长期施用猪粪水稻土抗生素抗性基因污染研究

为了全面研究猪粪有机肥对水稻土抗生素抗性及分布格局的影响,选择295对抗生素抗性基因引物,采用高通量荧光定量PCR对水稻土中的抗生素抗性基因污染情况进行了研究.结果表明,未施用猪粪水稻土检测出66种抗性基因,而施用猪粪水稻土则检测出107种抗生素抗性基因,施用猪粪后水稻土中抗生素抗性基因种类显著增加(P<0.05).相对于未施用猪粪水稻土,施用猪粪水稻土有49种抗生素抗性基因丰度显著增加(P<0.05),其中施用猪粪水稻土中喹诺酮类/氯霉素类抗性基因的mexF的丰度相对于未施用猪粪水稻土增加1791倍.高通量定量结果表明,施用猪粪的水稻土抗生素抗性基因分布格局发生显著变化,高通量定量技术是研究环境抗生素抗性基因的一个非常实用的工具.     

Development and Integration of Quantitative Real-Time PCR Methods for Detection of Mitochondrial DNA and Methanobrevibacter smithii nifH Gene as Novel Microbial Source Tracking Tools

A novel microbial source tracking (MST) method based on the detection of human and non-human markers was developed and applied to track the origin of fecal pollution in water systems. Mitochondrial DNA sequences were used to develop new quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) assays for dog, poultry, and gull. The targets were included as part of a toolbox including human, cow, pig, and sheep assays. A primer and probe set for the detection of the human-specific nifH gene of Methanobrevibacter smithii was also designed as an indicator of human fecal contamination. The assays were tested for specificity and applied to fecal-spiked surface waters and environmental samples collected from two river catchments impacted by sources of human and non-human fecal contamination. The MST methods described were applicable to both spiked waters and environmental samples, and using the two approaches the origin of fecal pollution could be successfully determined in mixed source fecally polluted waters.     

分层型水库水体好氧不产氧光合细菌时空演替特征

好氧不产氧光合细菌（aerobic anoxygenic photosynthesis bacteria,AAPB）以多样的群落结构及独特的代谢功能在水体物质循环中扮演着重要角色.基于实时荧光定量PCR及Illumina MiSeq高通量DNA测序技术研究金盆水库水体中AAPB丰度及群落结构时空演替特征,结合冗余分析揭示环境因子对其群落结构影响规律.结果表明,金盆水库水体AAPB丰度（以pufM基因计）变化范围为（6.70±0.43）×10³~（2.69±0.15）×10⁴ copies·mL^-1,最大值出现于10月,且随水深增加而减小.样本主要归为19个属（除未分类菌属外）,优势AAPB菌属包括慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium sp.）和甲烷菌属（Methylobacterium sp.）,两者隶属α-变形菌（α-Proteobacteria）,其中慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium sp.）占比于11月最高,高达60%以上（除10 m外）,此外也发现了以低比例存在的红长命菌属（Rubrivivax sp.）,隶属β-变形菌（β-Proteobacteria）.AAPB不同属间存在较强的互作关系,如红杆菌属（Rhodobacter sp.）与小红卵菌属（Rhodovulum sp.）呈正相关,噬氢菌属（Hydrogenophaga sp.）与慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium sp.）呈负相关等.AAPB种群结构组成及分布差异显著,主要受T、TN、NO₃^--N和光照强度影响,且由环境因素综合调控.如10月水深0、5和15 m水体AAPB种群结构受水温（T）、总氮（TN）和总磷（TP）显著影响,12月水深5 m水体AAPB种群结构受光照强度、pH、溶解氧（DO）和叶绿素a（Chla）显著影响等.研究结果对解析分层型水库水体AAPB丰度和多样性的时空变化特征具有指导意义,并为探索AAPB种群结构的水环境驱动因素提供理论依据.     

长江口近岸地区抗生素抗性基因与微生物群落分布特征

由于抗生素的大量使用,环境中微生物对抗生素的抗性不断增加,抗生素抗性基因(ARGs)问题越来越严重,严重威胁生态安全和人类健康.为研究长江口近岸地区水体和底泥沉积物中的ARGs和微生物群落的分布特征,通过野外调查采集了8个站点的水样和沉积物样本,对2种磺胺类抗性基因(sul1、sul2)、6种四环素类抗性基因(tetM、tetC、tetX、tetA、tetO、tetQ)、1种整合子基因intI1、16S rRNA基因和微生物群落进行检测分析.结果表明,长江口近岸地区10种抗性基因的检出率为100%.其中,整合子基因intI1和水样中多种ARGs呈显著正相关关系.变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)是长江口近岸地区水环境中的优势菌门;Chloroplast为水体中的主要菌属,Chloroplast和Nitrospira为沉积物中的主要菌属.在水体中,硝化螺旋菌门(Nitrospirota)是4种四环素类抗性基因(tetX、tetA、tetO和tetQ)共同的潜在宿主;在沉积物中,Sva0485是sul1和intI1的共同潜在宿主.微生物群落的分布...     

微生物有机肥对樱桃园土壤细菌群落的影响

采用田间试验,探究微生物有机肥对樱桃园土壤细菌群落的影响.利用高通量测序和实时定量PCR技术,研究不施肥（CK）、常规施肥（CN）和施微生物有机肥（CB）处理土壤细菌数量、多样性和群落结构的变化.结果表明,施微生物有机肥显著提高了土壤有机质、全氮、碱解氮和速效磷含量.结合16S rRNA基因拷贝数和α^-多样性指数结果,发现施微生物有机肥能提高细菌数量,且提高细菌多样性和丰富度.不同施肥处理显著改变了细菌群落结构.门水平上,变形菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门、放线菌门为优势类群,共占细菌总量的74.3%~85.1%.目水平上,CB处理中Acidobacteria_Gp4和Gp6相对丰度显著低于CK处理,而Acidobacteria_Gp7较CK处理增加了75.4%.冗余分析结果表明,环境因子解释了细菌群落变化的92.3%,土壤有机质、全氮含量和pH值是造成樱桃园土壤细菌群落结构差异的主要原因.因此,施用微生物有机肥能显著提高土壤养分含量、土壤细菌数量及群落多样性,对于培肥地力极为重要.     

Evaluation of bacterial pathogen diversity, abundance and health risks in urban recreational water by amplicon next-generation sequencing and quantitative PCR

The microbial quality of urban recreational water is of great concern to public health.The monitoring of indicator organisms and several pathogens alone is not sufficient to accurately and comprehensively identify microbial risks.To assess the levels of bacterial pathogens and health risks in urban recreational water,we analyzed pathogen diversity and quantified four pathogens in 46 water samples collected from waterbodies in Beijing Olympic Forest Park in one year.The pathogen diversity revealed by 16 S r RNA gene targeted next-generation sequencing(NGS) showed that 16 of 40 genera and 13 of 76 reference species were present.The most abundant species were Acinetobacter johnsonii,Mycobacterium avium and Aeromonas spp.Quantitative polymerase chain reaction(q PCR) of Escherichia coli(uid A),Aeromonas(aer A),M.avium(16S r RNA),Pseudomonas aeruginosa(oaa) and Salmonella(inv A) showed that the aer A genes were the most abundant,occurring in all samples with concentrations of 10~(4–6) genome copies/100 m L,followed by oaa,inv A and M.avium.In total,34.8% of the samples harbored all genes,indicating the prevalence of these pathogens in this recreational waterbody.Based on the q PCR results,a quantitative microbial risk assessment(QMRA) showed that the annual infection risks of Salmonella,M.avium and P.aeruginosa in five activities were mostly greater than the U.S.EPA risk limit for recreational contacts,and children playing with water may be exposed to the greatest infection risk.Our findings provide a comprehensive understanding of bacterial pathogen diversity and pathogen abundance in urban recreational water by applying both NGS and q PCR.     

梅花鹿养殖场抗生素抗性基因分布特征

梅花鹿养殖是近年来我国南方地区出现的新兴养殖业.为探究梅花鹿养殖对养殖环境抗生素抗性基因的影响,采用高通量荧光定量PCR研究了抗生素抗性基因在养殖场区对照土壤、梅花鹿新鲜粪便、梅花鹿粪便堆肥产物和施用堆肥菜地土壤中的分布、丰度和多样性.结果表明,抗性基因的绝对丰度梅花鹿粪便堆肥产物梅花鹿新鲜粪便施用堆肥菜地土壤养殖场区对照土壤,抗生素抗性基因在4种环境样品中具有不同分布格局;梅花鹿养殖场环境中抗性基因丰度与可移动基因元件丰度显著相关(P0.05),表明可移动基因元件可能加快了抗性基因的水平转移过程,促进了抗性基因的迁移、传播和富集,加剧了养殖环境抗生素抗性基因污染.     

若尔盖花湖沉积物氨氧化与反硝化功能基因丰度垂向分布特征及其环境响应

若尔盖湿地作为中国最大的泥炭沼泽区,是生物地球化学循环的重要场所.本文以若尔盖湿地的花湖为研究对象,采集0～47 cm的沉积物样品,通过实时荧光定量PCR(qPCR)技术,探究沉积物中氨氧化(amoA)和反硝化(nirS、nirK、nosZ clade I)功能基因丰度的垂向分布特征,及其对环境因子的响应.结果表明:花湖沉积物中古菌amoA基因丰度在垂向分布上呈下降趋势,而nirS基因丰度呈上升趋势;古菌和细菌的amoA基因丰度相近,nirS基因丰度则远高于nirK基因,且氨氧化功能基因丰度整体上比反硝化功能基因低1～2个数量级.总氮(TN)、总磷(TP)、氨态氮(NH~+_4-N)、硝态氮(NO~-_3-N)和亚硝态氮(NO~-_2-N)与古菌amoA基因丰度均呈显著正相关关系(p0.05),而与nirS基因丰度呈显著负相关关系(p0.05).这两种功能基因明显受到花湖沉积物中不同形式氮素浓度的影响与限制.通过研究花湖沉积物氨氧化与反硝化功能基因的垂向分布特征及其对环境的响应,可为深入了解高原湖泊沉积物中的氮循环机理提供参考.     

连续流亚硝化中试反应器的启动及其能力提升

通过接种污水处理厂压滤后污泥,添加悬浮填料进行挂膜,采用连续流反应器处理模拟氨氮污水,对反应器的游离氨(FA)、游离亚硝酸(FNA)以及溶解氧(DO)进行调控,实现了中试亚硝化反应器的成功启动.结果表明,通过前期高DO,后期低DO的运行模式,并对反应器运行过程中的FA、FNA进行调控实现了AOB的富集和NOB的淘汰,启动成功后反应器内部亚硝酸盐产生速率(NPR)达到1.27 kg·(m~3·d)~(-1),亚硝酸盐积累率(NAR)也稳定在98%.采用实时荧光定量PCR方法(quantitative real time PCR,q PCR)对启动初期和成功启动后反应器中的功能微生物(AOB、NOB)进行分析,q PCR结果表明反应功能微生物AOB的拷贝数从启动初期的5.3×10~9copies·m L~(-1)增长到1.6×10~(11)copies·m L~(-1),NOB的拷贝数反而从1.1×10~(10)copies·m L~(-1)下降到1.2×10~9copies·m L~(-1),AOB拷贝数的数量级比NOB的要高2个数量级,这也是在启动过程中通过DO、FA、FNA等措施对NOB联合抑制的作用.