林可霉素菌渣堆肥微生物群落多样性分析

本试验以林可霉素菌渣-猪粪为原料、污泥-猪粪堆肥作对照,研究了林可霉素菌渣堆肥过程中残留林可霉素的降解情况,并基于Illumina Mi Seq高通量测序分析了林可霉素菌渣堆肥过程中微生物菌群的变化.结果表明:通过堆肥处理可以大幅度降解林可霉素菌渣中残留的林可霉素,经过33 d的堆肥处理后,林可霉素的残留量从最初的1 800 mg·kg-1降到483mg·kg-1,降解率高达73%.同时高通量测序结果表明,由于高含量的林可霉素残留,在堆肥初期和高温期林可霉素菌渣堆肥中细菌群落的分布丰度和多样性指数均低于污泥-猪粪堆肥,但真菌群落丰度和多样性均高于污泥-猪粪堆肥.林可霉素菌渣堆肥中细菌主要以Paucisalibacillus、Cerasibacillus、Bacillus、Virgibacillus、Ureibacillus、Paenibacillus、Sinibacillus属为主,而污泥-猪粪堆肥中主要以Truepera、Actinomadura、Pseudosphingobacterium、Pseudomonas、Luteimonas、Ureibacillus属为主,两者堆肥中微生物群落结构存在显著差异.随着堆肥进入腐熟期,林可霉素残留大幅度降解,抗生素对微生物的胁迫减小或解除,林可霉素菌渣-猪粪堆肥和污泥-猪粪堆肥相比,无论是细菌还是真菌,其微生物群落已逐渐趋同.表明堆肥处理可以大幅降解林可霉素残留,增加微生物多样性,有利于实现林可霉素菌渣无害化处理和资源化利用.     

青霉素菌渣堆肥中β-内酰胺酶基因丰度变化

为了解抗生素菌渣堆肥中抗生素残留对抗生素抗性基因(ARGs)环境行为的影响,以青霉素菌渣堆肥为对象,采用实时定量PCR方法分析了8种典型β-内酰胺酶基因,bla_(-TEM)、bla_(-CTX-M-1)、bla_(-CTX-M-9)、bla_(-IMP-1)、bla_(-VIM-2)、bla_(-CMY)、bla_(-OXA-23)、bla_(-NDM-1)在整个堆肥过程中的丰度变化.结果表明,高温堆肥处理大大缩短了青霉素的降解时间;bla-NDM-1在所有样品中均未检出.通过比较β-内酰胺酶基因在不同处理中第1d和30d的绝对数量变化,在处理组中除bla_(-IMP-1)、bla_(-VIM-2)基因绝对数量有所增加外;其他基因都明显减少.从相对丰度看,在堆肥前期,青霉素残留对bla_(-TEM)、bla_(-CTX-M-1)、bla_(-CTX-M-9)、bla_(-CMY)、bla_(-OXA-23)、bla_(-VIM-2)基因有一定诱导富集效应.随着堆肥进程及菌渣堆肥中抗生素浓度的降低,到了堆肥末期,各处理组及对照组bla_(-TEM)、bla_(-CTX-M-1)、bla_(-CTX-M-9)、bla_(-CMY)的相对丰度较堆肥前期显著降低;而处理组中bla_(-IMP-1)、bla_(-VIM-2)的相对丰度较堆肥前期显著增加.     

鸡粪与中药渣共堆肥对抗生素抗性基因的影响

畜禽粪便是抗生素抗性基因(antibiotic resistant genes,ARGs)进入环境的重要途径,为了削减畜禽粪便中的ARGs,在为期46 d的鸡粪与中药渣共堆肥后,对不同阶段ARGs和可移动基因元件(mobile gene elements,MGEs)的丰度通过实时定量PCR进行检测. 100种ARGs中检测到21种,以及2种整合酶基因(int I1和int I2)和3种转座酶基因(tnp A-01、tnp A-02和tnp A-03).结果表明,在堆肥过程中5种MGEs均显著降低,其中tnp A-01和tnp A-02去除效果最好,减少了两个数量级;氨基糖苷类抗性基因aac A/aph D和aad E显著性降低(P 0. 05);β-内酰胺类抗性基因bla OXA1与堆肥天数显著相关(P=0. 016),其去除率为78. 63%;林可酰胺类抗性基因均随堆肥时间显著降低,平均去除率为90. 39%;四环素类抗性基因的去除效果相差较大,tet G降低了99. 77%,tetR仅降低了31. 72%;喹诺酮类抗性基因qnr D去除率最高为99. 89%;磺胺类中sulⅢ的去除率高达99. 88%,而sulⅠ呈增长趋势. ARGs与MGEs相关性表明tnp A-01与ARGs之间具有显著相关性(P 0. 05). ARGs随堆肥时间的变化趋势表明,中药渣与鸡粪共堆肥可显著降低ARGs丰度,从而降低畜禽粪便在农田施用中ARGs扩散的风险.     

武汉城市湖泊抗生素及抗性基因的污染特征研究

为研究武汉城市湖泊抗生素及抗生素抗性基因的污染水平与分布特征,文章采用超高效液相色谱-质谱法和荧光定量PCR法对南湖、沙湖和东湖水体及底泥中12种抗生素、9种ARGs及Ⅰ类整合子intI1进行定性和定量分析。结果表明,湖泊水体及底泥中均以喹诺酮类抗生素污染为主,浓度范围分别为51.43～105.62 ng/L和9.01～12.93 ng/g。10种目标基因中,tetG、tetM、sul1、sul2、qnrD及intI1的检出率均为100%。磺胺类抗性基因sul1的相对丰度最高(2.39×10~(-2)～3.99×10~(-1)),属于优势抗性基因。intI1含量与4种抗性基因含量(tetG、tetM、sul1及qnrD)、ARGs总量之间均存在显著正相关关系(P0.05),说明intI1是ARGs在城市湖泊环境中进行水平基因转移的重要媒介。冗余分析表明四环素类、喹诺酮类抗生素污染和intI1含量是影响湖泊水体、底泥中ARGs丰度及分布的重要因素。     

外环境温度对污泥堆肥过程中抗生素抗性基因的影响

为研究外环境温度对污泥堆肥过程中抗生素抗性基因的影响,选取市政污水处理厂脱水污泥、花生壳和堆肥返混料作为堆肥材料,采用室内静态堆肥加翻堆方式,通过测定30,50,55℃下堆肥过程中堆体理化性质和抗性基因（tetA、tetQ、sul2、sul3）及一类整合子丰度,分析3种外环境温度对污泥堆肥过程中抗生素抗性基因变化的影响。结果表明:50,55℃外环境温度堆肥条件可有效降解污泥堆肥过程中tetA、tetQ、sul2、sul3抗性基因丰度,在堆肥结束时总ARGs降解率达到66%~83%,而30℃外环境堆肥结束时,总ARGs降解率为30%左右。移动遗传元件IntI1的丰度变化与ARGs的丰度变化趋势相似,堆肥结束时50℃和55℃的外环境温度对堆体中IntI1的降解率达到92%以上,高于30℃条件71.9%的降解率,其原因可能是适当高的外环境温度会抑制堆体中部分微生物的生长代谢,减少了IntI1的传播,进而影响ARGs的传播。30℃外环境温度堆肥条件下,堆体在第36天达到腐熟,发芽指数为59.80%;而50℃和55℃堆肥条件下,在第28天即可达到腐熟,发芽指数达到60%,腐熟速度明显高于30℃条件。研究表明,50℃和55℃的外环境温度堆肥条件和30℃相比可以缩短腐熟所需时间,且对tetA、tetQ、sul2、sul3抗性基因及IntI1丰度有很好的降解效果。因此,堆肥时适当提高外环境温度对污泥发酵和其中ARGs有一定的影响,理论上具有一定的可行性。     

长江口近岸地区抗生素抗性基因与微生物群落分布特征

由于抗生素的大量使用,环境中微生物对抗生素的抗性不断增加,抗生素抗性基因(ARGs)问题越来越严重,严重威胁生态安全和人类健康.为研究长江口近岸地区水体和底泥沉积物中的ARGs和微生物群落的分布特征,通过野外调查采集了8个站点的水样和沉积物样本,对2种磺胺类抗性基因(sul1、sul2)、6种四环素类抗性基因(tetM、tetC、tetX、tetA、tetO、tetQ)、1种整合子基因intI1、16S rRNA基因和微生物群落进行检测分析.结果表明,长江口近岸地区10种抗性基因的检出率为100%.其中,整合子基因intI1和水样中多种ARGs呈显著正相关关系.变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)是长江口近岸地区水环境中的优势菌门;Chloroplast为水体中的主要菌属,Chloroplast和Nitrospira为沉积物中的主要菌属.在水体中,硝化螺旋菌门(Nitrospirota)是4种四环素类抗性基因(tetX、tetA、tetO和tetQ)共同的潜在宿主;在沉积物中,Sva0485是sul1和intI1的共同潜在宿主.微生物群落的分布...     

施肥模式对设施土壤抗生素及抗性基因的影响

采集不同施肥模式下设施菜地表层土壤(0～20cm),对83种抗生素和203种抗性基因(ARGs)进行检测.结果表明,各处理组土壤中共检出14种抗生素、129种ARGs亚型和10种可移动遗传元件(MGEs).四环素类(TCs)是土壤中残留的主要抗生素,β-内酰胺类和多重耐药类抗性基因是主要的ARGs,放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和厚壁菌门(Firmicutes)是主要的细菌门.施肥增加了土壤中抗生素残留和ARGs的多样性及丰度,并且提高了土壤细菌群落α多样性.施用常量有机肥组抗生素、ARGs和MGEs相对丰度最大,有机肥减量可有效降低抗生素和ARGs污染程度,稻壳还田对控制抗生素和ARGs污染具有积极作用.设施菜地土壤中抗生素选择压力、细菌群落结构变化和MGEs是影响ARGs分布的驱动因素.     

污泥蚯蚓堆肥对染色体和质粒上耐药基因归趋的影响

染色体和质粒分别介导污泥中的抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes, ARGs)进行垂直和水平转移,使ARGs在亲代或不同菌种之间传播,导致污泥蚯蚓堆肥对ARGs的削减有限.为了解决这个问题,本实验通过研究蚯蚓堆肥过程中染色体与质粒上ARGs和移动遗传元件(Mobilegenetic elements, MGEs)的丰度变化,以无添加蚯蚓为对照,进行20d的蚯蚓堆肥,探究蚯蚓堆肥对污泥中ARGs的垂直和水平转移的影响.结果显示:前10d是污泥蚯蚓堆肥中ARGs转移的高峰期.除了tetM,蚯蚓组其余ARGs丰度在质粒和染色体上均发生了显著的增加(P<0.05).与对照组相比,质粒上的erm F、erm B、tetX、sul1的丰度在蚯蚓组显著增加了1.02倍、1.97倍、2.43倍、0.75倍(P<0.05),而染色体上仅ermB在蚯蚓组显著增加(P<0.05).对于MGEs,质粒上的intI1丰度在蚯蚓组中比对照组显著增加了1.63倍(P<0.05),而染色体上的却截然相反,是对照组大于蚯蚓组.堆肥的后10d,两组染色体和质粒中的...     

好氧-厌氧两相堆肥过程中抗生素耐药基因的变化特征及影响因素研究

针对堆肥处理过程中抗生素耐药基因（antibiotic resistance genes,ARGs）去除效率不高、诱导潜在致病菌传播扩散等环境安全问题,采用好氧-厌氧两相堆肥处理猪粪、秸秆,探讨ARGs丰度及微生物群落的变化特征,并明确影响ARGs相对丰度变化的关键因子.结果表明:与单一好氧相比,好氧-厌氧两相堆肥能更有效地降低部分ARGs及潜在致病菌的相对丰度,其中ermB、tetK的相对丰度分别降低了39.68%、72.19%,假单胞菌属（Pseudomonas）、梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_1）的相对丰度分别降低了96.09%、90.07%.主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）及冗余分析（Redundancy analysis,RDA）得出,微生物群落和环境因子均显著影响ARGs相对丰度的变化（P < 0.05）,贡献率分别为82.0%、71.2%.其中,梭菌属（Clostridium_sense_stricto_1）、黄杆菌属（Flavobacterium）、尿素芽孢杆菌属（Ureibacillus）和海洋杆菌属（Oceanobacillus）是影响ARGs相对丰度变化的主要微生物菌属;温度、电导率、含水率和pH是影响ARGs相对丰度变化的关键环境因子,贡献率分别为22.0%、16.7%、16.2%和15.0%.研究显示:与好氧堆肥相比,好氧-厌氧两相堆肥能更有效地去除ARGs,并抑制潜在致病菌的繁殖扩散,从而减少环境风险;然而部分ARGs和潜在致病菌仍存在增殖现象,因此亟需进一步优化好氧-厌氧两相堆肥工艺.      

头孢菌素发酵菌渣电子束辐照-好氧堆肥无害资源化处理技术研究

采用电子束辐照联合好氧堆肥工艺对头孢菌素发酵菌渣进行无害化处理和资源化利用.堆肥原料为头孢菌素菌渣、鸡粪和秸秆,菌渣未辐照直接进行堆肥的反应器（1号）与菌渣辐照50 kGy后再进行堆肥的反应器（2号）平行运行进行对比.结果表明：2号反应器的堆体温度、温度上升速率以及高于55 ℃天数均大于1号反应器.在30 d堆肥周期中,2号堆体的平均温度比1号堆体高3.3 ℃;1号和2号堆体温度高于55 ℃的天数分别为5 d和7 d.2号堆体的有机质含量和溶解性TOC浓度下降均较快,表明其有机物的利用效率较高.辐照预处理可促进菌渣好氧堆肥腐殖化进程,2号堆体的腐殖化指数比1号堆体高15%~51%.2号堆体中抗生素头孢菌素C的浓度到第10 d即可降至液相色谱无法检出.此外,两个反应器堆肥过程中抗性基因ermB丰度有所减小,sul2丰度升高.堆肥产品中无抗生素残留,有机质指标远高于有机肥料国家标准,其作为优质肥料进行安全再利用需重点关注抗性基因的影响.     

梅花鹿养殖场抗生素抗性基因分布特征

梅花鹿养殖是近年来我国南方地区出现的新兴养殖业.为探究梅花鹿养殖对养殖环境抗生素抗性基因的影响,采用高通量荧光定量PCR研究了抗生素抗性基因在养殖场区对照土壤、梅花鹿新鲜粪便、梅花鹿粪便堆肥产物和施用堆肥菜地土壤中的分布、丰度和多样性.结果表明,抗性基因的绝对丰度梅花鹿粪便堆肥产物梅花鹿新鲜粪便施用堆肥菜地土壤养殖场区对照土壤,抗生素抗性基因在4种环境样品中具有不同分布格局;梅花鹿养殖场环境中抗性基因丰度与可移动基因元件丰度显著相关(P0.05),表明可移动基因元件可能加快了抗性基因的水平转移过程,促进了抗性基因的迁移、传播和富集,加剧了养殖环境抗生素抗性基因污染.     

磺胺抗性消长与堆肥进程的交互特征

基于添加和不添加磺胺药[m(磺胺二甲嘧啶SM2)∶m(磺胺-6-甲氧嘧啶SMM)=1∶1]的好氧堆肥试验,分析堆肥过程中鸡粪理化性质、微生物群落代谢特征、磺胺抗生素以及5种抗性基因变化,探明磺胺抗性消长与堆肥过程的交互特征.结果表明,磺胺药添加抑制了堆肥基础呼吸,延长了堆体达到高温的时间,减缓了养分转化速度,显著影响堆肥中期微生物群落结构特征.鸡粪中SMM和SM2在堆肥14 d内即可完全降解,且SMM降解速率高于SM2.随堆肥进行,sul1和sul2呈先下降后轻微回升的趋势,磺胺药添加对sul1和Int I1丰度无明显提高作用,但可促进sul2扩散.堆肥过程中,tet Q和tet W变化与磺胺抗性基因不同,但磺胺药添加亦增加tet Q和tet W相对丰度.冗余分析结果显示,温度与sul1、sul2和Int I1明显负相关,与tet Q和tet W无明显相关性;5种抗性基因相对丰度均与碳氮比和硝态氮含量负相关,与p H、含水率和铵态氮含量正相关.     

鸡粪模拟堆肥中多重耐药菌、耐药基因和整合酶基因的消减动力学解析

为掌握多重耐药菌、耐药基因和整合酶基因在鸡粪堆肥过程中的消减动力学规律,试验外源添加多重耐药菌,并以其携带的磺胺类耐药基因(sul2)、多肽类耐药基因(mcr-1)、喹诺酮类基因(oqxB)和Ⅰ类整合酶基因(intI1)作为典型污染物,开展模拟堆肥试验. 结果表明:可培养的多重耐药大肠杆菌数量在3 d的高温后得到完全灭活;堆肥10 d后,多重耐药菌总量下降了4～6个数量级. 在高温堆肥过程中耐药基因的绝对丰度随着堆肥过程的进行而逐渐降低,耐药基因aadA、sul2、mcr-1、oqxB的消减率分别为89.39%、97.99%、99.89%、99.81%,intI1基因的消减率高于80%;大多数耐药基因的相对丰度表现出先降低后略微升高的趋势. 基于基因绝对丰度的非线性回归分析表明,“独立”耐药基因(oqxB、mcr-1)的消减速率明显高于与Ⅰ类整合酶基因相连的基因(aadA),多重耐药大肠杆菌16S rRNA基因消减速率为0.128 d?1,半消减期为5.41 d. 堆肥对耐药基因绝对丰度的消减速率高于相对丰度. 研究显示,堆肥可以有效消减鸡粪中多重耐药菌,耐药基因消减规律符合一级动力学方程,与Ⅰ类整合酶基因相连耐药基因消减速率慢于“独立”耐药基因,4种耐药基因的半消减期为1.69~5.81 d.      

鸡粪和猪粪生物发酵过程中抗生素抗性基因的动态变化

畜禽粪便是储存和传播抗生素抗性基因(ARGs)的主要载体.为明确鸡粪和猪粪堆肥过程中ARGs和MGEs相对丰度的变化及影响其消减的关键环境因子,探索减少畜禽粪便堆肥中ARGs含量并降低其污染风险的有效方法,采用实时荧光定量PCR技术和16S rRNA高通量测序技术,测定了鸡粪和猪粪好氧堆肥75 d的过程中,不同阶段10种ARGs和7种可移动遗传元件(MGEs)的丰度变化和细菌群落变化,分析了ARGs和MGEs与细菌群落的相关性和堆体理化性质(温度、含水率、 pH和DOC)变化对ARGs和MGEs丰度的影响.结果表明,猪粪(PM)中ARGs和MGEs丰度显著高于鸡粪(CM).堆肥结束后,两种堆肥中9种ARGs和5种MGEs的相对丰度均显著降低,其中CM中3种ARGs(tetM、tetT和aacA)和4种MGEs(ISEcp1、IS1216、IS613和tnp614)的去除率达到99%; PM中9种ARGs[tetB(P)、tetL、tetM、tetO、tetT、aacA、aadD、aphA3和sat4]及4种MGEs(ISEcp1、IS26、IS1216和tnp614)去除率均达到99%...     

基于宏基因组技术分析MBR膜清洗后污泥中抗性基因

污水处理厂作为抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes,ARGs）的重要储存库,是自然界ARGs的主要来源之一.膜生物反应器（membrane bioreactor,MBR）被认为是一种能够有效去除污水处理厂中ARGs的技术工艺.MBR膜截留的废水中胶体、颗粒物、悬浮物及微生物代谢物中存在着大量的病原菌与抗性基因,而目前关于膜清洗后污泥中抗性基因的分布特征和规律尚不明确.本文采用宏基因组技术对MBR膜清洗后污泥中抗性基因进行了分析.结果显示,膜清洗后污泥中共检测出39门,其中优势菌门为Proteobacteria、Nitrospirae和Actinobacteria,优势菌属为Nitrospira、Pseudomonas和Bradyrhizobium.污泥样品含有的病原菌属占所有菌属的10.54%,其中Pseudomonas属相对丰度最高,占到所有菌属的3.94%.样品中共注释出17类ARGs和16类金属抗性基因（metal resistance genes,MRGs,15类单金属抗性基因和1类多重金属抗性基因）.其中,多药类抗生素抗性基因相对丰度最高,占49.08%.金属抗性基因中多重金属类抗性基因相对丰度最高,占该污泥样品的34.58%,单金属抗性基因中对铜的抗性基因数量最多,占19.99%.该膜清洗后污泥中微生物群落最主要的功能通路为代谢相关,并存在大量与人类疾病相关的代谢通路相关基因,其中涉及细菌耐药和细菌传染疾病的基因数量最多,分别为占人类疾病相关的代谢通路已注释序列的34.50%和16.62%.由此可见,膜清洗后污泥中蕴藏着丰富的ARGs、MRGs以及病原菌属,具有潜在的环境健康风险,需要加强对膜清洗后污泥中ARGs、MRGs以及病原菌的管控.本文为选择合适的技术工艺有效去除膜清洗后污泥中ARGs、MRGs以及病原菌提供指导.     

Effective removal of antibiotic resistance genes and potential links with archaeal communities during vacuum-type composting and positive-pressure composting

As a major reservoir of antibiotics, animal manure contributes a lot to the augmented environmental pressure of antibiotic resistance genes (ARGs). This might be the first study to explore the effects of different ventilation types on the control of ARGs and to identify the relationships between archaeal communities and ARGs during the composting of dairy manure. Several ARGs were quantified via Real-time qPCR and microbial communities including bacteria and archaea were analyzed by High-throughput sequencing during vacuum-type composting (VTC) and positive-pressure composting (PPC). The total detected ARGs and class I integrase gene (intI1) under VTC were significantly lower than that under PPC during each stage of the composting (p < 0.001). The relative abundance of potential human pathogenic bacteria (HPB) which were identified based on sequencing information and correlation analysis decreased by 74.6% and 91.4% at the end of PPC and VTC, respectively. The composition of archaeal communities indicated that methane-producing archaea including Methanobrevibacter, Methanocorpusculum and Methanosphaera were dominant throughout the composting. Redundancy analysis suggested that Methanobrevibacter and Methanocorpusculum were positively correlated with all of the detected ARGs. Network analysis determined that the possible hosts of ARGs were different under VTC and PPC, and provided new sights about potential links between archaea and ARGs. Our results showed better performance of VTC in reducing ARGs and potential HPB and demonstrated that some archaea could also be influential hosts of ARGs, and caution the risks of archaea carrying ARGs.     

长期施用猪粪水稻土抗生素抗性基因污染研究

为了全面研究猪粪有机肥对水稻土抗生素抗性及分布格局的影响,选择295对抗生素抗性基因引物,采用高通量荧光定量PCR对水稻土中的抗生素抗性基因污染情况进行了研究.结果表明,未施用猪粪水稻土检测出66种抗性基因,而施用猪粪水稻土则检测出107种抗生素抗性基因,施用猪粪后水稻土中抗生素抗性基因种类显著增加(P<0.05).相对于未施用猪粪水稻土,施用猪粪水稻土有49种抗生素抗性基因丰度显著增加(P<0.05),其中施用猪粪水稻土中喹诺酮类/氯霉素类抗性基因的mexF的丰度相对于未施用猪粪水稻土增加1791倍.高通量定量结果表明,施用猪粪的水稻土抗生素抗性基因分布格局发生显著变化,高通量定量技术是研究环境抗生素抗性基因的一个非常实用的工具.