利用木质纤维素类生物质发酵生产乙醇重组菌株研究进展

要实现木质纤维素类生物质的有效利用,当前还面临很多瓶颈问题亟待解决,而缺乏能够同时高效利用纤维素类水解物的发酵菌株是制约纤维素乙醇生产的最关键因素.目前对发酵菌种的研究主要集中在酿酒酵母、运动发酵单胞菌、大肠杆菌和克雷白氏杆菌这4种菌上,已取得大量研究进展,为纤维素乙醇的产业化奠定了一定的基础.本文综述了这4种菌发酵纤维素水解物的基因工程改造研究进展,并对组学时代进一步优化发酵菌株进行了展望.图2表2参51     

甲醛修饰酿酒酵母对铀的吸附研究

采用批次实验方法探究了甲醛修饰酿酒酵母对铀的生物吸附过程.结果显示,甲醛修饰能显著提高酵母对铀的吸附能力,其吸附量是同等实验条件下活酵母的6倍,动力学研究表明,达到吸附平衡仅需90 min,并且能较好地符合准二级动力学吸附模型.实验的最佳吸附pH为5.8.Langmuir和Freundlich模型均能用于拟合实验数据且实验结果与Langmuir模型更加吻合.扫描电镜和傅里叶变换红外光谱分析结果表明,甲醛修饰改变了细胞的表面形貌和蛋白结构,使氨基发生了甲基化,羟基形成配位共价键,在酵母吸附铀后,细胞表面不均匀地附着了一层鳞片状的铀沉淀.铀沉淀与络合物的形式多种多样,且与羧酸盐主要络合物为双齿配体结构,甲醛修饰酿酒酵母与铀酰离子相互作用存在着络合,沉淀以及静电吸附等多种机理.     

酿酒酵母吸附Pb(Ⅱ)的表面特性研究

为深入探讨酿酒酵母与Pb(II)的相互作用机理,本文利用表面显微分析技术（SEM-EDS、TEM-EDS、AFM）研究了酿酒酵母细胞吸附重金属离子Pb(II)前后的细胞表面特性变化。研究结果表明,酿酒酵母细胞与Pb(II)作用后,细胞表面除吸附Pb(II)外,同时产生大量更高浓度的含Pb(II)沉淀,导致Pb(II)从溶液中被去除。酵母与Pb(II)反应前,酵母细胞表面可检测到的主要元素包括C、O、N、P、S、K、Mg;酵母与Pb(II)作用后,细胞表面始终保持C、O、P吸收峰,而N、K、Mg、S吸收峰随反应条件不同而减弱、消失或增强。P作为细胞表面组分可能与Pb(II)结合。酵母与Pb(II)作用过程中,重金属离子促进酵母细胞释放细胞内含物。原子力显微镜（AFM）证实,云母片表面对酵母吸附Pb(II)后细胞的铺展变形作用明显增大。     

酿酒酵母与热带假丝酵母融合子多功能性研究

由单亲株灭活法获得的酿酒酵母与热带假丝酵母原生质体融合而成的杂种酵母细胞，在净化味精废水产生单细胞蛋白方面优于双亲菌株，该杂种细胞以无菌液体石腊复盖，存放于４℃冰箱一年之后，测定其菌体的比增长率，对淀粉的利用率，耐热性能，絮凝性能和菌体蛋白的水平，同时与双亲株的同类指标进行比较，发现该杂种酵母细胞仍然综合了双亲的优势，显示出多功能性的特征，为提高废水的净化效率，增加单细胞蛋白的产量，创造了极为有利     

酿酒酵母与Ag+的相互作用机制研究

为探讨酿酒酵母与Ag+的相互作用机制,分析了酵母吸附Ag+过程中细胞阳离子的释放状况,并利用红外光谱(FTIR)、带能谱仪的扫描电镜(SEM-EDX)、带能谱仪的透射电镜(TEM.EDx)等手段表征了酵母细胞在吸附Ag+前后表面官能团的变化以及Ag+在酵母细胞中的存在位置和状态.结果表明,酵母细胞吸附Ag+伴随着大量细胞阳离子K+、Na+、Mg2+、Ca2+的释放.Ag+的存在会抑制体系pH值增加,并促进Mg2+、Ca2+的释放.与Ag+的吸附类似,K+、Na+、Mg2+、Ca2+的释放也很快,并且符合准二级动力学方程.酵母对Ag+的吸附,可被认为是离子交换机制和共价结合机制共同发挥作用FTIR证明酵母表面羧基对Ag+的吸附发挥重要作用.电镜分析结果表明,酵母细胞表面不仅吸附了Ag+,同时产牛更高浓度的含Ag沉淀物,使Ag+从溶液中去除,这些含Ag沉淀不均匀地分布于细胞表面,含Ag沉淀的性质以及形成过程还需要借助其他分析手段进行进一步确认.     

绿色木霉AS3.3711的葡聚糖内切酶Ⅲ基因的克隆与表达

为研究构建可降解纤维类固体废弃物的工程菌,采用RT-PCR方法克隆到绿色木霉(Trichoderma viride)AS3.3711的葡聚糖内切酶Ⅲ(EGⅢ)的cDNA 基因,测序后构建到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)诱导型表达载体pYES2 上,用正交实验对超声波辅助酵母转化系统进行了优化.转化获得的EGⅢ转化子用2%的β-D-半乳糖诱导,用Northern 杂交、刚果红染色法和CMC糖化力法分别对目的基因的转录和表达产物的葡聚糖内切酶活性进行检测.结果表明, EGⅢ的cDNA 基因开放阅读框长度为1254bp,编码418个氨基酸,推测蛋白质分子量为44.1×103.正交实验中较优组合为第5组(超声波处理60s,温育40min,单链DNA 150μg,热激5min); 刚果红染色显示,转化子可产生明显的水解圈;CMC酶活检测显示该基因能在酿酒酵母中表达有生物活性的EGⅢ并分泌到胞外,发酵液中的酶活在培养60h达到最高0.041 U/mL;最适酶解温度为50℃;最适pH 值为5.8.     

重金属离子的生物吸附容量与离子性质之间的关系

利用金属离子毒性评价和预测领域中的QSAR方法,探讨了重金属离子性质对生物吸附容量的影响．选用啤酒工业废弃的酿酒酵母为生物吸附剂,进行了10种金属离子Ag^＋,Cs^＋,Zn^＋,Pb^2＋,Ni^2＋,Cu^2＋,CO^2＋,Sr^2＋,Cd^2＋,Cr^3＋的生物吸附实验．选用22种参数来表征金属离子的物理化学性质,建立了金属的离子特性与生物吸附容量之间的关系．利用Langmuir方程计算得到酵母吸附金属离子的理论最大吸附量qmax,由大到小排序为Pb^2＋〉Ag^＋〉Cr^3＋〉Cu^2＋〉Zn^2＋〉Cd^2＋〉Co^2＋〉Sr^2＋〉Ni^2＋〉Cs^＋．离子性质与吸附量之间的线性拟合分析结果表明,共价指数Xm^2r与qmax具有良好的线性关系,共价指数越高,离子吸附量越大,金属离子与吸附剂表面官能团共价结合所占比重越大,键结合越牢固．对金属离子进行分类（按价态或离子的软硬性质）可以改善拟合效果．极化力Z^2／r、水解常数｜lgKOH｜、电离势,尸等多种物化性质与不含软离子的离子之间的理论最大吸附量也表现出良好的线性关系．     

酿酒酵母生物吸附Cu2+的动力学及吸附平衡研究

研究了重金属离子Cu2 在酿酒酵母上的生物吸附特性,内容包括生物吸附动力学、吸附等温线以及pH对生物吸附的影响.生物吸附动力学结果表明,当Cu2 初始浓度为71.6mg/L时,Cu2 在酿酒酵母上的生物吸附过程可以分为两个阶段,第一阶段为物理吸附,在10min内达到平衡,此后,随着时间的延长,有微量脱附现象发生.Cu2 在酵母上的吸附过程可以很好地用准二级动力学方程来描述(R2=0.9984),动力学参数k2为7.65×10-3g mg-1min-1,qe为9.15mg/g.吸附等温线结果表明,Cu2 在酿酒酵母上的生物吸附可以用Langmuir和Freundlich方程来描述,最大吸附量qmax为10.2mg/g·pH为5.0时Cu2 在酿酒酵母上的吸附量最大.酿酒酵母可用于处理低浓度含Cu2 的废水.     

高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统的构建与应用

利用PCR-mediated Technique对酿酒酵母W303-1A金属硫蛋白基因(cup1)进行敲除,获得一株铜离子敏感型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A cup1△),其对Cu2+抑制浓度由1.2 mmol/L降为0.08 mmol/L;以pYX212载体为基本构架,以S.cerevisiae W303-1A cup1△为宿主菌,构建了以cup1作为筛选标记的pYX212M表达系统,并成功表达了绿色荧光蛋白基因(gfp),从而实现了高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统的构建与应用.本研究构建的高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统不仅廉价、安全,而且丰富了酵母的表达系统,同时对微生物的铜抗性机理及生物修复功能的研究具有指导意义.     

稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母工程菌初步构建

分别克隆了休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)的木糖还原酶基因XYL1和热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖醇脱氢酶基因XYL2,构建出重组表达质粒pACT2-xy11和pDR195-xy12,并使其分别转化酿酒酵母受体细胞.酶活测定结果显示,转化子中木糖还原酶和木糖醇脱氢酶均在宿主菌中得到活性表达.并将这两个基因连同各自重组表达质粒上的表达元件进行了克隆,进而构建出重组酵母染色体整合质粒YIp5.kanR-x12,以期今后通过同源重组的原理将上述基因整合到发酵性能良好的酿酒酵母基因组中,得到稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酵母菌株.图3表1参15