有机氯类农药在残留剂量下联合诱导乳腺癌MCF-7细胞增殖的机制研究

有机氯类农药为已确定的环境雌激素,易在体内蓄积产生慢性毒性危害人体健康。选择单一存在时无明显雌激素效应的残留剂量进行联合试验,观察联合作用后雌激素效应的增减。选取乳腺癌MCF-7细胞作为研究对象,对残留剂量下六氯苯(HCB)、β-六六六(β-BHC)和p,p’-滴滴涕(p,p’-DDT)联合后的雌激素效应机制进行了研究。首先,运用MTT法观察3种有机氯类农药残留剂量下单独和联合作用对MCF-7细胞生长的影响;然后,运用流式细胞仪测定有机氯类农药联合对MCF-7细胞周期的影响;之后,采用Western Blot法测定有机氯类农药联合后ERα、ERβ、ERK1/2、p-ERK1/2、Ki67、c-Myc和Cyclin D1蛋白表达的变化。结果显示,β-BHC+p,p’-DDT组、HCB+β-BHC+p,p’-DDT组作用24 h后细胞增殖率为115.0%、120.1%,作用48 h后增殖率为121.2%、126.3%,其他联合组与对照相比未发生明显变化;β-BHC+p,p’-DDT组、HCB+β-BHC+p,p’-DDT组中MCF-7细胞的G1期细胞比例下降,S期细胞比例上升,细胞呈高增殖状态;β-BHC+p,p’-DDT组、HCB+β-BHC+p,p’-DDT组和雌二醇(E2)组作用48 h后,均降低ERα的蛋白表达,升高ERβ的蛋白表达,促进p-ERK1/2、Ki67、Cyclin D1和c-Myc的蛋白表达。研究表明,在单一作用时不具有雌激素效应的残留剂量下,仅β-BHC+p,p’-DDT联合组和HCB+β-BHC+p,p’-DDT联合组具有明显雌激素效应,其效应机制为经雌激素受体途径,激活ERβ蛋白表达,抑制ERα蛋白表达,促进p-ERK1/2、Ki67、c-Myc和Cyclin D1等相关蛋白的表达。     

2,4'-DDT对斑马鱼生长、繁殖力及卵黄蛋白原的影响

以斑马鱼体内卵黄蛋白原(Vtg)作为雌激素污染物的生物标志物,比较研究了不同浓度2,4'- DDT对成年斑马鱼生长、发育、繁殖以及体内Vtg含量的影响.结果表明,当水环境中ρ(2,4'- DDT)为2和10 μg·L-1时,斑马鱼产卵量和受精率与空白和溶剂对照组相比均显著下降(P＜0.05).当水环境中p(2,4'- DDT)为0.2、2和10μg·L-1时,斑马鱼肝脏指数与空白和溶剂对照组相比显著升高(P＜0.05);10 μg·L-12,4'- DDT处理组雄性斑马鱼体内Vtg含量显著高于空白和溶剂对照组(P＜0.05),而0.2、2和10 μg·L-1 2,4'-DDT处理组雌性斑马鱼体内Vtg含量均显著高于空白和溶剂对照组(P＜0.05),且随暴露浓度的增加而增大.SDS - PAGE检测及免疫印迹分析均显示雄鱼血液内出现Vtg特异条带,表明2,4'- DDT对斑马鱼具有雌激素效应.     

DDT及其衍生物对2种单细胞藻的毒性效应

研究4种不同质量浓度的DDT及其衍生物对2种单细胞藻(Nannochloropsis sp. 和Nannochloropsis. Oculata)生长及细胞活力的影响.将单细胞藻接种于f/2培养液中,接种培养10 d后,再添加各种种类及质量浓度的DDT及其衍生物,其后每隔7 d记数一次,培养周期为38 d,观察并记录单细胞藻的生长状况.单细胞藻的定量方法,参照血球计数板计数法.结果表明,Nannochloropsis sp. 具有较明显的抗性及良好的生长特征,其生长受DDT及其衍生物的影响较小,在p. p′-DDD作用组中,培养36 d后细胞数达到最高(23510细胞数·μL-1),空白对照为23290细胞数·μL-1;而DDT及其衍生物对Nannochloropsis. oculata的生长有一定的抑制作用,抑制作用大小依次为p.p′-DDT,p.p′-DDE,o. p′-DDT,p. p′-DDD;其中,p. p′-DDT的最大抑制质量浓度为5 μg· L-1,p. p′-DDE的最大抑制质量浓度为10 μg·L-1,o. p′-DDT最大抑制作用质量浓度为1 μg·L-1,p. p′-DDD的最大抑制质量浓度为10 μg·L-1.细胞活力的测定采用MTT法,检测结果表明,从第10 d起,Nannochloropsis sp. 就呈现出较高的细胞活力水平.其中p. p′-DDT,p. p′-DDD,p. p′-DDE 对其作用所引起的变化较大,在0.13～0.325 OD范围,o. p′-DDT 引起的变化较小,在0.145～0.237 OD范围,这与该藻具有抗逆性强特性相吻合.加入不同质量浓度的DDT及其衍生物后,从10 17 d起,Nannochloropsis. oculata均呈现出呈较低水平的细胞活力,平均在0.072～0.26 OD范围,但从24 d起出现较高的细胞活力,平均在 0.249～0.408 OD水平,其后呈现逐渐下降的趋势.     

基于环境雌激素评估的卵黄蛋白原研究进展

卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)是卵黄蛋白(Vitellins,Vn)的前体.无脊椎动物的Vtg主要在肝胰腺、卵巢或脂肪体合成,脊椎动物主要在肝脏合成.在总结国内外相关研究基础上,对基于环境雌激素评估的Vtg研究进展进行了综述.目前的研究已经证明,Vtg的N末端氨基酸序列在动物进化中既具有高度的保守性,又具有一定的特异性.Vtg作为检测环境雌激素效应的生物标志物之一,在环境雌激素类化合物污染的评价中被广泛采用.Vtg的检测方法包括蛋白直接定量检测和mRNA定量分析,选择检测技术要依据实验设计,对于长时间的暴露实验,可通过检测蛋白来完成,短时间的暴露实验则适合半定量RT-PCR检测VtgmRNA的表达.在Vtg的检测中应考虑动物种属的特异性.     

2，4’-DDT对斑马鱼生长、繁殖力及卵黄蛋白原的影响

以斑马鱼体内卵黄蛋白原（Vtg）作为雌激素污染物的生物标志物,比较研究了不同浓度2,4。DDT对成年斑马鱼生长、发育、繁殖以及体内Vtg含量的影响。结果表明,当水环境中p（2,4。DDT）为2和10μg·L-1时,斑马鱼产卵量和受精率与空白和溶剂对照组相比均显著下降（P〈0．05）。当水环境中P（2,4。DDT）为0．2、2和10μg·L-1时,斑马鱼肝脏指数与空白和溶剂对照组相比显著升高（P〈0．05）;10μg·L。2,4。DDT处理组雄性斑马鱼体内Vtg含量显著高于空白和溶剂对照组（P〈0．05）,而0．2、2和10μg·L～2,4。DDT处理组雌性斑马鱼体内Vtg含量均显著高于空白和溶剂对照组（P〈0．05）,且随暴露浓度的增加而增大。SDS—PAGE检测及免疫印迹分析均显示雄鱼血液内出现Vtg特异条带,表明2,4。DDT对斑马鱼具有雌激素效应。     

超声辅助硫酸亚铁活化过碳酸钠降解4种典型DDTs

采用超声波辅助硫酸亚铁活化过碳酸钠(SPC/Fe~(2+))体系降解水中的4种典型有机氯农药DDTs(包括p,p′-DDD、p,p′-DDE、o,p′-DDT、p,p′-DDT),考察超声波功率、过碳酸钠投加量和硫酸亚铁投加量等实验条件对DDTs降解的影响,采用响应面法设计多因素实验,采用二次多项式和逐步回归法拟合DDTs降解率、毒性削减率与实验条件之间的关系,通过模型优化和验证实验获得最佳降解条件,通过GC/MS检测分析DDTs降解产物并推断其降解途径.结果表明,超声波辅助Fe~(2+)/SPC能够在5 min内高效降解DDTs,当超声波功率为30 W、超声5 min、过碳酸钠和硫酸亚铁投加量分别为3.21 g·L~(-1)和0.64 g·L~(-1)时,DDTs总毒性削减率可达98.2%.DDT首先脱氯生成DDE和DDD,再进一步降解生成DDMU等其他物质.     

苯并（a）芘对雄性罗非鱼肝脏Vtg mRNA表达的影响

卵黄蛋白原（Vitellogenin,Vtg）是检测环境雌激素的重要生物标志物,雄性鱼类VtgmRNA是检测环境雌激素的新兴生物标志物。为研究BaP是否具有环境雌激素效应,本试验对罗非鱼Oreochromis niloticus Vtg mRNA进行研究,用总RNA提取试剂盒提取得到雌鱼肝脏总RNA,以转录得到的cDNA为模板,以Primer设计得到的引物,得到422bp的罗非鱼卵黄蛋白原特异性eDNA扩增片段;采用荧光定量PCR法检测10、50Hg-L。的BaP暴露对罗非鱼肝脏Vtg基因表达的影响,结果发现4d、17d时雄性罗非鱼肝脏内VtgmRNA表达量与对照组无差异（P〉0．05）,10d时10、50ug·L-1 2个剂量组VtgmRNA表达量显著高于对照组（P〈0．01）,分别是对照组的113．18倍和121．79倍。结果意味着BaP可能具有环境雌激素效应。     

多氯联苯对孔雀鱼卵黄蛋白原的诱导及检测

为探讨利用孔雀鱼(Poecilia reticulata)卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)作为生物标志物检测环境雌激素的可行性,采用浸浴法分别使用17β-雌二醇(E2)和多氯联苯(PCBs)对雄性孔雀鱼成鱼进行染毒,30d后测定其性腺系数(GSI)和肝指数(LSI),并将鱼体整体匀浆进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及磷、脂和糖蛋白特异染色分析.结果表明,PCBs对雄性孔雀鱼具有雌激素效应,和E2均可以诱导雄性孔雀鱼体内产生Vtg,但诱导组雄鱼GSI及LSI与对照组比较均无显著性差异(p>0.05).Native-PAGE及磷、脂、糖蛋白特异性分析表明,孔雀鱼Vtg是一种富含磷、脂、糖的蛋白,具有VtgⅠ、VtgⅡ和VtgⅢ等3种形式,其分子量分别为642kDa、541kDa和441kDa.雄性孔雀鱼Vtg可作为环境雌激素监测的有效生物标记物.     

城镇污水处理厂进出水对日本青鱂早期阶段亚慢性毒性效应

采用日本青鳉胚胎及幼鱼暴露评估污水处理厂进出水的综合毒性效应。水样采自广州市3个污水处理厂的进水口和出水口。96 h青鳉幼鱼急性毒性试验表明:6个水样均没有对青鳉幼鱼产生急性毒性效应。14 d胚胎暴露试验结果:3个污水处理厂的进水及1号和3号污水处理厂的出水均引起胚胎死亡,胚胎孵化率均低于70%且均与对照组产生了显著性差异(p0.05)。3个厂的进水和1号、2号厂出水的鱼苗畸形率与对照组也有显著差异(p0.05),其中3号厂进水鱼苗畸形率高达(33.73±8.94)%。而6个水样的胚胎孵化时间均与对照组无显著差异(p0.05),均在9 d左右。7 d鱼苗暴露试验结果:1、2、3号3个水厂进水的鱼苗死亡率分别是(30.16±2.75)%,(24.07±1.60)%,(37.90±4.77)%,与对照组产生明显差异(p0.05)。出水对鱼苗的致死效应明显低于进水,但出水对鱼苗的致死效应相对于对照组仍有显著差异(p0.05)。     

滴滴涕类农药在广东省沿海地区水产品中的残留及人体暴露水平

水产品的摄入是人体暴露于有机氯农药的主要途径之一.实验检测了采自广东省11个沿海城市水产市场的海鲜类水产品(包括6种虾类、2种蟹类和13种贝类共228个样品)中滴滴涕类农药(包括o,p’-DDT、p,p’-DDT、o,p’-DDD、p,p’-DDD、o,p’-DDE和p,p’-DDE)的残留.结果显示,DDTs在虾类、蟹类和贝类体内的平均湿重含量范围分别为0.8￣17.6ng·g-1、5.1￣16.0ng·g-1和0.6￣209.4ng·g-1.不同水产品之间因生活环境和生活习性的不同,导致其DDTs含量存在较大差别.与我国最新的食品残留标准(GB2763-2005)相比,所检测样品DDTs的含量均未超标.但若以美国环境保护局(USEPA)的标准来衡量,则DDTs含量超标的百分率达27.6%.据最近的膳食结构调查显示,广东省沿海地区的居民每天虾、蟹、贝类水产品的平均消费量为26.0g,因而通过海鲜类水产品每天摄入DDTs的量为2.4ng·kgbodyweight-1·day-1,这一结果远远低于我国设定的每日耐受摄入量(PTDI)和联合国粮农组织及世界卫生组织(FAO/WHO)的相关标准.     

城镇污水处理厂进出水对日本青鳉早期阶段亚慢性毒性效应

采用日本青鳉胚胎及幼鱼暴露评估污水处理厂进出水的综合毒性效应。水样采自广州市3个污水处理厂的进水口和出水口。96 h青鳉幼鱼急性毒性试验表明:6个水样均没有对青鳉幼鱼产生急性毒性效应。14 d胚胎暴露试验结果:3个污水处理厂的进水及1号和3号污水处理厂的出水均引起胚胎死亡,胚胎孵化率均低于70%且均与对照组产生了显著性差异(p0.05)。3个厂的进水和1号、2号厂出水的鱼苗畸形率与对照组也有显著差异(p0.05),其中3号厂进水鱼苗畸形率高达(33.73±8.94)%。而6个水样的胚胎孵化时间均与对照组无显著差异(p0.05),均在9 d左右。7 d鱼苗暴露试验结果:1、2、3号3个水厂进水的鱼苗死亡率分别是(30.16±2.75)%,(24.07±1.60)%,(37.90±4.77)%,与对照组产生明显差异(p0.05)。出水对鱼苗的致死效应明显低于进水,但出水对鱼苗的致死效应相对于对照组仍有显著差异(p0.05)。     

唐鱼卵黄蛋白原的诱导、纯化与鉴定

为探讨利用雄性唐鱼(Tanichthys albonubes)卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)作为生物标志物检测环境雌激素的可行性,采用浸浴法用50μg·L-117β-雌二醇(E2)对雄性唐鱼进行染毒,30d后将鱼体整体匀浆进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)以分析Vtg的产生;并采用Mg2+-EDTA选择性沉淀和Q Sepharose阴离子交换层析对Vtg进行分离纯化.结果表明,E2诱导下,雄性唐鱼产生了雌性特异蛋白Vtg,并且可在体内积累;利用Mg2+-EDTA选择性沉淀和Q Sepharose阴离子交换层析的两步纯化方法可分离纯化唐鱼整体匀浆Vtg;经Native-PAGE鉴定,确定唐鱼Vtg的分子量为440kDa.以上结果提示,雄性唐鱼Vtg可以作为环境雌激素监测的有效生物学标记物。     

滴滴涕类农药在广东省鱼类中的残留及人体暴露水平初步评价

检测了采自广东省13个城市水产市场和超市的390个鱼样品中滴滴涕类农药(DDT)及其代谢物(包括o,p’-DDE,p,p’-DDE,o,p’-DDD,p,p’-DDD,o,p’-DDT,p,p’-DDT)的残留浓度.鱼体中DDTs的含量为8.7￣18002ng·g-1(脂肪重)或0.1￣698.9ng·g-1(湿重).不同鱼类之间因生活环境和生活习性的不同,而使其DDTs含量存在较大差别.与我国鱼类食品中DDTs的残留标准相比,仅有2个样品中的DDTs含量水平超过此标准,约占样品总数的0.51%,而超过欧盟水产品标准和美国环境保护局(EPA)标准的样品分别占13.8%和30.5%.广东省居民通过鱼类消费每天DDTs的摄入量为30.8ng·kgbodyweight-1·day-1,仅占FAO/WHO每日允许摄入量的0.3%,但高于其他国家或地区.     

根际土壤中DDTs的残留与转化

通过根垫法研究DDT的五种异构体p,p‘-DDE,o,p’-DDD,p,p‘-DDD,o,p‘-DDT,p,p‘-DDT在小麦根际土壤和非根际土壤中的残留量以及DDT,DDD和DDE之间的转化．结果发现,在40d试验期间内,DDT发生缓慢降解,根际土壤中的降解略快于非根际土壤,且差别主要表现在生成DDD的厌氧过程方面．此外,根际土壤中五种DDT的异构体的可提取残留都高于非根际土壤,说明该农药的锁定过程在根际环境相对较弱．     

土壤中有机氯农药的多残留分析技术

本文建立了超声波提取 ,硅胶SPE柱净化 ,GC μECD检测土壤中α HCH ,β HCH ,γ HCH ,δ HCH ,HCB ,o p′ DDE ,aES,p p′ DDE ,Diel,Endrin ,p p′ DDD ,o p′ DDT ,p p′ DDT含量的方法 .对提取剂、洗脱剂和前处理步骤优化的结果表明 :体积比为 1∶2的丙酮 /石油醚是较好的提取剂和洗脱剂 ,方法加标回收率在 70 %— 1 1 0 %之间 ,检测限为0 0 5— 1ng·g- 1 .     

土壤中两种手性有机氯农药的选择性降解研究

为了更深入的了解和阐释手性有机氯农药在土壤中的转化和环境归趋,采用实验室室内避光培养方法,研究了o,p＇-DDT及o,p＇-DDD 2种手性有机氯农药的外消旋体在水稻土厌氧培养体系和菜园土好氧培养体系中的选择性降解情况。为了更好的利用土壤中土著微生物的活性,我们选择了厌氧微生物比较丰富的水稻土和好氧微生物丰度比较高的菜园土来做培养实验。结果表明实验体系中o,p＇-DDT及o,p＇-DDD在水稻土和菜园土中的降解均没有明显的对映体选择性。这一结果与2种手性化合物不同对映体在自然环境中的含量普遍具有差异性有所不同,说明野外环境条件和室内模拟实验条件的差异会影响手性化合物的降解选择性。在2种体系中,o,p＇-DDT的降解速率均高于o,p＇-DDD的降解速率。这与以前的研究报道一致,DDD比DDT更难降解。通过2个体系的比较,发现DDT的降解速率在厌氧体系中高于好氧体系,而DDD的降解速率与之相反,好氧体系高于厌氧体系。这应该与DDT和DDD 2种化合物的化学结构及2种土壤中微生物群落的差异有关。对于厌氧体系中的2种水稻土,采自中山的水稻土中DDT的降解速率高于江门的水稻土,这应该与中山水稻土有机质含量高于江门的水稻土有关。有机质含量的高低直接反映了土壤中微生物的多少,进而会影响污染物的降解速率。研究发现本实验所用水稻土和菜园土总有机碳含量偏低可能是影响2种化合物的对映体无降解选择性的因素之一。此外,由于本研究采用缓冲溶液将pH 调控在中性,因此本文的土壤 pH 对降解选择性的影响仍有待进一步研究。本研究中好氧体系和厌氧体系对目标物的降解选择性无明显差异。     

3种典型有机氯农药对锦鲤幼鱼的雌激素效应及其体内富集

为研究3种典型有机氯农药(%-六六六、p,p'-DDT和七氯)低浓度暴露对锦鲤幼鱼的雌激素效应及其体内富集效应,将锦鲤幼鱼暴露于有机氯农药的6个浓度组中进行20 d慢性毒性试验,测量血清中游离钙和蛋白结合磷含量及体内各组织有机氯农药残留。结果表明,在低浓度暴露20 d后,锦鲤幼鱼血清中游离钙和蛋白结合磷含量均随暴露浓度增加而呈先增后减之势,产生了明显的雌激素效应。p,p'-DDT在鱼体各组织中的富集能力远高于%-六六六和七氯;p,p'-DDT主要在鱼油中富集,其次为鱼肝、鱼鳃和鱼皮;%-六六六和七氯主要在鱼肝中富集,其次为鱼皮、鱼鳃和鱼油;3种有机氯农药在鱼肉中的富集相对较少。     

DDT和水中腐殖酸、富里酸的结合

本文以p、p＇-DDT为代表物,介绍了测定水中疏水性有机污染物的腐殖物质相互作用的缔合系数的方法。用本方法得到的p、p＇-DDT在水和商品Fluka腐殖酸之间的缔合系数为1.5(±0.08)×10~5,这与其它方法得到的缔合系数值相一致。使用本方法对某些天然水体中溶解有机物对p,p＇-DDT的结合能力进行了研究。结果表明,p,p＇-DDT在水和溶解有机物之间的缔合系数在5×10~3到2×10~4之间变化,表明p,p＇-DDT将有总量的4％到8％是以结合形式存在的。     

17β-雌二醇与1-萘酚对雄性罗非鱼（GIFT Oreochromis niloticus）雌激素效应的比较

在实验室条件下,研究了暴露于不同质量浓度1-萘酚（0.064、0.8、2 mg.L-1）与17β-雌二醇（1、10、100μg.L-1）下,对雄性罗非鱼（GIFT Oreochromis niloticus）性腺系数、血清雌二醇质量浓度的影响及血清中卵黄蛋白原的诱导效应,以期对它们的环境雌激素效应有所了解。研究结果显示：暴露于1-萘酚环境下30 d后,雄性罗非鱼的性腺系数有所降低,当质量浓度为2 mg.L-1时,与对照组相比,差异显著（p〈0.05）,雄性罗非鱼血清中雌二醇的量,此时亦达到最大值,为209.3 pg.mL-1,与对照组相比,差异显著（p〈0.05）;但是,血清中卵黄蛋白原并无变化。暴露于17β-雌二醇环境中的雄性罗非鱼,30 d后,其性腺系数有所降低,当质量浓度为10、100μg.L-1时,与对照组相比,差异显著（p〈0.05）;血清中的雌二醇也随着暴露质量浓度的增多,逐渐增多,当质量浓度为100μg.L-1时,差异极显著（p〈0.01）;血清中卵黄蛋白原的质量浓度明显高于对照组,与暴露质量浓度之间呈剂量效应关系。结果显示,17β-雌二醇具有很强的雌激素效应,会使罗非鱼性腺系数下降,诱导血清中雌二醇、卵黄蛋白原的生成;而1-萘酚会使罗非鱼性腺系数下降,诱导血清雌二醇的生成,但是并不诱导卵黄蛋白原的生成,所以推测其雌激素效应可能较弱,需要进一步研究。     

烷基酚类化合物的联合雌激素效应

利用鲫鱼卵黄蛋白原诱导作用的雌激素效应研究烷基酚类化合物的联合雌激素效应,通过对鲫鱼血浆卵黄蛋白原含量的相对变化和化合物暴露浓度的非线性回归分析得出17β-雌二醇(E2)、辛基苯酚(PP)、壬基苯酚(p353-NP)及其等毒性同定比例混合物雌激素效应的剂量-反应关系,应用相加作用数学模型根据单个化合物的剂量反应关系可预测混合物效应,各化合物非线性回归分析结果均以Weibull函数拟合效果最好,决定系数R2分别为0.93,0.94,0.96和0.81,半效应浓度值EC50及其95%置信区间分别为0.092(0.080-0.107),63.89(53.90-71.26),152.61(140.11-168.38),11.11(8.54-14.00)μg·l-1;在各个浓度范围内,得出的混合物效应与通过浓度相加或反应相加模型计算得出的混合物效应有很好的一致性,而简单效应相加法得出的结果误差较大;表明了3种雌激素化合物呈现相加作用方式,在低于单个化合物的有效作用浓度下也会产生显著的混合物效应,效应大小取决于化合物的作用性质、暴露量和质量比例.