基于苋菜转录组的ARF基因家族鉴定及表达

ARFs(auxin response factors)是重要的生长素响应因子,在植物的生长发育过程中起着关键的作用.基于‘大红’苋菜转录组数据,通过在线分析软件SMART和NCBI-Blastp的注释筛选苋菜ARF基因家族成员(AtrARF);利用生物信息学分析软件,对AtrARFs蛋白的理化性质、二级结构、亚细胞定位、保守氨基酸序列进行预测分析;构建系统进化树,预测可能调控AtrARF的miRNAs.分析AtrARF在蓝光和黑暗处理下苋菜胚轴中,及在不同种类及浓度的生长素处理下苋菜幼苗中的表达水平.分析结果表明,在苋菜中共鉴定得到29个ARF基因,其编码蛋白的长度在80-1 107 aa之间,蛋白分子量约为8.850×10³-123.300×10³,等电点在4.09-9.92之间.亚细胞定位预测结果均定位于细胞核,有15个保守氨基酸序列;系统进化树显示,29个AtrARF分为3个大组;MiRNA预测结果显示,至少有5个AtrARF家族成员受到miRNA调控.定量结果显示,AtrARFs在蓝光和黑暗、不同种类及浓度的生长素处理下表达模式均不相同.本研究表明AtrARFs受光质和生长素调控,在苋菜生长发育过程中发挥重要作用.(图8表4参34)     

小清河(济南段)支流内分泌干扰物综合激素效应分布特征研究

应用化学诱导荧光素酶表达基因法(chemical activated luciferase gene expression,CALUX)调研了小清河(济南段)主要支流的多种内分泌干扰物综合激素效应,明确了4类内分泌干扰物的含量水平及分布特征.结果表明,调研河流的二噁英类、雌激素类和肾上腺皮质激素类的年平均毒性当量浓度范围为0.020～0.040 ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1、0.007～0.050 ng E2-eq·L-1和1.8～9.6 ng Dex-eq·L-1.二噁英类和雌激素类的含量水平相对较低,雄激素类内分泌干扰物的污染风险较低,肾上腺皮质激素类是其内分泌干扰物污染的最大贡献者.二噁英类检出水平无明显的季节性和区域性差别,雌激素类季节性变化明显,春、冬两季检出率高,肾上腺皮质激素类分布的季节性分布不明显,但区域性分布规律明显,农业区支流的检出频次和含量水平明显低于居民区和商业区支流.     

苏云金芽胞杆菌YBT-1520中SigL及其增强子结合蛋白的结构与功能分析

为揭示SigL及其增强子结合蛋白(EBPs)在苏云金芽胞杆菌(Bt)中的调控功能,在全基因组测序的基础上,采用生物信息学方法,对YBT-1520菌株的SigL及其EBPs的结构和功能进行深入分析.结果表明,YBT-1520基因组中存在1个SigL和6个EBPs,而且EBPs在结构上具有丰富的多样性,包含了EBPs的所有可能的结构域组织类型.SigL所调控的基因涉及11个假定的COG代谢途径,其中包括能量代谢、氨基酸代谢、翻译与细胞周期等.根据EBPs在基因组的位置推测,YBT-1520的EBPs参与γ-氨基丁酸代谢途径、精氨酸代谢途径、支链脂肪酸降解途径、多糖分解代谢等代谢途径的调控.本研究将为揭示Bt杀虫晶体蛋白大量表达的调控机制提供新的思路.     

大肠杆菌植酸酶在毕赤酵母中的表达与纯化

为探讨植酸酶的结构与功能,研究了来源于大肠杆菌的植酸酶基因在酵母中的表达和纯化条件.将含有大肠杆菌植酸酶基因的毕赤酵母工程菌在不同甲醇浓度和不同诱导时间下培养,检测植酸酶的表达情况.结果表明:诱导培养基中一次性添加2.5%的甲醇,诱导96 h后,蛋白浓度达到1.36 mg mL-1,酶活力达到6 530 U mL-1;将在毕赤酵母中表达的植酸酶粗酶液经过硫酸铵盐析、Resource S柱和Superdex-75三步纯化,得到单峰纯的蛋白,比活力为137 280 Umg-1.用圆二色谱分析纯化后的蛋白在pH 5.0和8.0环境中的结构变化,结果显示pH 8.0环境使大肠杆菌植酸酶发生了变性.图3参16     

角蛋白酶产生菌的分离鉴定及其kerC的克隆表达

以四川农业大学养鸡场堆砌废弃羽毛处土壤为样品,筛选出一株具有较强降解羽毛能力的细菌B-3菌株.经形态学、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为枯草芽孢杆菌B-3.并成功克隆到该菌株的角蛋白酶基因kerC(GenBank No.:JN021789),在大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中获得了高效表达.该基因全长1146bp,GC含量46.5%,编码381个氨基酸,与已报道的枯草芽孢杆菌YYW-1的kerC基因(GenBank No.: EU362730)同源性达到100%.重组菌株经IPTG诱导后角蛋白酶酶活力达14.8U/mL,经His-Tag纯化和SDS-PAGE分析表明,重组角蛋白酶分子量约为60kDa(融合了硫氧还蛋白,Trx).重组角蛋白酶最适反应温度和pH值分别为65℃与7.0.     

全期表达外源基因的重组杆状病毒

构建了含早期、晚期、极晚期启动子、全期表达ＨＢｓＡｇ 基因的重组杆状病毒ｖＴｎＮＰＶＰ３５ＨＢｓＯＣＣ＋ ．结果ＨＢｓＡｇ 表达时间由感染后１２ ｈ 提前到４ ｈ,而其表达量,特别是病毒感染早期的表达水平亦显著提高,其中２４ ｈ 和９６ ｈ 的表达量分别比对照提高１８０ ％ 和６０ ％ ． 转录起始位点分析结果显示,该重组毒株可在病毒感染的早、晚期形成多个转录本     

群体感应现象及其在生物膜法水处理中的应用

群体感应是指细菌通过感知分泌到环境中自诱导物浓度的变化来调整基因表达,增强其在复杂环境中的生存能力,是细菌行为社会化的体现.研究者对群体感应的微生态凋控机制进行了深入的探讨,包括自诱导物的合成、运输和对目的基因的表达调控,以及各信号通路之间的竞争关系对细菌适应环境的影响.本文分析了当前相关研究中的热点问题,提出了群体感应机制在生物法水处理领域中的潜在应用方式.图2参32     

产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB)的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最重要的用途是作为合成聚酯PTT的单体.由于微生物发酵法生产1,3-PD具有操作简单,不易产生有毒副产物等特点,已得到广泛关注.本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用温控表达载体pBV220串联构建了重组质粒pBV220-yqhD-dhaB,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB).该重组菌在LB培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得胞内甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力分别达到260 U/mg蛋白和140U/mg蛋白;在含甘油40 g/L的发酵培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得发酵液中1,3-PD含量为8.5 g/L.这将为进一步构建基因工程菌生产1,3-PD打下坚实的基础.图6表1参18     

小麦TaMyb2基因转化拟南芥表达载体的构建与遗传转化

采用双酶切方法构建了小麦TaMyb2基因转化拟南芥表达载体pCHF3-35Sp-TaMyb2-I-NOSter和pCHF3-35Sp-TaMyb2-Ⅱ-NOSter.并通过农杆菌GV3101介导,用渗透法将TaMyb2-Ⅰ和TaMyb2-Ⅱ基因转入拟南芥中.结果表明,TaMyb2-Ⅰ、TaMyb2-Ⅱ和表达载体pCHF3分别被KpnⅠ和PstⅠ成功酶切为837 bp、840 bp和10.4 kb的目标条带;分别将pCHF3-35Sp-TaMyb2-Ⅰ-NOSter和pCHF3-35Sp-TaMyb2-Ⅱ-NOSter转入农杆菌GV3101中,在提取的农杆菌质粒DNA中分别扩增出了837 bp和840 bp目标条带,说明可用于拟南芥的转化;在含Kan(50 mg/L)的1/2 MS培养基上筛选转基因当代拟南芥植株的种子(T0),获得了T1代抗性植株,转化率约为0.1%.     

假单胞菌表达载体pYMB03的构建与性能分析

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是具有强抗逆性能的环境优势菌,构建其质粒表达载体有着明显的应用潜力.将恶臭假单胞菌AB92019菌株中肽聚糖相关脂蛋白编码基因的启动子PoprL和质粒载体pTrcHis-B的多克隆位点片段插入到质粒载体pUCPl8的EcoRL/HInIII位点,获得了重组载体pYMB03.用绿色荧光基因gfp作为标记进行外源蛋白表达的结果表明,该载体能分别在恶臭假单胞菌AB92019菌株和大肠杆菌DH5a菌株中,由启动子PoprL启动组成型表达GFP蛋白并使细胞产生可见荧光.经SDS-PAGE验证,所产生的GFP蛋白分别占细胞总蛋白的12.5%和5.O%.重组菌株YMB001中GFP表达量与菌体培养时间有关,在稳定期后期其相对荧光强度达到最大值(D600nm=l.0),但与培养温度未见相父性.对携带该载体的2株重组恶臭假单胞菌7次168 h继代培养测定,载体pYMB03的稳定性均为100%.