唐鱼卵黄脂磷蛋白的纯化鉴定与免疫原性分析

采用Native-PAGE和SDS-PAGE方法从性成熟雌性唐鱼(Tanichthys albonubes)卵巢组织提纯了卵黄脂磷蛋白(Lv).已确定被纯化的唐鱼Lv在Native-PAGE(4%～7.5%)电泳中分子量(Mr)为314 ×103.用纯化的唐鱼Lv免疫大白鼠获得鼠源多克隆抗血清.以Native-PAGE和SDS-PAGE制备的唐鱼Lv及裂解后的组分作为抗原所制备的抗血清,与经17β-雌二醇(E2)诱导的雄性唐鱼、去除卵巢的雌性唐鱼以及唐鱼卵巢的匀浆液能发生免疫反应,并且印迹位置与雌性特异蛋白卵黄蛋白原(Vtg)的位置相当.但是两种血清和未经E2诱导的雄鱼整体匀浆液并无反应,显示Lv及其大分子亚基的抗血清与Vtg和Lv两种蛋白是特异的.结果表明,唐鱼Lv裂解组分的抗血清可用于检测唐鱼的Vtg.图3参19     

多氯联苯对孔雀鱼卵黄蛋白原的诱导及检测

为探讨利用孔雀鱼(Poecilia reticulata)卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)作为生物标志物检测环境雌激素的可行性,采用浸浴法分别使用17β-雌二醇(E2)和多氯联苯(PCBs)对雄性孔雀鱼成鱼进行染毒,30d后测定其性腺系数(GSI)和肝指数(LSI),并将鱼体整体匀浆进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及磷、脂和糖蛋白特异染色分析.结果表明,PCBs对雄性孔雀鱼具有雌激素效应,和E2均可以诱导雄性孔雀鱼体内产生Vtg,但诱导组雄鱼GSI及LSI与对照组比较均无显著性差异(p>0.05).Native-PAGE及磷、脂、糖蛋白特异性分析表明,孔雀鱼Vtg是一种富含磷、脂、糖的蛋白,具有VtgⅠ、VtgⅡ和VtgⅢ等3种形式,其分子量分别为642kDa、541kDa和441kDa.雄性孔雀鱼Vtg可作为环境雌激素监测的有效生物标记物.     

弱阴离子交换-超滤两级纯化浓缩真鲷卵黄蛋白原

利用弱阴离子交换色谱,从雌激素17β-雌二醇诱导的真鲷鱼血清中分离纯化出卵黄蛋白原粗组分,以超滤法进一步除去杂质蛋白,并脱盐浓缩,获得纯度较高的卵黄蛋白原(Vtg),两级纯化得到的Vtg经常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)分析,证实真鲷鱼Vtg有三种形式,分子量分别为665kDa,635kDa和355kDa;变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,它们由185kDa左右的蛋白亚基组成.     

2,4'-DDT对斑马鱼生长、繁殖力及卵黄蛋白原的影响

以斑马鱼体内卵黄蛋白原(Vtg)作为雌激素污染物的生物标志物,比较研究了不同浓度2,4'- DDT对成年斑马鱼生长、发育、繁殖以及体内Vtg含量的影响.结果表明,当水环境中ρ(2,4'- DDT)为2和10 μg·L-1时,斑马鱼产卵量和受精率与空白和溶剂对照组相比均显著下降(P＜0.05).当水环境中p(2,4'- DDT)为0.2、2和10μg·L-1时,斑马鱼肝脏指数与空白和溶剂对照组相比显著升高(P＜0.05);10 μg·L-12,4'- DDT处理组雄性斑马鱼体内Vtg含量显著高于空白和溶剂对照组(P＜0.05),而0.2、2和10 μg·L-1 2,4'-DDT处理组雌性斑马鱼体内Vtg含量均显著高于空白和溶剂对照组(P＜0.05),且随暴露浓度的增加而增大.SDS - PAGE检测及免疫印迹分析均显示雄鱼血液内出现Vtg特异条带,表明2,4'- DDT对斑马鱼具有雌激素效应.     

近平滑假丝酵母NAD(H)依赖型次级醇脱氢酶的分离纯化及酶学性质

从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC 203011)中分离得到了NAD(H)依赖型的次级醇脱氢酶.粗酶经乙醇沉淀、Blue Sepharose Fast Flow亲和层析、DEAE Sepharose离子交换层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带,其酶蛋白的亚基分子量(Mr)为37.5×103.该酶还原反应的最适pH为6.0,最适温度为45℃,是一个含Zn2 金属酶.该脱氢酶具有较高的底物的选择性,对2-酮具有较高的还原活力;同时,也能作用于醇类发生氧化反应,对次级醇的氧化活力最高.以β-羟基苯乙酮为底物,用纯化得到的酶催化反应后,还原产物为(R)-苯基乙二醇,因此该酶为(R)-专一性次级醇脱氢酶,是一种生产(R)-苯基乙二醇的有效的生物催化剂.经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中3个肽段的氨基酸序列,通过比对发现该酶与NCBI编号为BAA24528的次级醇脱氢酶具有较高的同源性.图4表3参17     

苯并（a）芘对雄性罗非鱼肝脏Vtg mRNA表达的影响

卵黄蛋白原（Vitellogenin,Vtg）是检测环境雌激素的重要生物标志物,雄性鱼类VtgmRNA是检测环境雌激素的新兴生物标志物。为研究BaP是否具有环境雌激素效应,本试验对罗非鱼Oreochromis niloticus Vtg mRNA进行研究,用总RNA提取试剂盒提取得到雌鱼肝脏总RNA,以转录得到的cDNA为模板,以Primer设计得到的引物,得到422bp的罗非鱼卵黄蛋白原特异性eDNA扩增片段;采用荧光定量PCR法检测10、50Hg-L。的BaP暴露对罗非鱼肝脏Vtg基因表达的影响,结果发现4d、17d时雄性罗非鱼肝脏内VtgmRNA表达量与对照组无差异（P〉0．05）,10d时10、50ug·L-1 2个剂量组VtgmRNA表达量显著高于对照组（P〈0．01）,分别是对照组的113．18倍和121．79倍。结果意味着BaP可能具有环境雌激素效应。     

太阳鱼脑乙酰胆碱酯酶的分离纯化

采用硫酸铵沉淀–普鲁卡因胺亲和柱层析方法,对太阳鱼(Lepomis gibbosus)脑部乙酰胆碱酯酶分离纯化,纯化倍数为234倍,回收率为25.67%,经SDS-PAGE电泳检测,呈现单一的条带,相对分子质量约为68 000,表明其纯度达到电泳纯.     

环境雌激素o,p′-DDT和抗雌激素氟维司群对斑马鱼胚胎的复合效应

为探究雌激素与抗雌激素的复合效应,将斑马鱼(Danio rerio)的胚胎暴露于o,p′-DDT和氟维司群2种典型的环境内分泌干扰物中,考察胚胎孵化率、孵化时间和总畸形率,并用实时荧光定量PCR技术检测Vtg1、Vtg2和ERα等雌激素效应相关基因的mRNA转录水平.结果显示,与单一化合物的暴露相比,o,p′-DDT和...     

2，4’-DDT对斑马鱼生长、繁殖力及卵黄蛋白原的影响

以斑马鱼体内卵黄蛋白原（Vtg）作为雌激素污染物的生物标志物,比较研究了不同浓度2,4。DDT对成年斑马鱼生长、发育、繁殖以及体内Vtg含量的影响。结果表明,当水环境中p（2,4。DDT）为2和10μg·L-1时,斑马鱼产卵量和受精率与空白和溶剂对照组相比均显著下降（P〈0．05）。当水环境中P（2,4。DDT）为0．2、2和10μg·L-1时,斑马鱼肝脏指数与空白和溶剂对照组相比显著升高（P〈0．05）;10μg·L。2,4。DDT处理组雄性斑马鱼体内Vtg含量显著高于空白和溶剂对照组（P〈0．05）,而0．2、2和10μg·L～2,4。DDT处理组雌性斑马鱼体内Vtg含量均显著高于空白和溶剂对照组（P〈0．05）,且随暴露浓度的增加而增大。SDS—PAGE检测及免疫印迹分析均显示雄鱼血液内出现Vtg特异条带,表明2,4。DDT对斑马鱼具有雌激素效应。     

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)胞外产物中蛋白酶的纯化及其性质

对鳗弧菌 (Vibrioanguillarum)胞外产物中蛋白酶的纯化方法及其性质进行了研究 .其中 ,蛋白酶的纯化步骤包括 :(1)硫酸铵沉淀 ;(2 )SephadexG 10 0凝胶过滤 ;(3)DEAE Sepharose色谱分离 ;(4)DEAE Cellulose (DE 32 )色谱分离 .经上述纯化步骤得到两种蛋白酶 ,经SDS PAGE分析 ,Mr分别为 37.4× 10 3 和 33.1× 10 3 .以偶氮酪蛋白 (azocasein)作底物测其水解酶活性 ,结果表明二者差别显著 ,前者明显高于后者 .而且 ,Mr37.4× 10 3 的蛋白酶在pH 7～ 10范围内均显示较高活性 ,在 4 0～ 6 0℃范围内稳定性好 .结果表明该蛋白酶是一种金属蛋白酶 .关于该蛋白酶对牙鲆(Paralichtysolivaceus)的毒性作用尚在研究之中 .图 6表 3参 17     

浑河流域野生鲫鱼卵黄蛋白原基因表达

为揭示浑河流域水环境内分泌干扰物对水生态的潜在风险,利用兼并引物扩增获得鲫鱼卵黄蛋白原(Vtg)和核糖体蛋白L-7(RPL-7)基因部分碱基序列(分别为825和450bp),建立以RPL-7为内参基因、定量鲫鱼Vtg基因表达的实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法,并将该方法用于定量浑河野生鲫鱼肝组织Vtg基因表达分析。结果显示:与上游对照点(S1)相比,7月下游各点(S4～S8)雄鱼、S4和S6点雌鱼肝组织的VtgmRNA表达水平皆显著升高(P<0.05);11月在雄鱼中未检出VtgmRNA的有效表达,雌鱼也仅在S2和S3点的表达水平升高(P<0.05)。研究表明,浑河流域野生鲫鱼尤其是在7月明显受到了环境雌激素类物质的影响。另外,qRT-PCR方法能够灵敏检测出鲫鱼Vtg基因表达的时空差异。     

MiRNA-451 is a potential biomarker for estrogenicity in mouse uterus

The uterotrophic assay has been commonly used to test environmental estrogens in vivo, however, it is often not sensitive enough sometimes. An alternative way is to evaluate estrogenicity through biomarker genes. MicroRNA （miRNA） is a class of regulatory gene, which has been shown to be a good biomarker for many diseases and toxicological effects in recent years, and some evidences showed that estrogen induced response was partially mediated by miRNAs. In this study, two types of microarrays were used to test the 17[3-estradiol （E2） induced miRNA expression profile at different time points in the immature mouse uterus. Statistical analysis showed the aldehyde slide based array had less variation than the amino slide based array, and 11 dysregulated miRNAs were screened out for significant fold change. Real-time PCR was performed to further confirm that 4 out of 7 selected miRNAs, namely miR-451, miR-155, miR-335- 5p, and miR-365, are E2 regulated miRNAs in the uterus. The function of the predicted targets of these miRNAs is involved in cell grow control, which is consistent with the main E2 function in the uterus. MiR-451 had similar strong responses to E2 in the uterus of both immature and overiectomized mice, and could be a potential biomarker for estrogenicity in the uterus.     

基于环境雌激素评估的卵黄蛋白原研究进展

卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)是卵黄蛋白(Vitellins,Vn)的前体.无脊椎动物的Vtg主要在肝胰腺、卵巢或脂肪体合成,脊椎动物主要在肝脏合成.在总结国内外相关研究基础上,对基于环境雌激素评估的Vtg研究进展进行了综述.目前的研究已经证明,Vtg的N末端氨基酸序列在动物进化中既具有高度的保守性,又具有一定的特异性.Vtg作为检测环境雌激素效应的生物标志物之一,在环境雌激素类化合物污染的评价中被广泛采用.Vtg的检测方法包括蛋白直接定量检测和mRNA定量分析,选择检测技术要依据实验设计,对于长时间的暴露实验,可通过检测蛋白来完成,短时间的暴露实验则适合半定量RT-PCR检测VtgmRNA的表达.在Vtg的检测中应考虑动物种属的特异性.     

17β3-雌二醇对西伯利亚鲟幼鱼的雌激素效应

为了研究以及评估在利用17β-雌二醇(estradiol-17β,E2)混饲投喂进行人工诱导西伯利亚鲟(Acipenser baerii)性别逆转过程中,外源雌激素处理对西伯利亚鲟幼鱼的雌激素效应以及激素残留风险.实验选取健康的2月龄西伯利亚鲟840尾,设置E2在饲料中的投喂剂量为1 mg·1kg-1(C组)和10 m...     

Validation of an enzyme linked immunosorbent assay (elisa) for cyprinus carpio l. vitellogenin,as a biomarker of reproductive disorders

Vitellogenin is a female sex-specific protein, and a validated and suitable method for its assay can be applied as a biomarker of reproductive disorders in male and female aquatic animals. Therefore, the present study was designed to validate an ELISA for measuring plasma vitellogenin in wild carp ( Cyprinus carpio L.) living in the Lake of Trasimeno (Umbria, Italy); plasma samples were taken during pre-spawning, spawning, and post-spawning periods; in addition to vitellogenin, in both male and female carps, plasma changes of estradiol-17 g were monitored together with those of estrogen receptor density in the liver. In females, VTG showed high seasonality, reaching the highest levels in March during the pre-spawning period; the VTG levels correlated with those of estradiol-17 g ( E 2 ), and with the changes of gonadosomatic index (GSI), while a non parallel trend was found in the liver estrogen receptor (ER) density. In forty percent of males, VTG was found to be present in the plasma and changes of ER density in the liver were observed. The data here reported suggest that the common carp can be a useful sentinel species for biomonitoring studies of environmental estrogens, and of their effects on its reproductive biology.     

VALIDATION OF AN ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) FOR CYPRINUS CARPIO L. VITELLOGENIN, AS A BIOMARKER OF REPRODUCTIVE DISORDERS

Vitellogenin is a female sex-specific protein, and a validated and suitable method for its assay can be applied as a biomarker of reproductive disorders in male and female aquatic animals. Therefore, the present study was designed to validate an ELISA for measuring plasma vitellogenin in wild carp ( Cyprinus carpio L.) living in the Lake of Trasimeno (Umbria, Italy); plasma samples were taken during pre-spawning, spawning, and post-spawning periods; in addition to vitellogenin, in both male and female carps, plasma changes of estradiol-17 βwere monitored together with those of estrogen receptor density in the liver.

In females, VTG showed high seasonality, reaching the highest levels in March during the pre-spawning period; the VTG levels correlated with those of estradiol-17 β( E 2 ), and with the changes of gonadosomatic index (GSI), while a non parallel trend was found in the liver estrogen receptor (ER) density. In forty percent of males, VTG was found to be present in the plasma and changes of ER density in the liver were observed.

The data here reported suggest that the common carp can be a useful sentinel species for biomonitoring studies of environmental estrogens, and of their effects on its reproductive biology.     

内分泌干扰物莠去津对鲫鱼血清激素的影响

为了研究低剂量条件下,内分泌干扰物莠去津对鲫鱼血清激素的影响,探讨其作用机理和剂量-效应关系,同时筛选出敏感的生物标志物,实验以除草剂莠去津对鲫鱼进行低剂量染毒(染毒浓度0～3mg·L-1),采用放射免疫法测定莠去津长期暴露下(60d)幼年雄性鲫鱼血清中性激素(17β-雌二醇(E2)、睾酮(T))及甲状腺激素(促甲状腺激素(TSH)、三碘甲状腺原氨酸(T3))的浓度,并将测定结果与空白对照及溶剂对照进行比较.结果发现:1)莠去津长期暴露下,各处理组鲫鱼血清E2浓度普遍升高,0.023、0.094、1.500、3.000mg·L-1组与空白对照相比,升高显著(p<0.05);2)各处理组鲫鱼血清T浓度与空白对照相比均无显著性差异(p>0.05);3)莠去津长期暴露下,低浓度莠去津组(0.006、0.023mg·L-1组)鲫鱼血清TSH浓度与空白对照相比差异不显著(p>0.05),而高浓度莠去津组(0.094、1.500、3.000mg·L-1组)则显著降低(p<0.05);4)类似地,莠去津长期暴露下,低浓度莠去津组(0.006、0.023、0.094、0.375、1.500mg·L-1组)鲫鱼血清T3浓度与空白对照相比差异不显著(p>0.05),只有高浓度莠去津组(3.000mg·L-1组)显著升高(p<0.05).实验结果表明,低剂量长期暴露下,莠去津对鲫鱼体内性激素及甲状腺激素具有一定的干扰作用,尤其是对17β-雌二醇影响更为显著,因此,17β-雌二醇可作为评价农药内分泌干扰效应的生物标志物.