片GDH活性(p<0.05),在Mn处理浓度为8 mmol · L^-1时,短毛蓼、水蓼叶片GDH活性分别为对照的16.29倍和1.29倍.     

Uptake of radioiodide by Paenibacillus sp., Pseudomonas sp., Burkholderia sp. and Rhodococcus sp. isolated from a boreal nutrient-poor bog

Radionuclides, like radioiodine(~(129)I), may escape deep geological nuclear waste repositories and migrate to the surface ecosystems. In surface ecosystems, microorganisms can affect their movement. Iodide uptake of six bacterial strains belonging to the genera Paenibacillus,Pseudomonas, Burkholderia and Rhodococcus isolated from an acidic boreal nutrient-poor bog was tested. The tests were run in four different growth media at three temperatures. All bacterial strains removed iodide from the solution with the highest efficiency shown by one of the Paenibacillus strains with 99% of iodide removed from the solution in one of the used growth media. Pseudomonas, Rhodococcus and one of the two Paenibacillus strains showed highest iodide uptake in 1% yeast extract with maximum values for the distribution coefficient(K_d) ranging from 90 to 270 L/kg DW. The Burkholderia strain showed highest uptake in 1% Tryptone(maximum K_d170 L/kg DW). The Paenibacillus strain V0-1-LW showed exceptionally high uptake in 0.5% peptone + 0.25% yeast extract broth(maximum K_d 1,000,000 L/kg DW). Addition of 0.1% glucose to the 0.5% peptone + 0.25% yeast extract broth reduced iodide uptake at 4℃ and 20℃ and enhanced iodide uptake at 37℃ compared to the uptake without glucose. This indicates that the uptake of glucose and iodide may be competing processes in these bacteria. We estimated that in in situ conditions of the bog,the bacterial uptake of iodide accounts for approximately 0.1%–0.3% of the total sorption of iodide in the surface, subsurface peat, gyttja and clay layers.     

酵母提取物对葡萄糖发酵生产生物破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1的影响

以从石油污染的土壤中筛选出1株生物破乳菌Alcaligenes sp.S-XJ-1为对象,考察了以葡萄糖为碳源时添加酵母提取物对生物破乳菌菌体性质、破乳性能以及菌体元素组成的影响.结果表明,酵母提取物的投加能够有效提高生物破乳菌产量,在酵母提取物浓度为5 g.L-1时,生物破乳菌产量达到3.0 g.L-1,此时葡萄糖利用率亦达到最大的58%.随着酵母提取物的投加浓度的增大,培养得到的菌体破乳性能提高,在投加浓度为10 g.L-1时,破乳率达到76%;而培养得到的菌体C/N有所降低,对其菌体表面蛋白进行提取测定发现菌体总蛋白含量升高,这与FTIR分析破乳菌菌体表面蛋白质类物质提高的结论一致.推测该生物破乳菌菌体蛋白含量的提高增强了菌体的破乳性能,菌体蛋白类物质是影响其破乳性能的关键组分之一.     

丛枝菌根对翅荚木生长及吸收累积重金属的影响

针对湖南某铅锌矿区土壤重金属污染严重问题,采用温室盆栽的方法,以该矿区污染土壤为基质,先锋植物翅荚木(Zenia insignis Chun)为宿主植物,研究摩西球囊霉(Glomus mosseae,Gm)和根内球囊霉(G.intraradices,Gi)两种丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal,AM)真菌对翅荚木生长和吸收累积重金属的影响.结果表明,重金属污染条件下,两种AM真菌均能与翅荚木形成良好的共生关系,且AM真菌能够显著促进植物吸收磷,增加植物生物量,同时改变植物重金属吸收及分配.总体来说,AM降低了翅荚木体内Fe、Cu、Zn和Pd浓度,同时增加了Fe、Cu、Zn和Pd累积量.而两种AM真菌对植物体内重金属分配影响并不相同,而且受重金属种类影响,接种Gi降低了植物Fe、Zn和Pb的TF值,而接种Gm对植物Zn和Pb的TF值无影响,两种AM真菌对植物Cu的TF值均无影响,表明Gi具有能够强化翅荚木根系固持Fe、Zn和Pb的能力.本研究表明,AM真菌在翅荚木适应重金属污染中起着重要的积极作用,因而在重金属污染土壤的植物修复中具有极高的潜在应用价值,但在具体应用中需考虑菌种和植物组合及重金属类型等因素.     

鼠李糖脂对铜绿假单胞菌NY3表面特性及其烃降解效率的影响

研究了鼠李糖脂对NY3菌表面特性及其降解烃类物质的影响作用.结果表明,与未加鼠李糖脂相比,原油含量为1000 mg·L-1,鼠李糖脂100 mg·L-1时,生长24和48 h,NY3菌细胞净生长量分别提高8.60和6.68倍,且产酸明显,原油中正二十六烷至正三十三烷降解效率可提高约60%.分别以LB培养基和十六烷为唯一碳源的无机盐培养基生长的NY3菌体(OD400nm=1.68±0.08),与100 mg·L-1的鼠李糖脂作用1.5h,菌体表面疏水性分别增加32%、6%;且以LB培养基生长的NY3菌细胞,在鼠李糖脂和十六烷存在下作用90 min,菌细胞所积聚的正十六烷量比未加鼠李糖脂时增加了1.10 nmol·mg-1干菌,说明鼠李糖脂能加快疏水性有机物的传质速度.红外光谱分析结果表明,与未加鼠李糖脂相比,鼠李糖脂使菌体细胞中疏水性脂肪链的相对含量明显增加.因此,鼠李糖脂能增加菌体的表面疏水性,加快烃类的传质速率,从而促进NY3菌对烃的降解.     

铅锌矿区蜈蚣草内生放线菌的多样性及群落结构

为了认识重金属累积对植物内生菌的影响,采用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术及序列分析对四川汉源铅锌矿区蜈蚣草内生放线菌的多样性进行了研究,并分析了内生放线菌多样性与Pb、Zn、Cu和Cd等主要重金属之间的相互关系.结果表明,蜈蚣草不同部分内生放线菌的群落结构和多样性存在一定的差异,多样性指数在2.79~3.29之间,与其他非重金属污染环境植物内生放线菌的多样性指数相似,说明在重金属污染地区仍然存在较为多样的内生放线菌类群.相关分析表明,蜈蚣草内生放线菌多样性指数与Cu、Cd和Pb的含量之间存在显著负相关.DGGE条带序列系统发育显示,链霉菌(Streptomyces)、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)、小单孢菌(Micromonospora)、Xianggella为蜈蚣草内生放线菌优势类群,拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)、小双孢菌(Microbispora)、马杜拉放线菌(Actinomadura)、弗兰克氏菌(Frankia)以及一些未培养放线菌也在蜈蚣草中存在.研究表明铅锌矿区蜈蚣草内生放线菌存在丰富的多样性,重金属的累积影响了内生放线菌的分布.     

胶质芽孢杆菌对印度芥菜富集土壤Cd及土壤pH的影响

采用根袋法盆栽试验,研究接种活菌量浓度分别为1×1010 cfu·kg-1 (T1)和2×1010 cfu·kg-1(T2)的胶质芽孢杆菌,对印度芥菜富集土壤Cd、土壤有效态Cd含量及土壤pH的影响.结果表明,以不接种菌液作为对照,处理T1、T2地上部分生物富集系数分别为13.58、16.83,与对照相比分别提高42.95％、77.16％;地下部分生物富集系数分别为4.35、4.83,分别比对照提高24.64％、38.40％;土壤的净化率分别是对照的1.73、2.20倍.对照组土壤有效态Cd含量随着时间的延长而降低,根际和非根际土壤分别降低32.93％和45.54％;但T1和T2处理中,根际、非根际土壤有效态Cd含量分别提高15.15％、31.73％和36.54％、45.28％.收获时,处理T1、T2根际土壤pH降低率分别是对照的1.08、1.10倍.不同浓度胶质芽孢杆菌处理下土壤pH与有效态Cd含量均呈显著负线性关系.综上,胶质芽孢杆菌主要是通过改变土壤pH来影响土壤Cd生物有效性,从而促进超富集植物的修复效果.本研究可为微生物辅助植物修复重金属污染土壤提供一定理论依据和实践指导.     

Biodegradation of indole by a newly isolated Cupriavidus sp. SHE

Indole, a typical nitrogen heterocyclic aromatic pollutant, is extensively spread in industrial wastewater. Microbial degradation has been proven to be a feasible approach to remove indole, whereas the microbial resources are fairly limited. A bacterial strain designated as SHE was isolated and found to be an efficient indole degrader. It was identified as Cupriavidus sp. according to 16S rRNA gene analysis. Strain SHE could utilize indole as the sole carbon source and almost completely degrade 100 mg/L of indole within 24 hr. It still harbored relatively high indole degradation capacity within pH 4–9 and temperature 25°C–35°C. Experiments also showed that some heavy metals such as Mn^2 +, Pb^2 + and Co^2 + did not pose severe inhibition on indole degradation. Based on high performance liquid chromatography–mass spectrum analysis, isatin was identified as a minor intermediate during the process of indole biodegradation. A major yellow product with m/z 265.0605 (C₁₅H₈N₂O₃) was generated and accumulated, suggesting a novel indole conversion pathway existed. Genome analysis of strain SHE indicated that there existed a rich set of oxidoreductases, which might be the key reason for the efficient degradation of indole. The robust degradation ability of strain SHE makes it a promising candidate for the treatment of indole containing wastewater.