嗜热子囊菌光孢变种内切葡聚糖酶Ⅰ基因在毕赤酵母中的表达及部分酶学性质

嗜热子囊菌是一种嗜热真菌,可以产生具有很高工业价值的内切葡聚糖酶.本研究成功表达了嗜热子囊菌内切葡聚糖酶Ⅰ基凶,并获得热稳定的重组内切葡聚糖酶.提取嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)总RNA,通过RT-PCR方法克隆出内切-β-葡聚糖酶eg1基因的成熟肽编码序列.采用基因重组的方法构建该基因的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K-eg1,经线性化后采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,大量筛选后获得高效表达内切葡聚糖酶Ⅰ的毕赤酵母工程菌株GpN24.该菌株采用甲醇诱导120 h后,内切葡聚糖酶Ⅰ的活力可达570.7 U/mL,最适温度为55℃,在90℃的条件下保温30 min后仍具有60%的酶活力;最适pH为5.0,在pH 3.0～5.0的条件下酶活力保持稳定.图6表2参16     

嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)RNA中通过RT-PCR克隆出β-葡萄糖苷酶基因bgl Ⅰ的全长序列,cDNA序列为2 672 bp.Genbank登录号为EU269025,将该片段插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K/bgl,经线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,在醇氧化酶AOXI基因启动子作用下,获得高效表达β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌株.经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析纯化了该重组表达蛋白.SDS-PAGER测得该重组蛋白相对分子质量(M)约为120×103.经甲醇诱导,培养基中β-葡萄糖苷酶的活力可达1.2 U/mg,小规模发酵量达0.45 mg/mL.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0.于70℃保温30 min仍保持80%的酶活力,具有较高的热稳定性,在pH 3.0～9.0的条件下酸碱耐受性强.图6表1参22