少根紫萍淀粉合成关键基因对寡营养胁迫的响应

浮萍是一种形态高度退化的开花植物,环境适应性广,生长条件适宜时可以接近指数增长的速度在16-48 h内实现生物量的翻倍.以寡营养处理,少根紫萍(Landoltia punctata)淀粉含量可在7 d内提高到45%以上(干重).通过深入分析转录组数据,分别挖掘到ADP葡萄糖焦磷酸化酶编码基因(LpAGP)5个、颗粒结合型淀粉合酶基因(LpGBSS)2个、可溶性淀粉合酶基因(LpSSS)2个、淀粉分支酶基因(LpSBE)5个、异淀粉酶基因7个(LpISA)、普鲁兰酶基因(LpPUL)1个.转录组定量结果表明LpAGPS1、LpAGPL2、LpAGPL3、LpGBSSI、LpGBSSII、LpSBEI-1、LpISA3和LpPUL1的表达量均因寡营养处理而上调.通过qRT-PCR检测LpAGPs等16个淀粉合成关键基因的表达量,发现绝大部分淀粉合成相关基因表达量上调,而参与淀粉降解途径相关基因(如α-淀粉酶和β-淀粉酶编码基因)的表达量因寡营养处理而下调.这种不同的调节方式促使少根紫萍淀粉合成"开源节流",淀粉得以快速积累.本研究结果可为进一步研究少根紫萍淀粉合成关键基因功能及淀粉积累机制奠定基础.     

4种浮萍提取物的抗菌活性和黄酮含量

浮萍(Lemnaceae)生长在微生物丰富的污水表面,为了研究浮萍抗菌机制,为浮萍抗菌物质活性筛选以及动植物病原菌和人类致病微生物感染机制研究提供依据,用不同极性的溶剂对浮萍进行提取,牛津杯法(Oxford Cup)及最小抑菌浓度(MIC)测定比较绿萍zh0018、少根紫萍zh0224以及多根紫萍zh0003、zh0225四种浮萍提取物的体外抗菌活性,并用分光光度法结合高效液相色谱(HPLC)测定分析提取物总黄酮含量以及成分差异.结果表明:浮萍甲醇提取物、95%乙醇提取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、农杆菌均有不同程度的抗菌活性,其中多根紫萍zh0225甲醇提取物抗菌活性最强(MIC:6.25 mg/mL),其次为绿萍;各萃取物中乙酸乙酯相活性最强(MIC:0.78 mg/mL),其次为正丁醇相.分光光度法测得绿萍甲醇提取物总黄酮含量较高,为提取物的9.8%,其次为少根紫萍甲醇提取物,为8.1%,其中多根紫萍zh0225乙酸乙酯相含量最高,为萃取物的22.46%,其次为正丁醇相,为17.2%.HPLC测得不同浮萍提取物黄酮成分差异较大,两株多根紫萍成分相似而含量不同.研究表明,结合浮萍自身的特性和提取物抗菌活性的大小及黄酮含量,筛选多根紫萍zh0225乙酸乙酯萃取相作为优良浮萍品种提取活性物质以及开展药物生产具有巨大潜力.     

鄱阳湖流域浮萍种质资源分布及其对水环境因子的响应

为全面了解鄱阳湖流域浮萍种属资源分布及其生长水环境,对流域内浮萍资源开展调查并测定生长水体的水质.结果显示,鄱阳湖流域采集到的浮萍共4属5种,分别为青萍(Lemna minor)、稀脉浮萍(Lemna perpusilla)、紫背浮萍(Spirodela polyrrhiza)、少根紫萍(Landoltia punctata)、芜萍(Wolffia arrhiza)、青萍和紫背浮萍为该地区的优势种.青萍生长水体的p H范围最广(5.5-9.43),其他浮萍生长水体呈弱酸性.青萍生长水体中的氨氮(NH_3-N)、硝态氮(NO_3-N)、总氮(TN)、化学需氧量(COD)浓度范围较其他4种浮萍更为广泛,分别为0.18-4.25 mg/L、0.027-3.27mg/L、0.38-13.28 mg/L、16.16-614.72 mg/L,少根紫萍生长水体的总磷(TP)浓度范围最广,为0.06-2.68 mg/L.从重金属含量来看,青萍生长水体Cu、Pb、Zn、Co含量范围最广,少根紫萍对Cd、紫背浮萍对Mn的适应能力表现出优势.从自然状态下富集效果来看,青萍对Zn、紫背浮萍对Cr、少根紫萍对Mn的富集能力强.青萍和紫背浮萍对Pb富集效果好于少根紫萍.RDA分析表明,少根紫萍的分布主要受TN、TP、NH_3-N的影响,紫背浮萍主要受Mn的影响,青萍主要受NO_3-N的影响.稀脉浮萍和芜萍分别受Cd、Cr的影响.不同浮萍种属的水环境差异较大,在修复富营养化水体时,可利用当地优势品种组合以达到最佳的去除效果.根据浮萍对重金属耐受能力、富集效果的不同可筛选出对特定重金属耐性好且富集能力强的品种.本研究对利用浮萍品种修复不同污染的水体具有一定的指导意义.(图4表5参40)     

基于叶绿体基因组的浮萍亚科系统进化

由于浮萍形态高度退化,其系统进化研究较为困难,基于叶绿体基因组研究浮萍亚科系统进化对解决该问题具有重要意义.通过过滤全DNA数据(即包含细胞内的核DNA、叶绿体DNA和线粒体DNA的测序数据)和直接提取叶绿体DNA测序两种方法组装叶绿体基因组,然后分别基于rbc L基因和叶绿体全基因组序列构建浮萍亚科系统发育树,并比较浮萍叶绿体基因组大小.经比对发现,通过两种方法得到的Landoltia punctata ZH0051叶绿体基因组完全一致,全长均为171 013 bp,序列相似度100%.基于叶绿体全基因组序列构建浮萍亚科系统发育树的节点置信值都达到了1,确认了浮萍亚科的进化次序为多根紫萍属、少根紫萍属、绿萍属、扁平无根萍属、芜萍属.浮萍亚科中叶绿体基因组最大的为少根紫萍属(171 kb),最小的为绿萍属(166 kb).本研究表明过滤全DNA数据组装出的浮萍叶绿体基因组是可靠的;浮萍叶绿体基因组大小虽有所差异,但随进化没有明确的扩张或收缩的趋势.     

比较转录组研究钛离子对紫花苜蓿基因表达的影响

钛离子可显著促进植物生长,增加作物产量.以紫花苜蓿(Medicago sativa)为材料,用钛离子水溶液(0,8 mg/L)喷施植株叶面,24 h后取样进行Illumina高通量RNA-Seq测序,研究钛离子对紫花苜蓿叶片基因表达的影响,在转录水平上研究钛离子作用的分子机理.以蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)为参考基因组进行比对,结果显示,共获得28437个注释基因.差异表达分析表明,与对照相比,8mg/L钛离子处理引起大量基因表达发生变化,482个差异表达的基因中247个上调表达,235个下调表达. GO和KEGG注释结果显示,大量核糖体(18)、热激蛋白(7)、转录因子WRKY(5)类编码基因上调表达;尽管抗病相关基因上调的个数(11)低于下调的(22),但这些抗病相关基因的总体表达量,FPKM从12 563上升至16 197.下调的基因主要有细胞色素P450家族基因(上调2个,下调7个).推测钛离子作为一种胁迫信号刺激紫花苜蓿产生应答,引起基因表达发生变化,上调了与生长和胁迫适应相关基因的表达,进而促进植物生长和提高对逆境的耐受性.本研究为揭示钛离子调节植物生长的机制打下基础,为进一步钛离子制剂在农业生产中的应用提供指导.     

少根紫萍对微污染地表水的净化及淀粉积累能力

根据地表水环境质量标准研究少根紫萍(Landoltia punctata)对微污染地表水的净化效果,同时,对其淀粉积累能力进行评价.结果显示,少根紫萍对微污染地表水体可以实现深度处理,经处理的Ⅴ类、劣Ⅴ类水体中氨氮(NH4+-N)和总磷(TP)均在1d内提升一个水质级别,在3d内达到地表Ⅱ类水标准(NH4+-N0.15mg/L,TP0.09mg/L),且氮、磷去除率均达到98.5%和82.9%以上.此外,少根紫萍在快速修复水体的同时能大量积累淀粉.处理3 d,Ⅴ类和劣Ⅴ类水处理中浮萍干重的淀粉含量分别为28.38%、21.57%,15 d后达到52.15%、49.58%.另外研究发现,额外添加二氧化碳(CO2)对淀粉积累有进一步促进作用.处理3 d淀粉含量相比未添加CO2提升了55.7%,平均淀粉积累速率提高了2.72倍.因此,少根紫萍不仅能够快速净化微污染水体,同时也能积累大量的淀粉干物质,结果可为实际污水处理及后期少根紫萍资源化应用提供参考.     

植物NAC转录因子的种类、特征及功能

综述了NAC转录因子的发现及其家族成员、结构特点和生物学功能.NAC类蛋白是近年来发现的一类植物特有、数量众多的转录因子家族,其成员广泛分布于陆生植物中.NAC家族成员的N端具有一个保守的约150个氨基酸组成的NAC结构域,含有A、B、C、D、E 5个亚结构域,C端具有一个高度变异的转录激活区.分析表明,NAC蛋白结构与其功能密切相关.NAC转录因子具有诸多方面的功能,如参与植物次生生长,在细胞分裂和植株衰老中发挥作用,参与激素调控和信号转导,参与矿质元素营养和农作物品质改良等.同时,NACs还参与生物胁迫中植物的防御反应以及在非生物逆境中发挥作用.目前对NAC基因的研究主要集中于模式植物拟南芥和水稻,对于NAC蛋白涉及的调控途径及其组成因子知之甚少,因此NAC基因的功能还有待深入研究;同时,利用基因工程手段导入或改良关键的NAC转录因子,使作物综合品质的提高已成为可能.图2表2参87     

植物对干旱胁迫的响应研究进展

植物在经受干旱胁迫时,通过细胞对干旱信号的感知和传导,调节基因表达,产生新蛋白质,从而引起大量形态、生理和生化上的变化.干旱胁迫对植物在细胞、器官、个体、群体等水平上的形态指标有显著影响,也会影响其光合作用、渗透调节、抗氧化系统等生理生化指标.植物对干旱胁迫的分子响应较复杂,包括合成一些新的基因如NCED、dehydrin基因和CBF、DREB等转录因子.另外,干旱胁迫还能造成蛋白质组学的变化.参52     

香蕉MaPFK基因家族鉴定、MaPFK3克隆和表达

为研究香蕉中MaPFK基因的功能和生物学特性,采用生物信息学分析法对香蕉A基因组的MaPFK基因家族成员进行鉴定、蛋白特性分析、分子进化树分析、FPKM值分析,同时以‘天宝蕉’为材料,通过RT-PCR技术克隆MaPFK3基因,进行生物信息学分析;采用qRT-PCR技术进行低温胁迫下的表达分析.结果表明,MaPFK家族包含12个成员,分子进化树分析可分为3类,FPKM值分析表明MaPFK成员在13、4、0℃不同低温胁迫下有不同程度的上调或下调表达.采用RT-PCR技术克隆了MaPFK3,其基因编码区长1 617 bp,预测编码538个氨基酸,MaPFK3编码蛋白属于PFK超家族,是不稳定的酸性亲水蛋白,无信号肽,亚细胞预测定位于细胞质;MaPFK3启动子顺式作用元件预测分析结果显示,MaPFK3启动子含有光响应、激素响应以及与逆境胁迫相关的作用元件.qRT-PCR分析结果显示,香蕉MaPFK3基因的表达具有组织差异性,且表达量为叶片>假茎>根;低温胁迫引起‘天宝蕉’中MaPFK3基因下调表达,在13、4、0℃不同低温胁迫下,MaPFK3的表达量为13℃<4℃<0℃.本研究表明MaPFK基因家族成员能在香蕉应对低温胁迫的过程中发挥着重要作用.(图11表2参32)     

转录因子DREB、ERF和NAC在介导植物响应生物和非生物胁迫中的作用

生物和非生物胁迫是影响植物生长和造成农业减产的重要原因.近年来,已经鉴定了几个可以调控胁迫相关基因表达的转录因子.这些转录因子在控制植物生物系统转录重编程中起重要作用,能提高植物对生物和非生物胁迫的耐受能力.因此,识别和表征与植物胁迫反应有关的关键基因对增强转基因植物的胁迫耐受能力是必不可少的.本文介绍了DREB、ERF和NAC转录因子,重点介绍其在转基因植物增强对生物和非生物胁迫耐受性的潜力.     

中国水仙DFR基因启动子的克隆及功能

为了解中国水仙花青素合成途径关键基因DFR(NtDFR)的表达调控以及中国水仙不能合成花青素的分子机制,采用染色体步移法从中国水仙中克隆NtDFR基因起始密码子上游962 bp的启动子序列.生物信息学分析结果表明启动子序列除包含TATA-box、CAAT-box等基本启动子元件外,还包含光调控元件、植物激素响应元件、胁迫响应元件等多个顺式作用元件.此外,该启动子序列还含有MYB转录因子结合位点.为验证启动子的表达特性,将NtDFR启动子取代植物表达载体pBI121上35S启动子,构建pBI121-pNtDFR::GUS载体,利用农杆菌转化烟草叶片瞬时表达,通过GUS组织染色法确定了克隆的启动子的活性.将中国水仙R2R3-MYB转录因子NtMYB2、NtMYB5分别和pBI121-p NtDFR::GUS共同注射烟草,定量PCR和GUS组织化学染色结果表明NtMYB2和NtMYB5都使NtDFR启动子诱导的烟草叶片GUS颜色变浅以及GUS基因表达量下降,表明NtMYB2和NtMYB5是NtDFR的抑制因子.本研究结果有助于了解中国水仙花青素合成途径的分子调控机制.(图5参34)     

高浓度氯化镍胁迫下酿酒酵母组蛋白H4K5去乙酰化调控金属硫蛋白基因的表达

金属硫蛋白(MTs)具有重金属解毒功能.组蛋白乙酰化/去乙酰化是表观遗传因子之一,并且参与基因的表达调控.然而,组蛋白乙酰化/去乙酰化在真核生物响应氯化镍胁迫过程中对金属硫蛋白基因的调控作用还不清楚.以酿酒酵母突变株H4K5R(该菌株模拟组蛋白H4赖氨酸5去乙酰化的状态)为试验材料,采用流式细胞术检测不同浓度氯化镍处理下酵母细胞的死亡率,发现突变菌株的生长状态和细胞存活率明显优于野生型菌株BY4741;qRT-PCR检测5 mmol/L氯化镍处理后,酿酒酵母金属硫蛋白基因Cup1、Crs5、Sod1及转录因子Cup2的表达量.结果显示,高浓度氯化镍胁迫下,野生型菌株中基因的表达水平均显著降低;耐镍菌株H4K5R中,金属硫蛋白基因Cup1表达量上调7.4倍,Crs5表达量显著下调2.56倍,Sod1表达量不显著上调,转录因子Cup2表达量上调3.81倍,并且表达水平均显著高于镍处理后的BY4741.本研究表明突变菌株H4K5R具有较强的镍耐受性;镍胁迫下,突变菌株中金属硫蛋白Cup1与转录因子Cup2的表达变化趋势与BY4741相反,说明组蛋白H4K5的去乙酰化可能通过改变基因表达模式,从而在酿酒酵母响应镍胁迫时发挥重要的调控作用.(图6表1参38)     

浅水体浮萍污水净化系统的除氮途径

以稀释的猪场厌氧污水为供试水样,少根紫萍为供试生物材料,对夏、冬2季浅水体浮萍污水净化系统TN、NH4 -N和NOx--N(NO2--N与NO3--N之和)的去除途径进行了试验研究。结果表明,在夏季气温条件下,TN通过气态氨挥发、浮萍系统吸收/吸附NH4 -N和NOx--N得以去除,3途径去除的N分别占TN去除量的30.5%、15.9%和53.6%;NH4 -N通过气态氨挥发、浮萍系统吸收/吸附和硝化反应得以去除,3途径去除的N分别占NH4 -N总去除量的33.1%、17.3%和49.6%;NOx--N则完全通过浮萍系统吸收/吸附得以去除。在冬季气温条件下,TN通过气态氨挥发和浮萍系统吸收/吸附NH4 -N得以去除,2途径去除的N分别占TN去除量的31.7%和68.3%;NH4 -N通过气态氨挥发、浮萍系统吸收/吸附和硝化反应得以去除,3途径去除的N分别占NH4 -N总去除量的28.9%、69.5%和1.6%;而水体中的NOx--N含量始终保持稳定。     

龙眼BRI1基因家族的全基因组鉴定及光照响应表达

为了解龙眼BRI1基因家族的生物学功能及响应光照机制,对其BRI1基因成员鉴定、基因结构、蛋白保守结构域、启动子顺式作用元件、互作miRNA预测、不同体胚发生阶段和不同组织器官的FPKM值及其响应光照表达模式等进行分析.结果表明:DlBRI1基因家族包含4个成员,分别命名为DlBRI1-1、DlBRI1-2a、DlBRI1-2b和DlBRI1-3.DlBRI1是一种无内含子基因,无内含子基因在转录的过程中不需要经历内含子的剪切步骤,是响应外界因素的一种快速应答基因.龙眼BRI1蛋白家族为植物富亮氨酸重复类受体蛋白激酶的一种,其在植物激素信号转导和非生物胁迫中具有重要调控作用.龙眼BRI1四个家族成员启动子均含有大量的光响应元件、激素应答元件、非生物胁迫响应元件,表明龙眼BRI1家族基因可能是连接光信号转导与激素信号转导的重要纽带. DlBRI1-3为miR390e的靶基因. FPKM值分析表明,DlBRI1-1和DlBRI1-3在体胚发生过程和不同组织部位中均呈现高表达,推测DlBRI1-1和DlBRI1-3可能在龙眼整个生长发育过程中起到更为关键的作用.荧光定量PCR结果推测,蓝光信号使得miR390的表达量显著减少,导致靶基因BRI1-3的表达量增加,从而影响油菜素内脂从属基因BZR1、转录因子PIF4,进而影响龙眼功能性代谢产物积累.本研究表明DlBRI1具有功能多样性,可能在龙眼响应光信号、激素信号、非生物胁迫及代谢调控中发挥作用.(图8表3参46)     

中华猕猴桃bZIP家族成员的比较基因组学分析

bZIP转录因子调控着植物的生长发育和逆境胁迫应答,是植物中一类重要的转录因子.基于系统的生物信息学方法,鉴定得到79个中华猕猴桃bZIP转录因子,进化分析结果揭示中华猕猴桃bZIP家族成员在J、K、L三个分组中出现了成员的缺失.中华猕猴桃bZIP家族成员的bZIP保守域主要由碱性结构域和亮氨酸拉链结构域组成,其亮氨酸拉链结构域的第4、5肽段的第7位的亮氨酸残基存在一定程度的变异.bZIP保守域之外,在中华猕猴桃的18个bZIP家族成员中,还发现包括bZIP_C保守域在内的8种其他类型的保守域,集中分布在A、C、D和G组bZIP成员中.通过与葡萄和番茄bZIP同源基因的比较,阐明中华猕猴桃基因组的两次三倍倍增是其bZIP基因数目增加的主要原因.中华猕猴桃不同发育时期果实的转录组揭示了参与调控果实成熟的57个bZIP基因的表达水平.本研究阐明了中华猕猴桃bZIP家族成员的进化特征、保守域组成、家族成员数目扩增的主要原因,提供了涉及果实发育的优良候选基因.(图6表2参28)     

重金属镉超富集浮萍品种筛选及其对水体中镉的去除效果北大核心CSCD

为筛选出能高效去除水体重金属镉,并能快速积累生物量的浮萍品种,对实验室保存的12个能耐受30 mg/L镉浓度的浮萍品种在0.5 mg/L和10 mg/L的镉浓度下进行复筛,获得最优品种少根紫萍(Landoltia punctata)ZH0049,并研究其在不同镉浓度胁迫下的生长状况和镉富集能力,同时分析其叶绿素含量变化与镉胁迫浓度的关系.结果显示:ZH0049在0-0.5 mg/L的镉浓度范围内能正常生长,干物质积累率最高可达到6.44 g m-2 d-1.在0-3 mg/L的镉浓度范围内,ZH0049对镉的吸收率、去除率以及富集系数在0.5 mg/L时出现波谷,而在3 mg/L时达到最高,分别为66.74%、72.43%和770.叶绿素相对含量实验结果显示,当镉浓度大于0.5 mg/L,浮萍生长受到抑制,叶绿素a、b含量开始下降,相对于初始值最高下降了61.79%和32.08%.当镉浓度从0.5 mg/L至3 mg/L,叶绿素相对含量(Chl a/Chl b)相对于初始值分别下降了3.49%、7.28%、19.32%、31.33%和42.59%,表明叶绿素a降幅大于叶绿素b.综上,ZH0049能将水体中的镉富集在体内的同时,保持较高的干物质积累量,从而达到较好的重金属去除效果,为水体中镉的去除建立了一种新途径.     

多年生植物的芽休眠及调控机理研究进展

芽休眠是一种有益的生物学特性,能够使多年生植物避开不利的环境条件,使种群在不利环境条件下得以生存.综述了多年生植物芽休眠的机制及其调控的研究进展.芽休眠是一个受多个因素和多种基因综合调控的复杂生命现象,其形成和解除受到光照、温度、水分等外界环境因素的影响和调控.在这个过程中,植物体内的激素、糖类、多胺和Ca2+等信号分子以及抗氧化酶类和能量代谢酶类等发生一系列的变化与之相适应.这些变化是在相应的基因表达调控下实现的,这些基因涉及到光、温响应基因,水分响应基因,能量代谢基因,胁迫响应基因,激素相关基因,以及MADS-box转录因子等,它们构成一个复杂的调控网络,共同控制着芽休眠的形成与解除.结合研究课题提出今后芽休眠机制的研究方向以及在农业上的应用前景.图1参67     

甘薯LEA2基因的克隆与表达分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant,LEA)是植物在逆境胁迫下产生的一种应激蛋白质,具有较高的亲水性和热稳定性,与植物抗逆功能密切相关,研究LEA家族基因对于甘薯抗逆性分子育种具有重要意义.通过对甘薯(徐薯18)转录组数据库搜寻时发现编码LEA2的转录本,随后对该转录本进行了克隆和测序分析,利用数字表达谱(Digital Gene Expression Profi ling,DGE)和半定量RT-PCR分析了Ib-LEA2在不同组织和不同发育阶段的表达图谱.为进一步了解Ib-LEA2在生物体响应盐胁迫中的作用,将Ib-LEA2连接原核表达载体pET-32a,用大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行盐胁迫的耐受分析.结果显示:Ib-LEA2完整的开放阅读框(ORF)长度为942 bp,编码313个氨基酸残基.进一步研究发现,在甘薯组织内同时存在3个高度同源的LEA 2基因型(核苷酸序列99%),分别命名为Ib-LEA2a、Ib-LEA2b和Ib-LEA2c.数字表达谱和半定量RT-PCR的结果显示Ib-LEA2在不同组织和发育阶段具有不同的表达图谱,在茎中的表达量远远高于叶和根.大肠杆菌BL21(DE3)菌株盐胁迫的结果显示,较之对照菌株,表达Ib-LEA2的菌株能够更好地耐受高浓度的NaCl.研究表明,Ib-LEA2对盐胁迫有一定的响应能力,能够保护细胞免受高盐的毒害.     

根系分泌作用及其诱导机制

根系分泌作用及其实现植物对胁迫环境的适应,是近年来根际学领域的一个研究热点.文章评述了环境胁迫对植物根分泌物组成、含量的影响以及植物根系分泌的四种诱导假设;并对环境胁迫条件下的信号传递及根系分泌作用的生理及分子生物学基础进行了讨论.在此基础上,认为特定根分泌物的分泌是植物在进化过程中适应环境胁迫的实质.     

播娘蒿转录因子DsCBF1突变体的构建及其蛋白质的EMSA试验分析

CBF(C-repeat binding factor)是调控植物冷驯化相关基因表达的调控转录激活因子,可与下游冷应答基因启动子的核心序列CBT/DRE元件(CCGAC)特异性地结合,启动耐寒基因的表达,提高植物的抗寒能力.为揭示播娘蒿(Descurainia sophia)的抗寒机制,研究播娘蒿转录因子Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸对启动下游抗寒基因表达的作用.首先分析Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸的疏水性,设计重叠延伸PCR引物,定点突变Ds CBF1基因;然后构建p ET32a-Ds CBF1突变体原核表达载体,通过冻融法转化入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,进行原核表达,并通过镍离子亲和层析纯化Ds CBF1突变体蛋白;最后利用化学发光法EMSA试验(Electrophoretic mobility shift assay)方法分析Ds CBF1蛋白与含有CRT/DRE元件的DNA探针之间的相互作用.EMSA试验分析显示,播娘蒿Ds CBF1的AP2区域的57位苯丙氨酸F(TTT)和68位缬氨酸V(GTT)分别突变为精氨酸R(CGT)和谷氨酸E(GAA),导致播娘蒿顺式调控因子Ds CBF1蛋白与下游冷响应基因的CRT/DRE元件结合效率出现明显下降趋势,说明播娘蒿Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸位点的突变影响了播娘蒿的抗寒能力.本研究表明播娘蒿Ds CBF1的AP2区域的57位苯丙氨酸F(TTT)和68位缬氨酸V(GTT)位点对于播娘蒿的冷驯化具有十分重要的作用.