微囊藻毒素的提取纯化及制备方法研究

蓝藻水华污染所带来的主要危害是由毒蓝藻向水体中释放多种不同类型的微囊藻毒素(Microcystis,MCs),其中微囊藻毒素MC-LR和MC-RR是我国富营养化水体中最主要的2种藻毒素.为解决对MCs进行深入研究中的MCs纯品缺少问题,迫切需要研究1种有效提取.纯化、制备MCs的方法.以天然水华蓝藻为原料,建立了以甲醇溶液提取、固相萃取和半制备色谱分离为主要步骤的微囊藻毒素提取、纯化和制备的方法.通过优化提取、分离和制备条件,制备了一定量的微囊藻毒素MC-LR和MC-RR高纯度样品.样品经HPLC鉴定分析,纯度可达98%以上.干燥后可得2种微囊藻毒素纯品分别为MC-RR121.1μg,MC-LR62.8μg.     

基于Monte Carlo模拟法对水源水体中微囊藻毒素的健康风险评估

调查水源水体中微囊藻毒素MCs(MC-RR、MC-LR和MC-YR)的污染情况,结合调查情况应用蒙特卡洛法(Monte Carlo)模拟量化人群通过饮水途径摄入微囊藻毒素的风险.在珠江西航道沿线设置5个采样点,在2016年1~6月期间共采集90份水样,根据国标(GB/T 20466-2006)推荐的HPLC方法检测水体中的微囊藻毒素,运用专业风险评估软件@Risk7.0,构建非参数概率评估模型,对通过饮水途径摄入微囊藻毒素(暴露)风险进行概率评估.对随机采集90份水源水体中微囊藻毒素MCs质量浓度检测值进行分布拟合,并运用Chi-Squared、Anderson-Darling、Kolmogorov-Smirnov这3种统计方法进行拟合度检验,根据3种评估拟合结果,确定最佳拟合分布模型.结果表明,在检测的90个水样品中,MC-RR的检出率最高,达到51.11%,质量浓度范围为0.001 7~0.386 3μg·L~(-1);其次为MC-LR和MC-YR,检出率分别是47.78%和21.11%,质量浓度范围分别是0.028 5~0.279 6μg·L~(-1)和0.003 0~0.136 2μg·L~(-1),水源水体中3种微囊藻毒素以MC-RR为主,最大检出质量浓度为0.386 3μg·L~(-1),MC-YR的含量最低.采用软件@Risk7.0分布拟合结果显示,MC-LR质量浓度最适的拟合分布为Ext Value Min模型(0.113 91,0.098 462),MC-RR质量浓度最适的拟合分布为Logistic(0.058 064,0.053 044).健康风险评估表明,MC-LR对人体健康危害的风险高于MC-RR的风险,儿童比成人更易于受到MCs污染的威胁.MC-LR对儿童健康危害的致癌年风险数值大于美国环保署(USEPA)推荐的最大可接受风险水平1×10-4;MC-LR对成人的致癌暴露年风险数值大于国际辐射防护委员会(ICRP)推荐的最大可接受风险水平5×10-5,表明水源水体中的MCs对人体健康存在潜在的危害,有必要加强饮用水源水体的保护与监控,为有效控制水源地水质污染和更好地保障人民健康奠定基础.     

微囊藻毒素HPLC快速检测方法研究

该研究在传统的微囊藻毒素HPLC分析方法的基础上,通过优化选择色谱柱、流动相和流速的方法,建立了一种快速分析微囊藻毒素的HPLC检测体系。采用该检测体系,微囊藻毒素变体MC-RR、MC-LR的保留时间分别为(2.609±0.007)min和(2.959±0.009)min(n=5),MC-LR、MC-RR在0.4~100μg/m L的浓度范围内线性关系良好。与传统的HPLC检测方法相比,微囊藻毒素分析时间被大大缩短,具较好的应用前景。     

农田土壤中微囊藻毒素污染特征及风险评价

蓝藻水华释放的微囊藻毒素(MCs)通过灌溉、堆肥沤田等途径进入农田土壤造成污染.采用固相萃取-高效液相色谱串联质谱方法(HPLC-MS/MS)研究了滇池周边35个代表性农田土壤样品中3种典型微囊藻毒素(MC-LR、MC-RR、MC-YR)的含量、分布特征及风险水平.结果表明,MCs检出率为85.7%,总含量为n.d.~7.8μg/kg,平均含量为1.6 μg/kg,其中MC-RR检出率(82.9%)和含量(n.d.~5.3μg/kg)最高. 3种MCs的健康风险和生态风险均在可接受范围内,健康风险以MC-YR最大,生态风险以MC-LR最大.儿童以口腔暴露MCs为主,成人以皮肤暴露MCs为主,儿童暴露MCs的健康风险高于成人.     

微囊藻毒素的分离、纯化和制备

以天然水华蓝藻为原料,建立了以甲醇溶液提取、固相萃取和半制备色谱分离为主要步骤的微囊藻毒素分离纯化方法.通过优化提取、分离和制备条件,制备了一定量的微囊藻毒素MC-LR和MC-RR高纯度样品,样品经HPLC鉴定分析,纯度可达98%以上,干燥后可得2种微囊藻毒素纯品分别为MC-RR:121.1μg,MC-LR:62.8μg.     

基于太湖微囊藻毒素的叶绿素a阈值研究

以探讨叶绿素a(Chl-a)阈值为主要目的于2013年6~10月间每月在太湖采样,通过固相萃取超高效液相色谱串联质谱法对水体中3种微囊藻毒素(MC-LR、MC-RR、MC-YR)进行检测.利用SPSS软件分析各种形态的微囊藻毒素(MCs)与总氮(TN)、总磷(TP)、Chl-a、高锰酸盐指数等富营养指标的相关性,分析了MC-LR、MCs与Chl-a的关系.结果表明,太湖MCs污染较严重,其浓度的空间分布特征为:梅梁湾>贡湖、西部沿岸区>湖心区>胥湖区、南部湖区,并以MC-LR浓度最高;相关性分析表明MC-LR、MC-RR、MC-YR及MCs均与高锰酸盐指数、TN、TP、Chl-a呈极显著正相关(P<0.01).结合饮用水中MC-LR和MCs的标准限值分析得出,太湖Chl-a的阈值是12.26 mg·m-3,与美国北卡罗莱纳州湖泊的Chl-a标准值比较属于安全阈值,具有一定的科学性.     

活性炭纤维固定化菌对微囊藻毒素MC-LR的去除研究

研究了藻蓝蛋白提取过程中微囊藻毒素MC-LR的释放分布规律,并用活性炭纤维对一株微囊藻毒素降解菌株进行了固定化,考察了不同活性炭纤维预处理方法、活性炭纤维用量、pH值、温度以及MC-LR浓度对固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影响.结果表明,藻蓝蛋白提取过程中MC-LR主要分布在超滤滤液中,占MC-LR总含量的81.2%.固定化藻毒素降解菌去除 MC-LR的效率明显高于非固定化藻毒素降解菌. 藻毒素降解菌用(1+9)盐酸预处理后的活性炭纤维固定化,其去除效果最佳.MC-LR去除的最适条件为:活性炭纤维用量为10g/L,温度为35℃, pH值为8.0.固定化藻毒素降解菌对pH值,温度具有一定的耐受性,能够在pH5~pH9、10℃~35℃范围内有效地去除MC-LR.     

活性炭纤维固定化菌对微囊藻毒素MC-LR的去除研究

研究了藻蓝蛋白提取过程中微囊藻毒素MC-LR的释放分布规律,并用活性炭纤维对一株微囊藻毒素降解菌株进行了固定化,考察了不同活性炭纤维预处理方法、活性炭纤维用量、pH值、温度以及MC-LR浓度对固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的影响.结果表明,藻蓝蛋白提取过程中MC-LR主要分布在超滤滤液中,占MC-LR总含量的81.2%.固定化藻毒素降解菌去除MC-LR的效率明显高于非固定化藻毒素降解菌.藻毒素降解菌用(1+9)盐酸预处理后的活性炭纤维固定化,其去除效果最佳.MC-LR去除的最适条件为:活性炭纤维用量为10g/L,温度为35℃,pH值为8.0.固定化藻毒素降解菌对pH值,温度具有一定的耐受性,能够在pH5~pH9、10℃~35℃范围内有效地去除MC-LR.     

微囊藻毒素-LR多克隆抗体的制备

通过对新西兰大白兔免疫自制的微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MC-LR)完全抗原BSA-MC-LR,获得了质量较好的抗MC-LR的多克隆抗体,间接ELISA表明抗体的效价能达到1.5×10⁵;固定包被抗原OVA-MC-LR,采用间接竞争ELISA测定水体中的微囊藻毒素,标准曲线表明对水样中MC-LR的检测下限为10ng/L,线性区间为30ng/L·3μg/L,能满足对饮用水和地表水中MC-LR的检测要求.     

淀山湖水质富营养化和微囊藻毒素污染水平

研究淀山湖不同季节水体中总磷(TP)、总氮(TN)、pH、水温、透明度(SD)、叶绿素a(Chl-a)含量和优势藻种等富营养化相关指标;在培养条件下,研究不同温度、光照、氮磷浓度对铜绿微囊藻的生长及微囊藻毒素LR(MC-LR)产生的影响;研究藻细胞密度和微囊藻毒素LR浓度的相关关系.结果表明:淀山湖水质已呈富营养化状态,春末和夏季水质和水文条件适合藻类生长.湖水TN和TP年平均值分别达1.93mg/L和0.18mg/L,TN和TP的年超标率达93.5%和92.2%.TP的高峰期比施肥的高峰期延迟出现约一个月,说明沿湖农业对富营养化指标的影响较大.淀山湖常年生长的藻类分别是蓝绿藻、硅藻、隐藻和裸藻等,夏季水华中可见污染指示藻如微囊藻、鱼腥藻和针杆藻等产毒藻.培养条件下,铜绿微囊藻在25℃和3000lx时生长最快,但产毒量却分别在20℃和5000lx时达到最大值;合适其生长和产毒的氮、磷浓度分别为650μmol/L和6.5μmol/L.现场和实验室条件下,均发现磷为藻类生长的限制因子,微囊藻毒素-LR浓度与藻细胞密度或铜绿微囊藻细胞密度之间存在正相关关系,提示可以用藻细胞密度来估算水中毒素的浓度.     

粘土矿物和碳纳米管对微囊藻毒素的吸附

研究了不同粘土矿物和碳纳米管 (CNTs)吸附去除水体中微囊藻毒素 (Microcystins,MCs)的作用 .结果表明 ,在MC RR和LR的初始浓度分别为 2 1 0和 9 5mg·L-1时 ,尽管高岭土和海泡石等粘土矿物对MCs有一定的吸附能力 ,但吸附量分别低于 3 0和 1 6mg·g-1.与测试的不同粘土矿物相比 ,CNTs对MCs的吸附能力较强 ,吸附MC RR和LR量分别达到了 14 8和 6 7mg·g-1,是粘土矿物吸附量的 5倍左右 .进一步研究发现 ,CNTs对MCs的吸附能力随CNTs外径的增加而减少 ,说明CNTs的比表面积是决定吸附MCs量大小的重要因素之一 ,这在如何选择碳纳米管规格用于高效吸附去除水体中MCs方面具有重要意义     

微囊藻毒素的提取和提纯研究

对采自云南滇池水华蓝藻细胞中的微囊藻毒素 (Microcystins,MCs)的提取与提纯方法进行了研究 .结果表明 ,在藻细胞干重浓度为 2 0g·L-1下 ,与不同甲醇浓度提取液相比 ,4 0 %甲醇溶液可以最有效地从藻细胞中提取出MC RR和MC LR .将MCs提取液过Waters固相萃取小柱后 ,用 70 %甲醇溶液洗脱吸附于柱上的MCs ,可以分别获得 7 3%和 3 5 %纯度的MC RR和MC LR .通过观察洗脱液的颜色变化 ,收集蓝绿色和橘黄色后面流出的基本无色的洗脱液 ,可以获得纯度为 2 8 6 %和12 9%的MC RR和MC LR .     

微囊藻毒素降解菌的分子鉴定和特性研究

在成功筛选出1株能够降解微囊藻毒素(Microcystins,MCs)菌株的基础上,利用16S rDNA的PCR扩增和序列分析对其进行了分子鉴定。由BLAST序列比对及进化树分析可将该菌株定属至鞘氨醇单胞菌USTB-01(Sphingopyxissp.USTB-01),这是我国首次筛选出高效降解MCs的鞘氨醇单胞菌。在鞘氨醇单胞菌USTB-01降解MC-RR和MC-LR活性研究方面发现,温度30℃和pH7.0条件下该菌降解MCs的速率最大,日均降解MC-RR和MC-LR分别达到了23.4mg/L和7.9mg/L,在进一步去除水体中的MCs的基础和应用研究方面都具有非常重要的意义。     

大孔吸附树脂分离纯化微囊藻毒素

以5%醋酸为提取剂从滇池有毒蓝藻中提取了微囊藻毒素,经磁力搅拌、离心、过滤后得到MCs粗提液. 此粗提液先后2次通过筛选后的大孔吸附树脂D101,用不同浓度的乙醇-水溶液洗脱后,获得纯度为82.6%、82.1%、62.5%的MC-RR、MC-YR和MC-LR.另外,条件实验结果表明,pH值＝3时,D101对MCs的吸附性能最佳.实验建立了一种安全、高效、低成本的分离纯化MCs的方法.     

太湖微囊藻毒素的时空分布特征

微囊藻毒素对水体危害严重,为了探究太湖中微囊藻毒素的变化规律及其主要环境影响因子,对太湖34个采样点进行了为期1 a(2011年11月—2012年10月)的监测与采样,分析了水体中ρ(MCs)(MCs为微囊藻毒素)〔包括ρ(TMC)(TMC为总藻毒素)、ρ(EMC)(EMC为胞外藻毒素)和ρ(IMC)(IMC为胞内藻毒素)〕,以及ρ(Chla)、蓝藻生物量、ρ(TN)、ρ(TP)、N/P〔ρ(TN)/ρ(TP)〕、pH、温度、透明度、电导率、ρ(DO)等水环境因子的变化特征,讨论了ρ(MCs)与各水环境因子之间的相关性. 结果表明:ρ(MCs)在太湖中呈现一定的规律性,在7—8月蓝藻爆发期,ρ(MCs)低于0.10 μg/L,之后逐渐升高,9月达到最高值(0.28 μg/L). 受地理位置和沉积环境等影响,太湖西北区MCs污染最严重,ρ(MCs)最大值为0.30 μg/L. 相关性分析结果表明,ρ(MCs)与ρ(Chla)、ρ(TN)、ρ(TP)、N/P显著相关,其中,ρ(MCs)与ρ(Chla)呈极显著正相关(P<0.01);ρ(IMC)和ρ(TMC)均与蓝藻生物量呈显著正相关(P<0.05),而ρ(EMC)与蓝藻生物量相关性不显著;ρ(IMC)和ρ(TMC)均与ρ(TN)呈极显著负相关(P<0.01),而ρ(EMC)与ρ(TN)呈显著负相关(P<0.05);ρ(MCs)与ρ(TP)呈显著正相关,而与N/P呈显著负相关(P<0.05).      

降解微囊藻毒素菌种的筛选和活性研究

研究了滇池底泥和表层水体中的微生物菌群降解微囊藻毒素(Microcystins, MCs)的能力差异,发现底泥中的微生物菌群对MCs有更强的生物降解能力.采用从滇池水华蓝藻细胞中提取提纯的微囊藻毒素作为微生物生长的唯一碳源和氮源,先后经过液体和固体培养基培养后,通过挑取单克隆菌落,分别从底泥中筛选出了能够降解MC-RR和LR的5种不同微生物菌种.其中筛选的菌种D降解MCs的能力最强,在3 d内可将初始浓度分别为60.1 mg·L^-1和38.7 mg·L^-1的MC-RR和LR全部降解,日均降解MC-RR和LR的速率分别高达20.0 mg·L^-1和12.9 mg·L^-1.     

鞘氨醇单胞菌USTB-05对微囊藻毒素的生物降解

研究了云南滇池水华蓝藻细胞中微囊藻毒素(MCs)的分析和鞘氨醇单胞菌USTB-05在细胞水平和酶水平下对MC-YR、RR和LR的生物降解.结果表明,云南滇池水华蓝藻细胞中MC-YR、RR和LR的含量分别为0.16, 0.96, 0.47mg/g.在初始浓度分别为19.5mg/L MC-YR、79.5mg/L MC-RR和43.6mg/L MC-LR下,鞘氨醇单胞菌USTB-05在2d内可将上述3种MCs全部降解,鞘氨醇单胞菌USTB-05粗酶液可以以更快的速率对MC-YR、MC-RR和MC-LR进行高效酶催化降解,在10h内可以将初始浓度分别为14.8mg/L MC-YR、28.4mg/L MC-RR和19.5mg/L MC-LR全部降解.同时发现了MC-YR降解过程中的2个中间和1个最终代谢产物.     

筛选菌种酶催化降解微囊藻毒素的特点

从云南滇池底泥中筛选出1株能够高效降解微囊藻毒素(Microcystins,MCs)的纯菌种.该菌无细胞提取液能进行降解MC-RR和MC-LR的酶促反应,并有最终产物的积累.在pH 6～8范围内酶对MC-RR和MC-LR的催化降解活性较高,Cu²⁺、Mn²⁺和Zn²⁺对降解MCs的酶促反应没有明显的促进作用.