luxAB基因标记甲基对硫磷降解菌DLL-1在土壤和植株根部的生态行为研究

发光酶标记是 1种有效的跟踪微生物在生态环境中动态行为的技术手段。采用luxAB基因标记技术对甲基对硫磷降解菌DLL - 1在土壤中的分布和植株内的定殖情况进行了研究。结果表明 ,DLL - 1可以较长时间的在植株根际定殖 ,3 0d后仍可用X -感光片检测到菌体的存在 ,而根际外未检测到DLL - 1。植株根剖开后在培养基上培养 2 4h后进行X -光片曝光 ,发现DLL - 1能够进入植株根内并定殖。菌株回收后采用测定其农药降解活力和检查质粒图谱 2种方法证实 ,所观测的回收菌株就是接种的DLL - 1菌株     

玉米内生固氮菌的回接分离及限菌条件下在玉米根内的定殖

对从玉米茎内分离的18株固氮菌进行了回接分离试验，经多碳源无氮培养基、菌落形态、颜色与REP－PCR相结合的方法，筛选、鉴定出了两株具有较高乙炔还原活性和能在玉米体内定殖的菌株R1和R6。把携带gfp标记基因的质粒pKK223-GFP和nifH-gfp的质粒pMGFP2.1分别转化R1和R6，得到携带gfp，且菌落带绿色荧光的转化子R1A和R6A，以及携带nifH-gfp的转化子R1B和R6B。在限菌条件下对R1A和R6A，在玉米根内的定殖以及R1B和R6B中nifH-gfp融合基因的表达进行了研究，结果表明了R1A和R6A主要定殖在根的皮层细胞、胞间隙、中柱细胞和导管内，有时在活的细胞内也可检测到，R1B和R6B中的融合基因因受玉米根内营养以及其它与固氮酶基因表达相关因素的限制，很难在玉米根内表达，只有在添加了1‰蔗糖后，nifH-gfp才能在根内表达。     

3株芽孢杆菌在水稻根际定殖促生及其在土壤中的存活

植物根际促生菌(PGPR)可分泌植物生长激素,促进土壤养分循环,是生物肥料重要的种质资源。PGPR吸附于作物根系是形成定殖与功能的必要条件,抗性药物标记是研究功能菌株定殖促生能力的一种手段。利用解钾功能菌(Bacillus aryabhattai LZP01,简称LZP01)、解磷功能菌(Bacillus pumilus LZP02,简称LZP02)和溶磷功能菌(Bacillus megaterium LZP03,简称LZP03)这3株高效的水稻根际促生菌,通过抗生素药物利福平梯度筛选分别得到标记菌株K-LZP01、K-LZP02和K-LZP03,并且研究标记菌株的功能保留情况,进而检测标记菌株在水稻根际与土壤中定殖存活及促生能力。结果表明,水稻幼根浸入菌液后吸附量随浸入时间的增加而增大,其中K-LZP01在10min后吸附基本稳定;K-LZP01在50 min时吸附量达到最大;K-LZP03在5 min时吸附量达到最大,最大吸附量为12×10~7CFU·g~(-1),之后趋于动态稳定。将水稻幼苗浸入不同浓度菌悬液中,幼根吸附量随菌悬液浓度的增大而增大。标记菌株在接种于土壤中10 d后定殖量趋于稳定,且定殖能力较强。距离水稻根际越近标记菌株含量越高,表明菌株定殖竞争力越强。在灭菌土与未灭菌土条件下,3株菌株均具有促进水稻根系生长的能力。     

外源降解菌对黄麻根区净化能力的生物强化作用

通过原生质体电融合得到经EGFP标记的外源细菌(蒽高效降解菌An和表面活性剂产生菌P)与黄麻根际优势菌融合的2株融合子Tu-An与融合子Tu-P,然后将两种融合子以及出发菌株分别定殖到播种了黄麻(Corchoruscapsulari)的蒽污染土壤中,对不同污染物浓度下的细菌定殖、植物生长及蒽降解做了初步研究.研究表明,在相同的初始接种量下,融合子的定殖数量明显高于出发菌株;在两种融合子共存的条件下,定殖数量也略高于单一融合子的定殖数量.在接种外源菌的土壤中,植物获得了更好的生长条件,得以良好生长;而没有投加降解菌的组别中,黄麻的生长明显受到了较严重的抑制.投加外源降解菌可以促进生物降解,达到生物强化的目的.实验研究说明,把外源降解菌投加到污染土壤中进行生物强化修复是可行的.图3表2参20     

恶臭假单胞菌DLL-E4对硝基苯酚降解途径关键基因pnpC的突变分析

通过同源重组成功地敲除了恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)DLL-E4菌株的偏三苯酚1,2-双加氧酶基因(pnpC).pnpC插入失活菌株DLL-△pnpCl失去了降解对硝基苯酚(PNP)和对苯二酚(HQ)的能力,而pnpC敲除菌株DLL-△pnpC恢复了利用PNP和HQ的能力,但是降解速率降低.在不同硫酸铵分级梯度下PNP和邻苯二酚分别诱导的DLL-E4和DLL-△pnpC粗酶液对邻苯二酚的降解活性存在明显差异,表明恶臭假单胞菌DLL-E4中除pnpC参与PNP降解代谢过程外,还存在另一个双加氧酶替代了敲除的pnpC的功能,使得DLL-△pnpC代谢PNP的过程得以继续.     

绿色荧光蛋白基因标记内生枯草芽孢杆菌

用枯草芽孢杆菌168菌株rpsD基因的启动子替换质粒pGFP4412中蜡状芽孢杆菌4412启动子,从而构建了能在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白基因gfpmut3a的载体pS4GFP,将其导入具有内生、防病、促生作用的野生型枯草芽孢杆菌BS-2菌株中,筛选获得遗传稳定性好且具有良好发光表型的标记菌株BS-2-gfp.该标记菌株在小白菜体内的定殖研究结果表明,该菌株能够在小白菜根际及根、茎、叶内定殖和传导,接菌50d后仍能在其体内分离到标记菌株.图5参17     

根际微生物耦合降解系统的构建及其对蒽污染土壤的修复

摘要将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的黄麻土生根际优势菌Tu-1B分别与葸高效降解菌An-2和生物表面活性剂产生菌P7-50进行原生质体电融合，得到两株具有荧光标记的融合子Tu-An和Tu-P．将二融合子接种于植物根际土壤，构建根际微生物耦合降解系统，：在40d时该系统的最大降解率为96％．对根际土壤中的Tu-An融合子进行了检测，结果表明融合子在根际能稳定旺盛生长．图3表4参18     

从水稻种子表面分离的紫云英根瘤菌与不同水稻品种亲合性的研究

采用紫云英琼脂管结瘤试验，在10个供试的不同水稻品种中，仅从“汕优63”和“珍A一代”2个品种的种子表面各分离筛选到在紫云英上结瘤较早且较多的1个菌株，分别命名为SY63－4和SA1D－3。采用无菌盆栽试验分别将这2个菌株接种于4个不同水稻品种“汕优63”、“珍A一代”、“马协63”及“博湛优19”，发现菌株ZA1D－3对4种水稻均表现出显著的促生作用，SY63－4仅对“汕优63”和“珍A一代”表现出明显的促生作用。利用MPN法检测不同水稻品种根内外根瘤菌ZA1D－3和SY63－4的数量，发现ZA1D－3和SY63－4在4种水稻根部的定殖数量也不相同。SY63－4在“汕优63”根部定殖的数量log(ncfumFW^-1/g^-1)为5．20，比在其余3种水稻根部高出2个数量级；ZA1D－3在“珍A一代”根部定殖的最大数量log(ncfumFW^-1/g^-1)为4．54，比在其余3种水稻根部高出1个数量级。这说明SY63－4与“汕优63”，ZA1D－3与“珍A一代”间存在着一定的亲和性。图1表2参12     

骆驼刺根际细菌的植物促生能力

采用纯培养方法使用5种培养基分析沙漠干旱植物骆驼刺的根际可培养细菌群落,并用盆钵试验验证这些菌株的植物促生能力.共从骆驼刺根际土中分离纯化了120株细菌,根据16S rRNA基因序列划分成32个16S r RNA基因型,分布在Actinobacteria、Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes等4个门的17个属内.其中,Actinobacteria占全部分离菌株的77.3%,是骆驼刺根际的优势微生物;该门的Streptomyces和Arthrobacter两个属是分离菌株最多的属.从16个型(55株)的细菌中检测到了固氮酶nif H基因,占全部分离菌株的45.8%、全部型的50%.盆钵试验中,菌株Microbacterium sp.WLJ053、Streptomyces sp.WLJ079、Paenibacillus sp.WLJ097、Sphingomonas sp.WLJ118和Chryseobacterium sp.WLJ119能显著提高玉米的株高、鲜重和干重,具有植株促生能力.使用营养丰富的LB和WS培养基获得的微生物种类和特有微生物数量都更多,含nif H基因和具有植物促生能力的菌株比例更高.本研究说明沙漠植物根际蕴含了大量微生物种质资源,具有较好的开发前景.     

龙葵根际和内生Cd抗性细菌的筛选及其生物学特性

调查了南京栖霞铅锌银矿区龙葵根际土壤和植株的重金属含量,采用稀释培养法和选择性培养基分离筛选Cd抗性细菌并研究其生物学特性.结果表明,栖霞山铅锌银矿区龙葵根际土壤总Cd含量平均为19.74 mg·kg -1,污染十分严重,龙葵(Solanum nigrum)茎和叶的Cd富集系数分别为1.21 ～9.65和0.65 ～4.76,对Cd具有较强富集能力.从龙葵根际土壤和植株中分离筛选到5株Cd抗性细菌,菌株AR1和AY1分别分离自根和叶内,BGJ4和CGJ1均分离自根际土.16S rDNA序列分析表明5株Cd抗性细菌均属于芽孢杆菌属(Bacillus),能够产生吲哚乙酸(IAA)和铁载体,根内生细菌AR1在含Cd2+ 30 mg·L-1的培养基中仍能生长良好.在1.5 mg· L-1Cd2+污染条件下,Cd抗性细菌AR1、AY1、BGJ4菌株能够明显促进油菜(Oilseed rape)幼苗根的伸长,在植物-微生物联合修复重金属污染土壤方面具有潜在的应用前景.     

高氯酸盐降解菌的分离鉴定及特性研究

研究降解高氯酸盐环境污染物微生物的形态特征、分子系统特征、生长特性和降解活性。利用PCA选择性培养基富集分离高氯酸根降解菌,观察其形态,进行生理生化测定,用分子克隆技术获得菌株的16SrDNA基因并测序,并对菌株的16S rDNA基因序列进行比对和系统发育分析,并用培养技术和离子色谱法检测菌株对底物的利用和降解情况。从镇江江滨和镇江新区污水处理厂的活性污泥中分别分离到一株能降解高氯酸根的菌株JD14和JD125。此菌株在24～30℃条件下较快地降解底物高氯酸盐,其中在24℃下,15d内可以将初始质量浓度为1600mg·kg-1的高氯酸根降解（86±6.5）%。对两菌株的16S rDNA基因进行了克隆和测序,并进行系统发育分析,结果表明菌株JD14和Dechloromonas sp.SIUL相似度高达100%,JD125和Dechlorospirillum相似度达97%,最后鉴定JD14和JD125属于高氯酸盐降解菌。此前国内并无降解高氯酸根微生物的报道,对今后在环境污染防治中开发利用此类细菌具有指导意义。     

不同河岸带植物根际丁草胺降解特性差异及其微生物学机制

以根际袋盆栽方法,研究了芦苇(Phragmites australis)、茭白(Zizania aquatia)、菖蒲(Acorus calamus Linn)三种典型河岸带植物根际丁草胺降解特征的差异,并从微生物学角度探讨了可能的机制.结果表明,与非根际相比较,不同河岸带植物根际对土壤中丁草胺降解有显著的增强效应.不同河岸带植物对丁草胺的降解效果存在显著差异,降解效果由大到小的次序为:菖蒲,芦苇,茭白.芦苇、茭白、菖蒲根际丁草胺降解速率常数依次分别为0.0606、0.0500、0.0680.在丁草胺作用下,不同河岸带植物根际与非根际土壤关键酶的活性和微生物特征存在明显差异.丁草胺对几种植物根际与非根际脱氢酶与脲酶都有不同程度的激活,但随后抑制并趋于正常水平,而磷酸酶则基本上影响不明显.同期根际的酶活性要比非根际的高.丁草胺作用后,对土壤细菌及真菌有明显的抑制作用,但对放线菌的数量影响不大.与芦苇和茭白相比,菖蒲根际土壤酶活性和微生物数量明显更高,说明该植物对土壤中丁草胺污染具有较好的缓冲作用,从而大大提高了丁草胺的微生物降解的增强效应.     

以菌株Pseudomonas putida KT2440为宿主构建多功能农药降解菌

通过富集培养法分离到的农药降解菌株存在稳定性差、底物谱窄、安全性不明等问题.Pseudomonas putida KT2440分离自根际土壤,是国际上公认的环境安全型菌株.利用同源重组方法将4种农药降解酶基因pytH、mpd、chd和amy A同时整合到P.putida KT2440的染色体上,获得了一株无抗性基因残留的工程菌P.putida KT-pmca.工程菌KTpmca能够同时降解拟除虫菊酯类杀虫剂、有机磷类杀虫剂、百菌清和氯代酰胺类4种农药,百菌清降解率大于95%,甲氰菊酯、毒死蜱和敌稗的降解率均达到80%以上.此外,传代实验证明4种降解酶基因能够在遗传中稳定存在.本研究表明工程菌KT-pmca可为微生物原位修复消除农药污染提供新的菌株资源.     

根际土壤中DDTs的残留与转化

通过根垫法研究DDT的五种异构体p,p‘-DDE,o,p’-DDD,p,p‘-DDD,o,p‘-DDT,p,p‘-DDT在小麦根际土壤和非根际土壤中的残留量以及DDT,DDD和DDE之间的转化．结果发现,在40d试验期间内,DDT发生缓慢降解,根际土壤中的降解略快于非根际土壤,且差别主要表现在生成DDD的厌氧过程方面．此外,根际土壤中五种DDT的异构体的可提取残留都高于非根际土壤,说明该农药的锁定过程在根际环境相对较弱．     

非离子表面活性剂强化白腐菌及其粗酶液对有机氯农药的降解

有机氯农药曾在世界范围内被广泛用于农业害虫的防治,为利用表面活性剂增效修复技术去除环境中的有机氯农药污染,研究了3种非离子表面活性剂(Tween 80、Tween 20和Triton X-100)对4种典型有机氯农药(4,4’-DDT、狄氏剂、艾氏剂和七氯)在水相中的增溶作用,对白腐菌Phlebia acanthocystis TMIC34875生长的影响以及对该菌株、胞外及胞内酶降解有机氯农药的强化效果.增溶试验结果表明,3种非离子表面活性剂可明显增加各有机氯农药的水溶解度,其增溶能力大小顺序为Tween 80>Tween 20>Triton X-100.Tween 80在低浓度(0.05、0.1和0.2 gL-1)下会促进白腐菌在PDB培养基中的生长,使其生物量增加;而高浓度(0.5和1.0 gL-1)的Tween 80则对菌株的生长产生一定的抑制作用.在0.05-0.5 g L-1浓度范围内,Tween 80可强化菌株对有机氯农药的降解效果,且降解率随着Tween 80浓度的增加而增加.降解强化效果在Tween 80浓度为0.5 gL-1时达到最佳,4,4’-DDT、狄氏剂、艾氏剂和七氯的降解率相比对照分别提高了6.70%、6.37%、10.94%和7.21%.Tween 80同样可促进胞内酶和胞外酶对4种有机氯农药的降解,尤其是对胞外酶降解的强化作用,在1.0 gL-1的Tween 80溶液中,有机氯农药的降解率提高了10%左右.可见,在农药污染环境的生物修复技术中,应用Tween 80等非离子表面活性剂来提高修复效率是可行的.     

一株菲降解菌的分离鉴定及其降解条件研究

以菲为研究对象,从克拉玛依稠油污染土壤中筛选到1株对菲具有较好降解效果的菌株JZ3-21。通过形态观察、生理生化指标及16S rDNA序列分析对该菌株进行了鉴定。该株菌的16S rDNA序列与Pseudomonas属的相似性达99%,结合分离菌株的形态、生理生化特征和16S rDNA基因序列的分析结果,初步鉴定该菌株为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida.）。对其降解条件进行了研究,结果表明：在40℃,pH 8.0,接种量为1.5%的条件下,菌株对初始质量浓度为100 mg.L-1的菲在64 h内的降解率高达94.2%。该菌对高质量浓度菲有较好的耐受性,其最高耐受质量浓度可达2 000 mg.L-1。     

磺胺类抗生素复合污染降解菌的筛选及其降毒作用

磺胺类抗生素是环境中检测出率较高的一类污染物.微生物降解是一种相对安全、高效且成本低的污染物去除技术,而关于磺胺类抗生素复合污染降解菌对该类抗生素的去除及其降毒能力方面的研究较少.因此,以3种磺胺类抗生素:磺胺吡啶(SP)、磺胺氯哒嗪(SCP)和磺胺二甲嘧啶(SM2)为碳源,从土壤中筛选3种磺胺类抗生素复合污染的降解菌,应用时间毒性微板分析法,测定3种抗生素及其复合污染物在降解前、后对指示生物蛋白核小球藻的毒性效应,并分析降解菌对3种抗生素及其复合物污染物的降毒能力.结果表明,以SP、SCP和SM2为碳源筛选出2株(S1和S2)降解菌,其中,S1菌株对3种抗生素的降解能力优于S2菌株,并初步鉴定S1降解菌为马氏棒杆菌属;S1降解菌的生长状况和降解能力最佳条件:3种抗生素的混合浓度为1 500 mg·L-1,pH=7.0,温度30℃,转速为150 r·min-1以及接种量为2.0％;S1菌株降解后的抗生素及其复合污染物对蛋白核小球藻的毒性明显低于降解前的毒性,降毒率在99％以上;S1降解菌对3种磺胺类抗生素的降解能力为SM2＞SP＞SCP.     

氯代芳香族化合物高效降解菌的驯化与筛选

为了筛选除解造纸废水中的氯代芳香族化合物的高效降解菌株，选用了造纸废水SBR处理系统的活性污泥作为菌源，采用平板分离池分离出18种菌株，并从中选出生长势态良好的11种，通过对废水中CODCr,TCl的降解效果试验，确定出以M3＋M8为组合的优势混合菌。     

铝胁迫下马尾松幼苗有机酸分泌和根际pH值的变化

以马尾松幼苗为试验材料,选用砂培法研究铝胁迫对马尾松根际pH值、有机酸分泌以及植株中铝累积变化的影响。结果表明,高浓度铝导致根际pH值增加,当铝浓度高于300μmol.L-1时,根际pH值则趋于平稳。在测试的5种有机酸(草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酸)中,当铝浓度由0升至300μmol.L-1时,草酸和苹果酸根系分泌量随之升高,与根际pH值呈正相关关系;而当铝浓度高于300μmol.L-1时,草酸和苹果酸分泌量则趋于平稳,草酸和苹果酸的分泌影响根际pH值的变化。其次,活性铝通过根系进入植株后,由于营养作用和运输机制,出现分布差异,根部铝积累量明显高于茎和叶。当根系接触的铝浓度低于300μmol.L-1时,植株铝积累量与根际pH值,以及草酸、苹果酸分泌量呈显著正相关。     

萘降解菌NAP_A的分离、降解性能和分子系统学研究

该文研究降解多环芳烃类环境污染物的微生物资源、降解活性和分子系统特征.利用萘-无机盐选择性培养基分离萘降解菌,用培养技术和气相色谱法检测菌株对底物的利用和降解情况,用分子克隆技术获得菌株的16S rRNA基因并测序,用DNAMAN软件对菌株的16S rRNA基因序列进行比对和系统发育分析.从淄博张店污水处理厂的活性污泥中分离到一株能降解萘的菌株NAP_A.此菌株在30 ～35 ℃和pH 7条件下较快的降解底物萘,其中30 ℃下,10 d内可以将初始质量浓度为320 mg·L-1的萘降解90％± 4.5％.对菌株NAP_A的16S rRNA基因进行了克隆和测序(EU142847),基于菌株NAP_A和相关菌株的16S rRNA基因进行系统发育分析,结果表明菌株NAP_A位于苍白杆菌属的分枝中,其中与假中间苍白杆菌种的同源性最高,可达99％,因此推断NAP_A菌是一株假中间苍白杆菌.此前并无苍白杆菌属成员降解多环芳烃的报道.这是首例苍白杆菌属成员降解多环芳烃的报道,对今后在环境污染防治中开发利用此类细菌具有指导意义.