抗氧化酶基因作为多环麝香污染分子标志物研究

为研究土壤中低剂量合成麝香暴露的分子毒理效应,以蚯蚓超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)基因为供试基因,建立mRNA表达水平的Sybr GreenⅠ荧光定量PCR检测方法;并且采用自然土壤染毒实验,检测了吐纳麝香(AHTN)或佳乐麝香(HHCB)胁迫诱导SOD、CAT mRNA的表达水平变化.序列同源性比较与熔解曲线分析表明设计的引物适合供试基因mRNA的检测.SOD与CAT基因构建的荧光定量标准曲线的线性关系分别为0.997和0.994,且PCR扩增效率均接近于100%,故可实现两基因mRNA表达的相对定量分析.土壤染毒暴露28 d后,丙二醛(MDA)含量水平显著升高,表明自由基诱导的细胞氧化损伤是AHTN或HHCB毒性效应的主要途径方式.SOD、CAT mRNA总体表现为上调表达趋势,且表达量与MDA含量呈显著正相关,表明抗氧化酶基因的诱导表达与氧化应激水平有关联.而且,SOD、CAT mRNA表达水平与AHTN或HHCB浓度存在正相关剂量-效应关系.综上表明,SOD与CAT基因可成为潜在的分子生物标志物,用于表征合成麝香污染暴露水平及其毒理效应.     

多环麝香污染胁迫对蚯蚓特异性蛋白基因表达的影响

为了探讨蚯蚓特异性蛋白基因表达在监测多环麝香低水平长期暴露污染中的应用,选择蚯蚓热休克蛋白(HSP70)、钙网蛋白(CRT)、亲环素A(cyPA)、翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)等代表性蛋白基因作为供试基因.采用自然土壤污染模拟实验,基于mRNA表达分子水平,研究吐纳麝香(AHTN)与佳乐麝香(HHCB)长期(28 d)污染胁迫对以上各特异性蛋白基因响应表达的影响.通过序列同源性比较与荧光定量PCR熔解曲线结果分析,表明设计的引物适合供试基因mRNA表达水平的检测.染毒暴露28 d后,当AHTN染毒浓度小于30μg.g-1或HHCB浓度小于50μg.g-1时,蚯蚓HSP70基因表达水平无显著变化,而AHTN浓度等于或大于30μg.g-1和HHCB浓度等于或大于50μg.g-1时,HSP70基因表达水平呈显著下调趋势;而各AHTN或HHCB浓度处理组中蚯蚓CRT基因显著上调表达;cyPA和TCTP基因表达水平与对照组比较均无呈现显著性差异.研究结果表明,HSP70与CRT等基因的响应表达有望成为表征多环麝香土壤污染暴露水平及生态毒理效应的潜在生物标志物.     

Cu2+诱导不同大小近江牡蛎HSC70基因表达差异及临界诱导浓度研究

采用以β-actin基因为内参基因的实时荧光定量PCR方法,检测了不同大小近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)被100 μg/L Cu2+处理48 h后闭壳肌、鳃、外套膜、消化腺等四种组织器官中HSC70基因mRNA的表达水平.结果显示,大个体的外套膜、鳃和消化腺中HSC70基因mRNA表达量...     

PM2.5暴露导致老年小鼠可逆性心肌肥大

采用10月龄C57BL/6雌性小鼠作为实验模型,将小鼠分为对照和PM_(2.5)染毒组两组.将染毒组小鼠采用3 mg·kg~(-1)PM_(2.5)暴露4周后,分别在最后一次暴露后1 d、1周和2周处死小鼠.采用苏木素-伊红染色(HE)对小鼠心脏组织进行观察;采用荧光定量PCR技术检测心肌肥大相关因子ANP和β-MHC及基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的mRNA水平;并采用Western Blot技术检测TGFβ1和MMP2的蛋白表达水平.结果发现,与对照组相比,经PM_(2.5)暴露4周后,小鼠心肌细胞核质比显著降低,心脏组织中ANP、β-MHC、MMP2和MMP9的mRNA表达水平及TGFβ1和MMP2的蛋白表达水平显著上升.停止暴露恢复1周后,小鼠心肌细胞核质比降低仍有显著差异,TGFβ1和MMP2蛋白表达水平仍显著上升,而各基因mRNA表达水平与对照组相比无显著变化.停止暴露恢复2周后,小鼠心肌细胞核质比、上述基因的mRNA和蛋白表达均无显著性差异.实验表明PM_(2.5)暴露可导致小鼠可逆性心肌肥大,提示PM_(2.5)所造成的心肌肥大损伤效应是可逆的,在暴露停止后机体可以通过自我修复等过程逐渐恢复正常.     

吸入甲醛引起的小鼠肺部GSNO还原酶基因转录上调

为了验证吸入甲醛及气道氧化还原状态变化可在转录水平调控GSNOR表达,研究了甲醛环境暴露和抗氧化剂α-硫辛酸对小鼠肺中GSNOR表达的影响.以昆明系小鼠为实验材料,经吸人甲醛染毒和α-硫辛酸注射后立即脱颈处死,取其肺组织提取总RNA,采用RT-PCR二步法将其中GSNOR及管家基因β-actin扩增后,通过光密度分析染毒前后基因转录水平的变化.实验结果表明,与对照组相比,3.0 mg·m-3浓度的甲醛可使GSNOR基因转录发生显著上调(P＜0.01),而α-硫辛酸的注射可拮抗这种上调作用,表明吸入甲醛可在转录水平诱导GSNOR表达上调,而且这种上调与肺部的氧化还原状态改变有关,这可能是GSNOR在气道表达及其在哮喘发生中的作用基础.     

产毒微囊藻mcyA基因荧光定量PCR方法的建立

针对微囊藻毒素合成酶基因mcyA探索一种适用于自然水样中微囊藻毒素产毒潜能检测的TaqMan实时荧光定量PCR方法.该方法从铜绿微囊藻FACHB-1279中的mcyA基因中扩增出目的基因片段,用TA克隆方法将基因片段插入Allel TA vector (ABP-CETAVEC020)中来制备质粒标准晶.通过不同连续稀释...     

PM2.5对小鼠和H9C2细胞心肌肥大相关因子mRNA表达的影响

用采自太原市4个不同季节的细颗粒物(PM_(2.5))对小鼠心肌细胞H9C2进行染毒后,采用荧光定量PCR技术检测心肌肥大相关因子ANP和TGF-β的mRNA水平.采用浓度分别为0、1、3、10μg·mL~(-1)的冬季PM_(2.5)处理H9C2细胞后,检测心肌肥大相关因子ANP、β-MHC、MMP2和MMP9的mRNA水平.之后分别选取4周龄、4月龄、10月龄C57BL/6雌性小鼠作为实验模型,采用咽后壁滴注的方法用3 mg·kg~(-1) PM_(2.5)暴露4周.采用苏木素-伊红染色(HE)对小鼠心脏组织病理切片进行观察,并检测ANP和β-MHC的mRNA水平.结果发现,与对照组相比,冬季PM_(2.5)诱导H9C2细胞中ANP和TGF-β的mRNA水平升高最为显著;其中,当冬季PM_(2.5)染毒浓度较高时可诱导ANP、β-MHC、MMP2和MMP9的mRNA水平均显著升高.经PM_(2.5)暴露4周后,幼年和老年小鼠心肌细胞核质比显著降低.老年小鼠心脏组织中ANP和β-MHC的mRNA表达水平显著上升.实验表明,冬季PM_(2.5)诱导心肌肥大标志物表达改变的效应要强于其他季节,且有一定的剂量效应关系,而老年小鼠对PM_(2.5)诱导的心肌肥大效应最为敏感.     

以梭鱼金属硫蛋白基因表达监测海洋重金属污染

分离了梭鱼金属硫蛋白132个碱基对应44个氨基酸的部分基因序列,以此为基础建立了分析梭鱼金属硫蛋白基因表达的实时定量PCR方法,并用于分析渤海南戴河和大神堂近岸海域野生梭鱼金属硫蛋白基因的表达.结果表明,南戴河野生梭鱼金属硫蛋白基因的表达水平(雄鱼:0.012 ± 0.0064 copies/copy β-actin;雌鱼:0.0099 ± 0.0042 copies/copy β-actin)明显高于大神堂野生梭鱼的表达水平(雄鱼:0.0017± 0.0011 copies/copy β-actin;雌鱼:0.0014 ± 0.00095 copies/copy β-actin).该结果与两地野生梭鱼体内重金属残留水平相一致,提示梭鱼金属硫蛋白基因可作为监测海洋重金属污染的敏感标志物之一.     

基于代谢组学指标的土壤亚致死剂量汞对蚯蚓的毒性研究

将赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)暴露于亚致死剂量(1.0、5.0、25.0 mg·kg~(-1))汞污染土壤中4周,以蚯蚓个体(致死率、体重增长率)及小分子代谢物(代谢组)为指标研究其对汞的动态毒性响应,并采用最小二乘判别分析(OPLSA-DA)对暴露组及对照组的代谢物进行分类,进而识别潜在的标记物.结果表明,蚯蚓对汞的吸收尚未达到稳态,蚯蚓体内代谢物的响应依赖于暴露剂量及暴露时间.暴露1周时,蚯蚓体重略有增长但不显著;最低暴露剂量(1.0 mg·kg~(-1))导致蚯蚓体内亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、5-氧脯氨酸、2-脱氧肌苷显著低于对照水平,柠檬酸、肌苷酸与腺苷在5.0、25.0 mg·kg~(-1)剂量下显著高于对照水平;暴露4周时,最高暴露剂量(25 mg·kg~(-1))显著抑制了蚯蚓的生长;汞添加组的蚯蚓体内谷氨酸、酪氨酸、马来酸、2-脱氧肌苷水平显著低于对照.上述代谢物对汞的动态变化表明它们可作为潜在生物标记物,用于诊断土壤汞污染.对代谢途径分析发现,1.0～25.0 mg·kg~(-1)汞即可破坏蚯蚓正常氨基酸代谢、三羧酸循环,扰乱能量代谢,对蚯蚓产生氧化损伤.本研究结果表明,相比个体水平的受试终点,代谢组学指标比个体水平指标能更敏感地响应较低剂量汞,是土壤汞污染生态毒性效应诊断的有效指标.另外,本研究结果可为土壤汞污染的风险评估及相关环境标准的修订提供大量基础数据.     

蚯蚓体内过氧化物还原蛋白PRDX基因对土壤PAHs污染胁迫的转录响应

在前期建立的苯并[a]芘(benzo[a]pyrene,BaP)诱导上调表达的蚯蚓cDNA文库中,发现一种过氧化物还原蛋白peroxiredoxin6(PRDX6)基因片段,并提交到GenBank.Blastx比对与基因进化分析结果表明,该序列与已知PRDX6的最高相似率为86%,期望值为4E-30.序列分析表明,该序列具有PRDX6基因含Cys编码的一个特征motif,表明该序列属于PRDX6基因.为进一步验证蚯蚓PRDX6基因对多环芳烃污染的响应情况,使用OECD推荐方法,进行了土壤菲、芘、荧蒽和苯并芘污染对蚯蚓的毒性响应的试验(周期28 d),并采用定量PCR方法,检测了各实验组蚯蚓PRDX6基因的表达差异.结果发现,1.0 mg·kg-1的芘和苯并[a]芘均可显著上调蚯蚓PRDX6基因的表达,表明PRDX6基因可作为土壤污染引起蚯蚓抗氧化应激检测的分子标记.     

来自Bacillus circulans WZ-12的二氯甲烷脱卤酶基因dcmR的克隆和表达

通过PCR方法从Bacillus circulans WZ-12中分离到二氯甲烷脱卤酶基因dcmR,构建具T7强启动子的pET28b(+)-dcmR质粒,电击转化Escherichia.coli BL21(DE3),构建了二氯甲烷生物降解基因工程菌BL21[pET28b(+)-dcmR].重组菌经IPTG诱导后,表达蛋白占总蛋白的32%.表达蛋白的酶活最高可达25.78 U/mL,酶的比活(以蛋白计)为88.86 U/mg.重组菌周质中酶活2.92 U/mL,胞内酶活22.86 U/mL.重组菌产生的酶的活力和比活较原降解菌株高1~2倍.对工程菌的生长特性和降解特性的研究表明,工程菌在LB培养基中的生长特性与原始菌株没有差别,生长至对数期A600 nm值都可达2.4左右.重组菌株dcmR-1在25 h的降解率达90%以上,降解效率比原降解菌株有明显提高.该基因工程菌的构建对二氯甲烷生物降解机制研究以及复合污染环境的生物修复和工程应用具有实际意义.     

水中轮状病毒实时定量PCR外标准品的构建

采用细胞培养和T-A克隆技术,在轮状病毒主要结构蛋白VP7基因序列上设计合成引物,经PCR扩增后将特异性产物连接入pGEM-T-easy载体中,经过酶切鉴定和测序分析获得轮状病毒cDNA标准品.利用常规PCR和实时定量PCR方法对所获得的cDNA标准品进行特异性、稳定性和重复性指标的检验.结果表明,利用此标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系(斜率为-3.353,R2=0.995);实时定量PCR熔解曲线分析表明,温度在81℃±0.5℃的PCR产物是轮状病毒VP7序列上的特异性产物,表明此标准品是轮状病毒特异性的;同时,所制备的标准品在实时定量PCR检测中具有较大的线性范围(9×100～9×1011 copies/μL,每个反应最低可以检测到9个拷贝数的轮状病毒cDNA,表明利用该标准品进行实时定量PCR分析时具有较高的检测灵敏性;此外,该标准品具有较高的稳定性和重复性(3次独立实验CV值在0.2%～0.9%之间),可长期稳定保存.构建的标准品可用作检测水环境中轮状病毒的实时荧光定量PCR的外标准品.     

人金属硫蛋白基因(MT1E)在毕赤酵母中的表达及其铬抗性

金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸的蛋白质,巯基含量丰富,其半胱氨酸上的巯基对重金属离子有极强的结合力,能够结合重金属形成无毒或低毒的络合物,具有重金属解毒的功能.本文根据已公布的人金属硫蛋白基因MT1E序列,用Vector NTI 7.0软件设计合成12条寡聚核苷酸片段,并拼接得到MT1E完整基因.将测序正确的MT1E基因克隆至酵母表达载体pPIC9K,酶切验证后的阳性克隆命名为pPIC9K-MT1E,含有该重组基因的毕赤酵母工程菌命名为GS115/pPIC9K-MT1E.通过酶联免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法检测到GS115/pPIC9K-MT1E工程菌发酵液有金属硫蛋白酶活性,表明人金属硫蛋白MT1E基因能在毕赤酵母GS115菌株中正确分泌表达.铜(Cu)、锌(Zn)、锰(Mn)、铬(Cr)、钴(Co)重金属抗性分析表明,工程菌GS115/pPIC9K-MT1E对Cr(Ⅵ)的抗性较强,有解毒重金属Cr(Ⅵ)的能力.     

降解-示踪质粒的构建及性能评价研究

在生物强化中采用报告基因技术对降解质粒进行标记,可实现对基因工程菌和降解基因的原位监测。通过基因克隆技术,将绿色荧光蛋白基因(gfp)和阿特拉津脱氯水解酶基因(atzA)重组,构建降解-示踪功能质粒,实现对阿特拉津降解质粒的示踪标记,并对转化获得的基因工程菌绿色荧光蛋白表达及阿特拉津降解能力进行评价。结果表明将gfp和atzA基因克隆至质粒载体pUC18所获得的重组质粒,经检测含有atzA基因,具有氨苄青霉素抗性,并可表达绿色荧光蛋白。携带重组质粒的基因工程菌具有阿特拉津降解活性;且在活性污泥中产生绿色荧光现象,可通过原位观察进行监测。     

一种工程菌的高酶活及其固定化细胞对农药的降解

将抗性尖音库蚊五带亚种的执有机磷农药基因—酯酶基因克隆到质粒pRL－439中．经检测,重组质粒中的酯酶基因已得到表达,获得高酶活的工程菌．将工程菌固定化后对两类难降解农药（有机氯、菊酯类）进行降解,结果表明,固定化细胞在1h内对上两类农药可降解90％以上,具有很高的降解效力．     

脱色酶TpmD在大肠杆菌中的高效表达及纯化

用PCR方法从嗜水气单胞菌DN322基因组中扩增出编码三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD的基因,与表达载体pET-22b(+)连接构建成重组质粒pET22-tpmD,转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组工程菌株.结果表明,经IPTG诱导,脱色酶基因可高效表达,粗酶液降解结晶紫、孔雀石绿、碱性品红、灿烂绿的比活力达到569.5,386.9,516.1,273.0U/g.表达产物经Ni-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度达94.05%.对4种染料的比活力分别达到1075.3,1042.8,903.9,484.3U/g,重组质粒稳定存在于工程菌中,便于规模化发酵生产.     

四溴双酚A和镉复合污染对不同生物体的安全阈值

以赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）、斑马鱼（Zebrafish）作为受试生物,进行急性毒性试验,死亡率、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）为效应指标,采用基准剂量（BMD）法推导四溴双酚A （TBBPA）和镉（Cd）单一及联合暴露对不同生物体的安全阈值.结果表明,在本研究的试验剂量范围内,蚯蚓、斑马鱼TBBPA、Cd暴露剂量与死亡率、SOD、CAT活性效应指标存在明显剂量-效应关系.单一暴露下,CAT、SOD活性指标最敏感,蚯蚓和斑马鱼的TBBPA安全阈值分别为0.95,0.44mg/L,Cd安全阈值分别为71.17,0.42mg/L.联合暴露下安全阈值小于单一暴露.蚯蚓、斑马鱼TBBPA安全阈值分别为0.33,0.024mg/L,Cd为6.45,0.176mg/L.