杏鲍菇转录组数据SSR位点的生物信息学分析

为了开发杏鲍菇分子标记,利用前期高通量测序技术获得的杏鲍菇转录组数据,采用生物信息学软件Trinity拼接,然后通过MISA软件检索并分析杏鲍菇转录组简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR)位点.共获得45 833条unigene,在其中的3 256条unigene中检测到3 811条符合软件参数的SSR序列,发生频率为8.31%.SSR位点平均长度为15 bp,平均分布频率是1/15.91 kb.在杏鲍菇转录组的SSRs中,单核苷酸与三核苷酸重复基元为主要重复类型,分别占总SSRs的45.24%和35.53%.SSR基元的重复次数为5-24次,其中5次或10次重复是发生频率最高的,SSR重复基元共有85个类型,其中A/T是最常见的重复基元,比例为38.97%,其次为AG/CT,比例为8.24%.对3 811个SSR位点设计出3 644对SSR引物,随机选择20对引物进行PCR扩增,其中9对在3个杏鲍菇品种中表现出多态性.本研究表明杏鲍菇转录组SSR位点多态性丰富,具有较高的应用潜力.     

基于山桐子转录组序列的SSR分子标记开发

为研究山桐子遗传多样性,对山桐子转录组数据进行分析,开发SSR分子标记技术.将山桐子高通量转录组测序获得的84 213条Unigene进行简单重复序列(SSR)位点挖掘和分析,并结合引物验证,初步证明其可行性.通过软件分析,共获得含SSR位点的序列数23 077,出现频率为27.40%,涉及序列数量为29 953条,发生频率为35%.SSR序列中包括1 620种重复基元类型,其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型,SSR位点数分别为9 782(32.67%)、6 921(23.11%)和5 420(18.10%).单核苷酸中A/T类型比例最高,为9 630(32.15%),二核苷酸和三核苷酸中以类型AG/CT(4 679;15.62%)和AAG/CCT(1 220;1.53%)为主.SSR位点重复次数差别较大,主要是3次(4 748;15.70%),其次为6次(3 707;12.25%)和5次(3 475;11.60%).运用多态性分析的方式初步验证SSR位点在不同地区山桐子标记中的可行性.同时,利用Primer 5.0进行引物设计,随机筛选100对引物进行验证,31对引物可以扩增出条带,19对引物扩增出预期大小的条带,8对引物能特异性区分宜宾、资阳、宁强、成都4个不同地区的山桐子.本研究通过分析山桐子高通量转录组序列的SSR信息,筛选出8对引物验证不同地区山桐子的遗传多样性,将有助于山桐子基因挖掘、分子标记育种和资源保护等后续工作的开展.     

基于EST-SSR标记的沙棘品种鉴定及指纹图谱构建

以沙棘(Hippophae rhamnoides)优良品种“实优1号”为材料,对其叶片进行转录组测序,利用微卫星识别软件(microsatellite identification tool, MISA)和Primer 3(version 2.3.4)对获得的序列进行简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)位点挖掘和引物设计,以收集的42份沙棘品种为研究材料,开展聚合酶链式反应(PCR)和毛细管电泳检测,旨在开发一套多态性高、稳定性好和通用性强的表达序列标签微卫星(express sequence tags from simple sequence repeat, EST-SSR)引物,构建沙棘指纹图谱,从而实现沙棘品种的快速准确鉴定,并对沙棘品种间亲缘关系进行分析。“实优1号”转录组测序共获得6 196个SSR位点,其中,重复基元类型为182种,SSR基序长度主要分布在10～21 bp区间,占全部SSR的81.58%,主要SSR重复类型为单核苷酸重复(48.72%)、二核苷酸重复(22.68%)和三核苷酸重复(18.85%)。利用筛选出的28对引物在42...     

大麦EST-SSR分子标记开发及特征分析

大麦是一种古老的栽培作物,也是分子遗传学研究中常用的模式植物,为满足大麦基因作图、遗传多样性、种质资源鉴定和分子辅助育种等研究的需求,拟在NCBI公共数据库基础上,开发基于表达序列标签(EST)的简单序列重复(SSR)分子标记.从NCBI数据库中获得了525 781条大麦EST序列,将这些序列进行聚类和去冗余后共获得61 902个Unigene,随后通过MISA软件搜索Unigene中的SSR位点,并设计引物9 659对,最后通过电子PCR(E–PCR)和普通PCR对引物进行验证.结果显示:(1)61 902个Unigene中含有SSR位点24 648个,其中复合SSR位点5 843个,约占3.42%,单纯SSR位点23 805个,约占96.58%;(2)经E-PCR验证后发现9 659对SSR引物中有1 060对(11%)能够成功扩增出产物;(3)随机选取的11对引物经普通PCR验证发现,这些引物都能在2份野生大麦品种、2份栽培大麦品种及1份小麦、硬粒小麦、荆州黑麦和节节麦中成功扩增.本研究表明日益丰富的EST公共数据库是大麦SSR分子标记的重要来源;利用EST公共数据库、SSR搜索软件,结合E–PCR验证是开发SSR分子标记省时高效的手段.     

基于中华猕猴桃“红阳”转录组序列开发EST-SSR分子标记(英文)

为开发猕猴桃EST-SSR标记,了解28个品种猕猴桃间的遗传多样性和遗传关系,对中华猕猴桃"红阳"的转录组序列进行分析,并根据分析结果设计SSR引物.之后采用CTAB法提取28个品种猕猴桃的DNA作为SSR-PCR的扩增模板,并根据扩增结果进行聚类分析.研究中共得到包含SSR的序列21 848条,其中重复单元为单碱基、双碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的序列分别为1 642、15 965、3 141、248、368和484条,随机选择其中46条序列设计SSR引物.根据初步的PCR扩增,筛选出32对条带较少且明亮的引物分别对28个品种猕猴桃的DNA样本进行扩增,并对引物对应的SSR序列进行定位.结果显示,32对引物对应的序列中有19条能够得到完整的所在基因、染色体以及染色体中具体位置的信息.这些引物中有26对具有多态性,共统计到等位基因120个,每对引物得到1-11个等位基因,平均3.75个.28个猕猴桃品种之间的遗传相似性系数在0.53-0.97之间,在遗传相似系数为0.72的水平上,可将它们分为5大类,分类结果与传统形态学的划分基本一致.本研究揭示的各样本间的遗传关系可为未来猕猴桃的种质改良提供依据.图4表5参33     

玉米两个功能未知转录因子基因的转录后加工

ZmBH、ZmWD是玉米中分别具有转录因子bHLH和WD重复蛋白结构的两个功能未知基因,在不同组织中及各种胁迫诱导条件下,这两个基因均发生不同程度的剪接,产生大小各异的转录本.序列分析发现其剪接方式与经典的mRNA剪接不同,即剪接位点的选择不符合GT-AG或AT-AC规则,而是在剪接位点具有短正向重复序列SDR(Shortdirect repeats).ZmBH的转录后加工导致序列发生移码而提前终止,而ZmWD则缺失了大部分结构域序列,经由这种方式产生的转录后加工产物可影响蛋白编码,因而可能是对这两个基因功能进行调控的一种方式.图6表1参18     

应用Tail-PCR扩增蓝猪耳T-DNA侧翼序列

蓝猪耳是一种重要的具有观赏和科研价值的花卉植物.采用TAIL-PCR成功扩增了转基因蓝猪耳T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增片断长度为200～2 000 bp,大多数片段在400 bp和800 bp左右,其中36%的序列含有植物的同源序列.通过与GenBank数据库比对,确定了部分T-DNA插入位点周边序列编码的可能蛋白,并提交序列7条;另外还对T-DNA转化植物时整合的位点进行了分析,发现断裂位点集中在距右边界15～18 bD和右边界外234 bp处,分别占总扩增片段的47.62%和38.10%.这为利用T-DNA标签进行蓝猪耳基因克隆和功能分析提供了实验技术上的保证.图2表2参24     

浅水体浮萍污水净化系统的除氮途径

以稀释的猪场厌氧污水为供试水样,少根紫萍为供试生物材料,对夏、冬2季浅水体浮萍污水净化系统TN、NH4 -N和NOx--N(NO2--N与NO3--N之和)的去除途径进行了试验研究。结果表明,在夏季气温条件下,TN通过气态氨挥发、浮萍系统吸收/吸附NH4 -N和NOx--N得以去除,3途径去除的N分别占TN去除量的30.5%、15.9%和53.6%;NH4 -N通过气态氨挥发、浮萍系统吸收/吸附和硝化反应得以去除,3途径去除的N分别占NH4 -N总去除量的33.1%、17.3%和49.6%;NOx--N则完全通过浮萍系统吸收/吸附得以去除。在冬季气温条件下,TN通过气态氨挥发和浮萍系统吸收/吸附NH4 -N得以去除,2途径去除的N分别占TN去除量的31.7%和68.3%;NH4 -N通过气态氨挥发、浮萍系统吸收/吸附和硝化反应得以去除,3途径去除的N分别占NH4 -N总去除量的28.9%、69.5%和1.6%;而水体中的NOx--N含量始终保持稳定。     

长江上游地区杂交水稻亲本遗传多样性

利用表型鉴定以及47对均匀分布于水稻12条染色体的SSR标记,对长江上游138个杂交水稻亲本进行检测,并采用遗传相似系数及数学模型分析其群体结构,以了解其遗传多样性信息.结果显示,长江上游杂交水稻亲本的保持系、恢复系以及总体的表型性状遗传变异程度较大,适用于进行遗传多样性分析.利用47对SSR标记共检测到94个等位基因位点,平均每个位点2个;其中有效等位基因数67.05个,占71.33%,Nei氏遗传多样性指数变幅为0-0.51,平均值为0.26.供试材料可分为恢复系类群和保持系类群,与生产上利用的保持系和恢复系高度一致.本研究表明利用SSR标记能详细了解长江上游杂交水稻亲本遗传多样性信息并有效区分恢复系与保持系.     

胡枝子叶片转录组特征分析及其EST-SSR标记开发（英文）

胡枝子(Lespedeza bicolor)系豆科胡枝子属植物,性耐旱,是防风固沙及水土保持的优良植物.报道胡枝子的转录组序列,对其进行注释,并开发一系列EST-SSR标记用于进化研究.主要研究结果如下:(1)采用二代测序技术对胡枝子叶片进行转录组测序,得到120 913 unigenes,其平均长度为608 bp,N50的长度是978 bp.(2)分别在KEGG和KOG等数据库中对unigenes进行注释,总共注释72 613(60.05%)unigenes的功能.(3)筛选识别13 551个潜在的EST-SSR标记;根据重复单位的核苷酸数目以及重复次数的多少,从中选择173个EST-SSR标记进行引物设计.(4)对胡枝子和其他9种近缘种植物进行PCR扩增实验,最后得到56对引物可全部成功扩增出条带并表现出一定的多态性.本研究获得了较高质量的胡枝子转录组数据库,可进一步用于比较和功能基因组研究以及胡枝子及其近缘类群的基因表达研究;开发的EST-SSR标记将提供一个强大的工具,可用于研究遗传多样性和种群结构、构建DNA指纹图谱数据库、生成遗传图谱、预测分子标记辅助育种和保存遗传信息.     

藜麦Hsf家族的进化与多胁迫条件下的转录应答

Hsf转录因子参与调控植物在生物和非生物胁迫下的防御应答机制.基于系统的生物信息学分析方法,对藜麦Hsf家族成员进行序列特征、进化和多种生物和非生物逆境胁迫下的基因表达水平分析.在藜麦基因组中共鉴定得到31个Hsf转录因子,主要分布在7号染色体.系统进化树将藜麦31个Hsf成员划分到A1-A9、B1-B5和C组中;但藜麦Hsf成员在A6、A8、B5亚组中出现了缺失.藜麦Hsf成员的HR-A/B区域蛋白序列比对结果进一步支持了进化树中藜麦Hsf成员的聚类结果.藜麦Hsf成员蛋白序列中保守区域的分布呈现出组别特异性.A组Hsf成员的蛋白序列包括HSF domain、HR-A/B、NLS、NES和CTAD在内的保守区域;B组和C组的Hsf成员则缺失了CTAD.在干旱、高温、盐、低磷胁迫和GCFSV病毒侵染下,31个藜麦Hsf基因的表达模式被阐明;其中大量Hsf基因的表达水平被显著地诱导表达,推测其参与了藜麦在生物和非生物胁迫下的防御应答反应.本研究结果可为藜麦抗逆品种的遗传育种提供大量优良候选Hsf基因.(图6表1参28)     

柚类资源及其近缘种SSR标记的分子评价

采用31对SSR引物对122份柚类种质资源及其近缘种的遗传多样性进行了研究.31对SSR引物可以检测到335个等位基因变异,平均每个位点可检测到9.85个等位基因.每个位点多态性信息指数(PIC)平均值为0.7085.从这些引物中有效地筛选出21对高信息量SSR引物,与31对引物在122份柚类资源间遗传关系达到极显著相关(r=0.99104).柚类资源及其近缘种等位基因平均数(A)、平均杂合位点百分比(P)、SSR表型杂合度(H0)分别为2.8、83.54%、0.524.用UPGMA方法将122份研究材料分成7个组群,110个柚类品种在相似系数0.712时可细分成18个亚组,分类结果有利于今后有目的地利用这些丰富育种材料的遗传背景.图3表2参21     

氨态氮对菲律宾蛤仔毒理机制研究的内参基因筛选

为了准确和系统地分析NH_3-N对菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)毒性的分子机制,并对相关基因的转录组学数据进行验证,利用ge Norm和Normfinder这2种软件,以暴露30 d中不同时间点的鳃组织c DNA为模板,从18S r RNA(18S)、beta-actin(Actin)、beta-tubulin(Tubu)、elongation factor 1-alpha(EF1α)、cyclophilin A(Cy PA)、Ubiquitin(Ub)等6个备选管家基因中,筛选可以稳定表达的内参基因,作为转录组学分析的内参基因。以稀释50倍的鳃组织c DNA模板作为检测模板,ge Norm软件分析获得6对备选内参基因的表达稳定性依次为:EF1αCy PAActinTubuUb18S,较优内参为EF1α和Cy PA;Norm Finder软件分析获得6对备选内参基因的表达稳定性为:EF1αActinTubuCy PAUb18S,最优内参基因为EF1α。为了验证上述筛选结果,分别以EF1α和Cy PA作为内参基因研究unigene1的表达趋势,发现以EF1α为内参基因时,unigene1的q RT-PCR的表达趋势与其转录组表达倍数的变化趋势一致。因此确定NH_3-N暴露菲律宾蛤仔后,鳃组织中表达最为稳定的内参基因为EF1α。     

黄连木居群遗传多样性的SSR标记分析

为系统揭示黄连木天然居群在遗传多样性水平上的差异及遗传分化状况,采用SSR(Simple sequence repeats)分子标记对其8个居群进行遗传多样性分析.在建立良好的反应体系基础上,从已有的阿月浑子SSR引物中筛选出9对适合进行黄连木遗传分析的引物,在8个黄连木居群中共检测到43条等位基因,位点平均等位基因数为4.78,平均多态位点百分率达90.28%.各居群内平均有效等位基因数为2.08,平均期望杂合度(He)为0.472,说明各居群的遗传多样性处于中等水平.按检测到的有效等位基因数(Ne)和期望杂合度(He),各居群的遗传多样性由高至低依次为安康唐县顺平辉县略阳栾川林州涉县.居群间的遗传分化系数(FST)平均为0.319,说明居群内变异是黄连木变异的主要来源,并根据遗传距离将8个居群分为三大类.     

马铃薯X病毒山西分离物外壳蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析

对GenBank公布的马铃薯X病毒的基因组核苷酸序列和外壳蛋白基因的核苷酸序列进行了同源性比对分析.结果表明,马铃薯X病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的同源性要高于基因组全序列的同源性,并且外壳蛋白基因3'端核苷酸序列的同源性又高于5'端.设计一对特异性引物,以马铃薯感病植株的总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到了马铃薯X病毒外壳蛋白基因.该基因含714个核苷酸,编码238个氨基酸.核苷酸序列比对结果表明,该基因与Genbank公布的马铃薯X病毒其他分离物的外壳蛋白基因的同源性为80.2%～97.5%,且3'端的同源性要高于5'端.上述结果预示,RNA干扰抗病毒基因工程中,利用马铃薯X病毒外壳蛋白基因的3'端比用5'端是更好的策略.     

太原市小店污灌区地表水中有机氯农药分布

为了研究太原市小店污灌区地表水中有机氯农药(OCPs)分布,沿污灌区引水渠、退水渠及汇入河流采集地表水15个,采用液液萃取-气相色谱电子捕获检测器(LLE-GC-ECD)方法检测水样OCPs含量.检测结果表明,污灌区地表水中,残留OCPs主要为六六六(HCHs)和滴滴涕(DDTs),分别占总OCPs的94.85%和4.28%;HCHs的平均含量顺序为:退水渠>河流>东干渠;DDTs平均含量的高低顺序为:河流>退水渠>东干渠.最后通过SPSS软件进行统计分析发现HCHs主要分布在两条退水渠,其受灌溉退水、退水渠周边生活污水和工业废水排放的影响.     

耐高氨氮浮萍的筛选及优势品种的生长特性

为寻找有效处理猪场废水等高氨氮废水的浮萍品种,对采集自48个国家和地区的520株浮萍品种在400 mg/L氨氮浓度废水,pH 6.6条件下进行初次筛选,在250 mg/L氨氮浓度下进行复筛,并对筛选所得品种的游离氨耐受性及SOD酶活进行测定.通过初筛获得23株存活浮萍品种,复筛获得XJ3(Landoltia punctata)、D0045(Spirodela polyrhiza)两株优势品种,其在250 mg/L氨氮浓度下蛋白质积累能力分别为2.17 g m-2 d-1、2.15 g m-2 d-1,干物质积累速率分别为4.98g m-2 d-1、4.60 g m-2 d-1,氮元素同化效率分别为11.84%、13.11%.实验表明XJ3可耐受游离氨浓度达1.31 mg/L,D0045可耐受最高游离氨浓度大于0.80 mg/L,验证性实验中,浮萍可在pH 4条件下800 mg/L氨氮废水中存活.SOD酶活性测定显示XJ3、D0045在250 mg/L氨氮胁迫环境下,SOD酶活性变化幅度较小,说明其相对于其他品种具有较强的氨氮胁迫耐受性.因此,XJ3、D0045两株优势浮萍植株可实现高氨氮废水中氮元素的有效转化,对于净化高氨氮废水具有较大潜力.     

水稻锌指蛋白基因OsWIP6的克隆、表达及RNAi载体转化

为了解水稻C2H2型锌指蛋白转录因子基因的表达调控机理及生物学功能,克隆了水稻的一个C2H2型锌指蛋白转录因子基因(OsWIP6),并构建其RNA干涉植物表达载体,通过农杆菌介导转化获得转基因植株.生物信息学分析显示,OsWIP6氨基酸序列与拟南芥两个WIP家族转录因子高度同源.组织差异性表达分析表明,该基因在水稻花发育上具有表达偏向性.与野生型相比,转基因水稻表现为抽穗延迟,结实率及千粒重降低,半定量分析显示转基因植株OsWIP6表达量明显下降.因此,推断OsWIP6基因与水稻育性密切相关.     

龙眼漆酶家族成员全基因组结构与功能分析

为了解龙眼漆酶(DlLAC)家族的生物学功能,采用生物信息学分析方法进行龙眼基因组LAC基因成员鉴定,蛋白结构域及特性、启动子顺式作用元件、分子进化树分析、体胚发生过程和组织器官特异表达的FPKM分析以及可能互作的mi RNA预测.结果显示:DlLAC家族基因包含42个基因成员,分为7大类;基因家族成员内含子数量1-8个不等,以5个为主,其中DlLAC15-1中存在600 bp短串联重复序列;DlLAC蛋白结构域共存在5种类型,均属于铜蓝蛋白,以3个铜蓝氧化酶结构域为主;DlLAC蛋白均为分泌型蛋白,亚细胞定位预测在胞外,包含2个以上糖基化位点,具有多个保守的motif;5端调控序列预测分析,DlLAC可能具有多个转录起始位点;DlLACp启动子序列均包含大量非生物胁迫应激响应元件、胚乳特异表达元件及MYB结合位点,推测MYB可能通过DlLAC进而调控龙眼胚胎发育.DlLAC9-1p、DlLAC12p、DlLAC17-2p含黄酮类化合物合成调控的MYB结合位点,可能参与龙眼生长发育过程中种子成熟和果皮成色的色素合成途径;DlLAC家族成员可能参与不同体胚发育过程和不同组织器官形态建成.42个龙眼漆酶成员共有28个受miRNA调控,13个成员受miR397调控,可能与木质素合成相关,8个成员受miR1535调控.非miR397调控的成员可能发挥其他重要的生物学功能.本研究表明,DlLAC家族成员在龙眼生长发育过程中除了参与木质素合成以外,还可能参与胚胎发育、胚乳发育、色素合成、组织器官特异表达等重要生物学功能,表现其功能上的多样性.     

长柄石杉不同地理居群叶绿体DNA trnL-trnF序列变异与聚类分析

采用直接测序法,对石杉科广布种长柄石杉(Huperzia serrata var.longipetiolata)21个居群(福建省19个居群和江西省2个居群)共计126株个体的叶绿体DNA trnL-trnF序列进行测序,用Clustal X和MEGA5.0软件进行序列分析,UPGMA法构建聚类图,以期了解序列变异与地理分布的关系,为长柄石杉资源的保护及开发利用提供参考依据.扩增获得的序列全长在928-967 bp之间,经排序后两端切平,序列长925 bp,G+C平均含量为34.05%;21个长柄石杉居群的cpDNA trnL-trnF序列存在20个变异位点,5个信息位点.UPGMA聚类结果显示,福建省居群与江西居群存在较大遗传距离,分聚为不同分支;福建省内19个居群再分聚为3个分支,其中11个居群间的遗传距离为零.研究结果表明长柄石杉居群间存在较明显的遗传分化和一定强度的基因流,居群间的叶绿体DNA trnL-trnF序列变异与地理分布尤其是山脉形成的隔离和屏障有关,较高的遗传多样性和基因流水平有利于长柄石杉种群的生存与进化.