甘蓝型油菜半胱氨酸蛋白酶cDNA的克隆及组织特异性表达分析

采用SSH (Suppression subtractive hybridization)和Race-PCR (Rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆得到来自甘蓝型油菜(Brassica napus L.)矮化突变体'NDF-1'的一个差异表达基因编码区的全长cDNA序列,命名为Bncp5.该基因全长1 224 bp,含有1 080 bp的完整开放阅读框,编码359个氨基酸.该基因编码区与甘蓝中一个与衰老相关的半胱氨酸蛋白酶基因(登录号AF454960)同源性达97%,氨基酸序列同源性达到100%. Bncp5编码的蛋白相对分子质量为39.5×103,等电点为5.57.对其活性位点的分析表明其具备真核生物半胱氨酸蛋白酶的活性中心,且有很高的功能区段保守性,推测为一跨膜蛋白.相对定量PCR的检测结果表明, Bncp5在野生型和矮化突变体的根、茎、子叶和真叶中都有表达,但是表达量存在显著性差异.在野生型高秆油菜中,根的表达量最低,在真叶的表达量最高;在矮化突变体中,根、茎中的表达明显高于野生型,而在子叶和真叶中的表达量与野生型油菜的表达量基本一致.     

Cloning,expression, and functional identification of CaSWEET7 and CaSWEET15 genes in Canarium album北大核心CSCD

糖外排转运蛋白(sugars will eventually be exported transporters,SWEET)介导植物光合同化产物蔗糖的跨膜运输.以橄榄(Canarium album(Lour.)Raeusch.)果实为材料,通过气相色谱串联质谱(GC-MS)检测橄榄果实中糖组分及含量变化,利用RT-PCR技术克隆得到CaSWEET7和CaSWEET15基因开放阅读框(ORF)序列.结果表明:CaSWEET7和CaSWEET15基因ORF全长分别为774 bp和951 bp,分别编码长度为257个和316个氨基酸残基,具有2个MtN3_slv结构域;进化树分析表明,CaSWEET7属于CladeⅡ,CaSWEET15属于CladeⅢ.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测其在不同发育时期的果实中相对表达量变化,结果表明,随着果实发育,CaSWEET7和CaSWEET15表达量逐渐递增,且与果实发育蔗糖含量变化呈显著正相关(相关性系数分别为0.931和0.904,P<0.05);利用酵母功能互补证明CaSWEET7和CaSWEET15基因编码的蛋白具有转运蔗糖能力.本研究表明CaSWEET7和CaSWEET15基因可能在橄榄果实蔗糖积累中发挥作用.(图9表2参44)     

甘蔗茉莉酸合成关键酶基因ScOPR1的克隆、亚细胞定位及表达

12-氧-植物二烯酸还原酶(12-Oxo-phytodienoic acid reductase,OPR)是十八碳烯酸途径的关键酶之一,控制着茉莉酸合成的最后一个步骤.目前,甘蔗(Saccharum spp.)OPR基因的研究尚未见报道.从课题组构建的甘蔗转录组unigene注释库中筛选到一个OPR基因,利用RT-PCR技术从ROC22接种黑穗病菌48 h的蔗芽中扩增获得全长cDNA序列,命名为ScOPR1(GenBank Accession Number:MG755745),并对该基因的序列特征、亚细胞定位、组织特异性表达及其在不同植物激素胁迫和不同基因型甘蔗与黑穗病菌互作过程中的表达情况进行分析.生物信息学分析发现,ScOPR1基因全长1 287 bp,包含1个1 116 bp的开放阅读框,编码371个氨基酸,理论等电点为6.01,含有底物结合活性、FMN结合活性和催化活性的氨基酸保守位点以及OYE家族的保守结构域,且与高粱(Sorghum bicolor)OPR蛋白(XP_002447901.2)的氨基酸序列一致性高达96.23%,推测其为酸性稳定亲水性非分泌OPRⅠ蛋白.本氏烟(Nicotiana benthamiana)瞬时表达显示,ScOPR1::GFP融合蛋白定位于细胞质和细胞膜.qRT-PCR分析结果显示,ScOPR1基因在甘蔗不同组织中均有表达,其在根中的表达量最高,其次为叶和蔗皮,而在蔗芽和蔗肉中的表达量最低.茉莉酸甲酯和水杨酸处理后,随着胁迫时间的延长(3-24 h),ScOPR1基因显著上调表达;该基因在脱落酸处理0.5 h时被诱导表达,为对照的1.54倍.此外,ScOPR1基因在抗黑穗病品种崖城05-179受黑穗病菌侵染初期(24 h)显著上调表达,但在感黑穗病品种ROC22中下调表达;48-72 h时ScOPR1基因的表达量在两个甘蔗基因型中较对照有所增加,但在抗病品种中高于感病品种.本研究表明,ScOPR1基因积极响应茉莉酸甲酯、水杨酸和脱落酸信号分子以及黑穗病菌的胁迫,结果可为进一步分析ScOPR1基因的功能和甘蔗抗病基因工程提供参考.     

闽侯野生蕉LDOX基因的克隆及表达特性

为探讨闽侯野生蕉无色花青素双加氧酶基因(MiLDOX)的序列和表达特性,利用反转录PCR(RT-PCR)克隆MiLDOX基因cDNA序列,并对其进行系列生物信息学和不同组织器官中的表达特性分析.结果显示,MiLDOX基因包含1 083 bp完整的开放阅读框,可编码分子量(Mr)为40.73×10~3、包含360个氨基酸的蛋白质. MiLDOX基因属于α-酮戊二酸依赖性双加酶基因家族,其编码蛋白为不含信号肽和跨膜结构的亲水性蛋白,理论等电点为5.71.MiLDOX二级结构中不规则卷曲和α-螺旋占比较大.亚细胞定位预测结果显示MiLDOX可能定位于细胞质中.系统进化树显示MiLDOX与小果野蕉MaLDOX和阿比西尼亚红脉蕉EvLDOX亲缘关系最近.实时荧光定量PCR结果显示MiLDOX在闽侯野生蕉不同组织部位都有表达,在雄花中的表达量最高,且与类黄酮和花色素苷含量呈显著正相关.此外,通过研究MiLDOX基因在不同转色阶段果皮中的表达情况,发现它的表达随着果皮色素积累逐步升高.本研究表明MiLDOX基因可能分别参与闽侯野生蕉类黄酮和花色素苷的积累,并在果皮转色等过程发挥着重要作用.(图9表1参37)     

麻疯树酰基载体蛋白的基因克隆、表达分析及原核表达

从麻疯树胚乳cDNA文库中筛选分离了一个编码酰基载体蛋白的cDNA序列,全长为806 bp,其开放读码框(ORF)长度为393 bp.编码130个氨基酸,该序列在GenBanl澄录号为EF179617,命名为JcACP.该基因编码的蛋白质相对分子质量(M)约为14.4×103,等电点为5.2,具有酰基载体蛋白的典型特征--含有4'-磷酸泛酰巯基乙胺辅基的结合位点.RT-PCR试验结果表明,该基因在麻疯树的叶、茎和种子中表达,以种子中的表达量最高,在根中不表达,种子萌发后其表达量随萌发进程递增,在96 h时表达量达到最高.结果表明,JcAcP在种子中的高度表达可能与种子萌发时的代谢活动有关.同时,将其在大肠杆菌中成功进行了原核表达.     

甘蔗细胞色素P450还原酶基因的RT-PCR扩增与表达分析

细胞色素P450基因在电子传递链、次生代谢物质合成和对外源化学药物毒性降解中发挥着重要作用,为了深入了解该基因在甘蔗中的功能,通过RT-PCR扩增获得甘蔗细胞色素P450还原酶基因的cDNA全长序列,命名为ScCPR450(Gen Bank Accession Number:KR864841).该基因全长999 bp,含有744 bp的完整开放阅读框,编码247个氨基酸.亚细胞定位结果显示,ScCPR450蛋白分布于细胞质中,与生物信息学预测结果相符.q RT-PCR表达分析表明,该基因在甘蔗中组成型表达,但有组织特异性,芽中表达量最高,其次是叶,而皮中表达量最低.在脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、聚乙二醇(PEG)和氯化铜(CuCl_2)胁迫诱导过程中,该基因的表达量呈现不同变化模式,其中SA胁迫6 h下,ScCPR450基因的表达量最高,约为对照的12.21倍;在PEG胁迫下,ScCPR450基因的表达量上调且表达量稳定,推测ScCPR450基因在甘蔗响应生物和非生物胁迫中发挥一定的作用.本研究可为该基因家族其它成员的克隆以及深入解析该基因的功能特性奠定基础,进而为基于基因工程技术对甘蔗品种进行定向改良提供基因资源.     

茶树RING-finger型E3泛素连接酶基因CsSDIR的克隆与表达

蛋白质泛素化修饰广泛参与植物的生长发育及逆境胁迫响应,其中RING-finger型E3泛素连接酶基因salt and drought induced ring finger1(SDIR1)在植物抗逆中具有重要的作用.为了解茶树SDIR1(CsSDIR1)在抗逆应答中的作用机制,采用RT-PCR技术从茶树中克隆CsSDIR1的全长cDNA序列及启动子序列,对其生物信息学特征进行分析,并采用qRT-PCR技术检测该基因的组织表达特异性及在不同逆境胁迫下的表达模式.结果显示,CsSDIR1基因的开放阅读框(ORF)长831 bp,编码276个氨基酸,蛋白质分子量(Mr)为30.085×103,理论等电点为6.54;氨基酸序列分析表明,CsSDIR1属于疏水性蛋白、定位在胞内膜上,与其他植物中的SDIR1相似性较高,在其N-端和C-端分别含有2个保守的跨膜结构域和C3H2C3 RING finger功能域;CsSDIR1与猕猴桃关系最近. CsSDIR1上游启动子含多个与干旱胁迫和盐胁迫响应相关的元件.表达分析显示,CsSDIR1在茎中的表达量显著高于根、叶和花;ABA、干旱和高盐诱导其表达,低温抑制CsSDIR1的表达.根据上述结果推测CsSDIR1基因可能参与了茶树的抗逆响应.     

甘蔗泛素结合酶基因的克隆与表达北大核心CSCD

为克隆鉴定甘蔗泛素结合酶基因（Sugarcane ubiquitin-conjugating enzyme,ScUBc E2）并探索其在激素信号通路和甘蔗与黑穗病互作过程中的作用,选择黑穗病菌胁迫下甘蔗抑制消减杂交文库（Suppression subtractive hybridization,SSH）中注释为泛素结合酶的差异表达EST序列为探针,结合电子克隆技术和RT-PCR技术,以甘蔗cDNA为模板进行泛素结合酶基因克隆.对克隆获得的序列进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR技术分析该基因在甘蔗根、蔗髓、叶、芽中的组织特异性表达以及在黑穗病菌、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,Me JA）、脱落酸（Abscisic acid,ABA）和水杨酸（Salicylic acid,SA）胁迫下的表达情况.最终克隆得到一条长度为699 bp的甘蔗泛素结合酶基因（ScUBc E2;Gen Bank accession number：KJ577594.1）,该基因包含长度为447 bp的完整开放读码框,编码148个氨基酸.生物信息学分析结果显示,ScUBc E2编码的蛋白分子量（Mr）为16.507×10^3;无信号肽,为碱性不稳定的亲水蛋白;包含4个α螺旋、4个β折叠和一些无规则卷曲;第15位氨基酸为泛素化位点,74-89位氨基酸为活性位点;在进化过程中与高粱泛素结合酶基因的亲缘关系最近.qRT-PCR分析结果表明,ScUBc E2基因组成型表达,但在芽中的表达量最高;其表达在甘蔗感黑穗病基因型ROC22中受到黑穗病菌胁迫的抑制,在黑穗病抗病基因型YC05-179中则先被抑制,后被诱导;ScUBc E2基因受MeJA及SA诱导表达,对ABA胁迫的响应不明显.本研究表明,甘蔗ScUBc E2基因在抗病基因型和感病基因型甘蔗中存在不同表达模式,可能参与甘蔗与黑穗病菌的互作过程,有望为抗病育种分子标记提供潜在基因资源;同时,该基因受MeJA和SA外源激素胁迫后的表达模式,可为泛素-蛋白酶体途径及激素调控的信号转导在甘蔗与黑穗病菌互作过程中的作用提供一定的理论依据.     

嗜水气单胞菌感染影响中国大鲵核因子45和90表达

为研究中国大鲵核因子45(NF45)和90(NF90)对嗜水气单胞菌感染的免疫响应,通过腹腔注射的方式感染健康的中国大鲵,并在感染后0、12、24、36和48 h分别收集大鲵不同组织,通过qPCR检测NF45和NF90在各个组织中的表达情况.结果显示,核因子NF45和NF90在正常大鲵的所测组织中均有表达,其中NF45基因的相对表达量在大鲵肌肉、胃、心脏和脾脏中保持较高水平,而在肝脏中的表达水平最低,并且心脏中的相对表达量约为肝脏中的5.57倍;而NF90基因的相对表达量在大鲵心脏、皮肤、肌肉和脾脏中保持较高水平,而在肠中的相对表达水平最低,其中心脏中的相对表达量约为肠中的6.27倍.在接种嗜水气单胞菌24 h后,大鲵皮肤、肝、脾和肾中的NF45相对表达水平明显上升,并且NF45在皮肤中的相对表达量是肠的6.55倍;而NF90的相对表达量在接种后也明显上升,并且在脾脏中的相对表达量是肠的9.28倍.NF45和NF90在皮肤、脾、肾和肝中的相对表达量随时间变化均呈现先升高后下降的趋势.在肝和肾组织中,NF45和NF90基因的相对表达量均在大鲵染菌24 h时达到最大值,而在脾组织中,均在大鲵染菌36 h时达最大值.在皮肤组织中,NF45的相对表达量在大鲵染菌24 h时达到最大值,而NF90在大鲵染菌12 h时达最大值.本研究表明在嗜水气单胞菌的刺激下,NF45和NF90均作出积极响应,结果可为研究NF45和NF90调控大鲵免疫响应机制提供重要的理论基础.(图6表1参49)     

重金属暴露铜锈环棱螺全组织均一化cDNA文库构建及表达序列标签特征分析

构建cDNA文库是寻找生物新功能基因的有效手段.采用SM ART技术构建了重金属铜和镉暴露铜锈环棱螺全组织均一化cDNA文库,文库库容为1.78×106克隆,重组率大于99%.从初始文库中随机挑取6000个克隆进行测序,获得5 473个高质量表达序列标签(ESTs)序列.经聚类分析得到3 961个Unigene(平均长...     

甘蔗泛素结合酶基因的克隆与表达

为克隆鉴定甘蔗泛素结合酶基因(Sugarcane ubiquitin-conjugating enzyme,ScUBc E2)并探索其在激素信号通路和甘蔗与黑穗病互作过程中的作用,选择黑穗病菌胁迫下甘蔗抑制消减杂交文库(Suppression subtractive hybridization,SSH)中注释为泛素结合酶的差异表达EST序列为探针,结合电子克隆技术和RT-PCR技术,以甘蔗cDNA为模板进行泛素结合酶基因克隆.对克隆获得的序列进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR技术分析该基因在甘蔗根、蔗髓、叶、芽中的组织特异性表达以及在黑穗病菌、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,Me JA)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)和水杨酸(Salicylic acid,SA)胁迫下的表达情况.最终克隆得到一条长度为699 bp的甘蔗泛素结合酶基因(ScUBc E2;Gen Bank accession number:KJ577594.1),该基因包含长度为447 bp的完整开放读码框,编码148个氨基酸.生物信息学分析结果显示,ScUBc E2编码的蛋白分子量(Mr)为16.507×10~3;无信号肽,为碱性不稳定的亲水蛋白;包含4个α螺旋、4个β折叠和一些无规则卷曲;第15位氨基酸为泛素化位点,74-89位氨基酸为活性位点;在进化过程中与高粱泛素结合酶基因的亲缘关系最近.qRT-PCR分析结果表明,ScUBc E2基因组成型表达,但在芽中的表达量最高;其表达在甘蔗感黑穗病基因型ROC22中受到黑穗病菌胁迫的抑制,在黑穗病抗病基因型YC05-179中则先被抑制,后被诱导;ScUBc E2基因受MeJA及SA诱导表达,对ABA胁迫的响应不明显.本研究表明,甘蔗ScUBc E2基因在抗病基因型和感病基因型甘蔗中存在不同表达模式,可能参与甘蔗与黑穗病菌的互作过程,有望为抗病育种分子标记提供潜在基因资源;同时,该基因受MeJA和SA外源激素胁迫后的表达模式,可为泛素-蛋白酶体途径及激素调控的信号转导在甘蔗与黑穗病菌互作过程中的作用提供一定的理论依据.     

中华猕猴桃‘红阳’Alase家族基因的克隆及表达分析

在高等植物中醛糖酸内酯酶(Alase)催化L-半乳糖酸(L-Gal A)形成抗坏血酸(Ascorbic acid,As A)的前体物质L-半乳糖-1,4-内酯(L-Ga IL),是As A合成分支途径D-半乳糖醛酸途径中的关键步骤.基于最新的猕猴桃基因组数据库,分离并克隆到3个Alase家族基因,分别命名为Alase1、Alase2、Alase3,并从基因信息、蛋白质理化性质、二级结构及序列特征方面对其进行预测及分析.结果表明,Alase为亲水性蛋白,二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主,3个Alase基因具有高度的相似性.定量RT-PCR分析表明3个Alase家族基因在不同组织中均有表达,且在成熟的叶片中表达量最高.同时在猕猴桃果实发育及成熟过程中,Alase家族基因在幼果中的表达水平较低,而在果实发育后期及果实成熟过程中表达量不断升高.本研究可为Alase家族基因后续功能研究及猕猴桃中As A生物合成和积累分子机制解析奠定基础.     

恒河猴piwil1基因的表达

为了解人类近亲恒河猴piwil1基因的结构、表达和功能差异,利用RT-PCR方法克隆了恒河猴piwil1基因,并对其编码产物进行了相应的生物信息学分析,随后检测了piwil1 mRNA在成年恒河猴10种组织中的表达情况,最后利用免疫组化方法比较了PIWIL1蛋白在成人、成年恒河猴和幼年恒河猴睾丸组织中表达的异同.结果表明,恒河猴piwil1基因全长2 586 bp,编码861个氨基酸,氨基酸数目与人类piwil1基因相同.恒河猴PIWIL1蛋白与人的PIWIL1蛋白序列同源性达99%,均含有PAZ结构域和Piwi结构域.在成人和成年恒河猴的睾丸组织中,PIWIL1蛋白均在精母细胞和精细胞的胞浆中表达,而在幼年恒河猴睾丸组织中,PIWIL1表达与成年恒河猴相比存在差异,表达量相对较低,且主要表达于生精小管的细胞的细胞核上.上述结果提示,PIWIL1蛋白在成人和成年恒河猴可能具有相同作用,但是在不同的发育阶段中PIWIL1蛋白的功能不同.     

香蕉MaPFK基因家族鉴定、MaPFK3克隆和表达

为研究香蕉中MaPFK基因的功能和生物学特性,采用生物信息学分析法对香蕉A基因组的MaPFK基因家族成员进行鉴定、蛋白特性分析、分子进化树分析、FPKM值分析,同时以‘天宝蕉’为材料,通过RT-PCR技术克隆MaPFK3基因,进行生物信息学分析;采用qRT-PCR技术进行低温胁迫下的表达分析.结果表明,MaPFK家族包含12个成员,分子进化树分析可分为3类,FPKM值分析表明MaPFK成员在13、4、0℃不同低温胁迫下有不同程度的上调或下调表达.采用RT-PCR技术克隆了MaPFK3,其基因编码区长1 617 bp,预测编码538个氨基酸,MaPFK3编码蛋白属于PFK超家族,是不稳定的酸性亲水蛋白,无信号肽,亚细胞预测定位于细胞质;MaPFK3启动子顺式作用元件预测分析结果显示,MaPFK3启动子含有光响应、激素响应以及与逆境胁迫相关的作用元件.qRT-PCR分析结果显示,香蕉MaPFK3基因的表达具有组织差异性,且表达量为叶片>假茎>根;低温胁迫引起‘天宝蕉’中MaPFK3基因下调表达,在13、4、0℃不同低温胁迫下,MaPFK3的表达量为13℃<4℃<0℃.本研究表明MaPFK基因家族成员能在香蕉应对低温胁迫的过程中发挥着重要作用.(图11表2参32)     

团头鲂谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及其在氨氮胁迫中的表达分析

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)是一类多功能蛋白家族,主要参与解毒和抗氧化防御过程。为了研究GST在团头鲂(Megalobrama amblycephala)肝脏解毒过程中的作用,克隆并分析了团头鲂1个谷胱甘肽S-转移酶基因(命名为MaGST)cDNA序列,采用实时荧光定量PCR研究了其在氨氮胁迫下的表达规律。MaGST包含1个长218个氨基酸的完整开放阅读框,具有GST蛋白家族的保守碱基和保守结构域。通过MEGA 5.0软件分析系统进化树发现,团头鲂GST与其他动物mu型GST聚为一簇,表明团头鲂GST属于mu型GST。荧光定量PCR结果显示MaGST基因在团头鲂各组织中均有表达,在肝脏和鳃中表达量最高,肌肉中表达量最低,同时在氨氮胁迫过程中该基因在肝和鳃中的表达规律相似,均在胁迫期间表达量显著上调;氨氮胁迫24 h时鳃和肝组织均存在组织损伤。研究结果提示在团头鲂肝脏和鳃组织中GST基因参与了氨氮胁迫的解毒过程。将该基因的编码区重组到p ET-21(a+)载体后在大肠杆菌中得到诱导表达,重组MaGST的GST活力为(10.36±0.68)U·mg~(-1)蛋白。     

麻疯树叶绿ω3脂肪酸脱饱和酶基因的克隆和鉴定

根据几个已知的植物ω3脂肪酸脱胞和酶基因序列,利用RT-PCR和RACE技术从麻疯树中克隆了一条编码叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶的cDNA序列.对该序列的分析表明,该cDNA的编码区长1 368bp,编码一个长度为455个氨基酸的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量(Mr)大小为52.1×103.同源分析显示,推测的氨基酸序列与其他物叶绿体脂肪酸脱饱和酶具有很高的相似性.RT-PCR分析表明,该基因在麻疯树叶片中有着稳定的表达.此外,还通过酵母表达系统鉴定了该基因编码的酶的功能.对转基因酵母的脂肪酸组成分析发现,α亚麻酸在转基因酵母中积累.上述结果表明,该麻疯树cDNA编码了一个叶绿体ω3脂肪酸脱饱和酶.     

水稻幼穗分化特异性启动子pRFL的克隆和特征分析

组织特异性启动子能够驱动基因在特定的时期和部位表达,克服组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费,是基因工程技术最重要元件之一.本研究利用PCR技术从水稻基因组中克隆了幼穗分化特异表达基因RFL翻译起始位点上游2 001 bp的启动子序列,命名为pRFL.生物信息分析显示,该片段含有36个转录起始核心启动子元件TATA-box和多个启动子增强子区顺式作用元件CAAT-box,以及多个光反应调控元件和植物激素响应元件等.将其与GUS基因构建成植物表达载体,导入水稻"日本晴",组织化学染色法检测显示,转基因水稻植株叶片、茎均无GUS显色,花序及发育中的小花有较强表达;荧光定量PCR测定幼穗GUS基因转录活性,显示pRFL驱动的GUS基因表达量比actin启动子驱动的GUS基因表达量高2.9倍.上述结果初步证明了pRFL为幼穗分化特异性启动子.     

龙眼胚性愈伤组织维生素C过氧化物酶基因(apx)及NADH脱氢酶基因(nad2)部分序列的克隆

采用PCR技术从龙眼胚性愈伤组织中扩增出维生素C过氧化物酶基因 (apx)的部分cDNA序列longan1及NADH脱氢酶基因(nad2)的部分cDNA序列longan31,其中longan31是首次从体胚中克隆到的NADH脱氢酶基因(nad2).杂交结果显示,longan1与胚性愈伤组织和球形胚的RNA具有明显杂交信号,说明longan1在胚性愈伤组织和球形胚阶段特异表达. 图 3参 19     

水稻arf1基因3′-UTR片段的克隆和验证

终止子是一段位于基因编码之后的序列,作为一种调控信号调控DNA的转录终止和RNA的释放,在基因工程技术应用中通常被构建在目的基因下游,用以调控基因的转录和表达.现有常用的终止子很少,克隆和验证新的终止子是植物基因工程技术发展的需要.通过生物信息学分析和Realtime-PCR表达验证,筛选出候选基因腺苷酸核糖基化作用因子(Similar to ADP-ribosylation factor1,arf1)基因,克隆了水稻arf1基因3′-UTR.结果显示,所克隆3′-UTR片段含有8个多聚信号元件和4个UE片段.将3′-UTR与gus基因融合后分别与玉米泛素启动子Ubiquitin和花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子35S连接构建植物表达载体验证3′-UTR调控表达效果.烟草瞬时表达显示3′-UTR融合的gus基因在35S和Ubi启动子驱动下,在烟草叶片中能正常表达;3′-UTR调控下的gus基因在水稻根、茎、叶、花和种子中均可稳定表达,且表达量与T-Nos终止子相当.本研究表明所克隆的3′-UTR可替代T-nos终止子,可为植物基因工程技术的应用提供新的调控元件.(图5表3参29)