嗜热子囊菌光孢变种内切葡聚糖酶Ⅰ基因在毕赤酵母中的表达及部分酶学性质

嗜热子囊菌是一种嗜热真菌,可以产生具有很高工业价值的内切葡聚糖酶.本研究成功表达了嗜热子囊菌内切葡聚糖酶Ⅰ基凶,并获得热稳定的重组内切葡聚糖酶.提取嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)总RNA,通过RT-PCR方法克隆出内切-β-葡聚糖酶eg1基因的成熟肽编码序列.采用基因重组的方法构建该基因的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K-eg1,经线性化后采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,大量筛选后获得高效表达内切葡聚糖酶Ⅰ的毕赤酵母工程菌株GpN24.该菌株采用甲醇诱导120 h后,内切葡聚糖酶Ⅰ的活力可达570.7 U/mL,最适温度为55℃,在90℃的条件下保温30 min后仍具有60%的酶活力;最适pH为5.0,在pH 3.0～5.0的条件下酶活力保持稳定.图6表2参16     

利用纤维二糖的酵母工程菌构建

以扣囊复膜孢酵母染色体DNA为模板,通过PCR方法扩增到其β-葡萄糖苷酶基因bgl1,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切并和经相同酶切的穿梭表达载体pYX212连接,构建了重组质粒pYX-sbgl,转化酿酒酵母W 303-1A,bgl1基因获得了活性表达,β-葡萄糖苷酶活力为0.504 IU/mL.转化子能以纤维二糖为唯一碳源生长,并能应用于同时糖化和发酵纤维素底物生产乙醇,使乙醇产量较宿主酵母有了一定的提高.图6表1参14     

黑曲霉耐热木聚糖酶XYNB在毕赤酵母中的高效表达

高比活木聚糖酶的高效表达是进一步提高木聚糖酶发酵效价、降低生产成本的有效途径.将黑曲霉木聚糖酶基因XynB(不含信号肽)克隆到分泌型表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,G418和PCR鉴定的阳性转化子经0.5%甲醇、在28℃诱导表达.SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为20×103左右.优化的诱导表达条件为,每隔12 h添加0.5%的甲醇,发酵5 d后,比活达4 757 U/mg;其最适温度为55℃,最适pH为5.0,80℃处理30min后仍有74%的残余酶活.     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的筛选、克隆及表达

从曲霉属10株试验菌中筛选得到一株产β-葡萄糖苷酶活性较高的黑曲霉FTA-008.该菌株在适宜的培养条件下,β-葡萄糖苷酶的最高活性达2.89 U/mL,适宜产酶周期为3 d.通过设计特异引物,以该菌株的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为2 511 bp的cDNA片段,该序列与GenBank中AJ132386的β-葡萄糖苷酶序列相比,氨基酸序列同源性达96.8%.经毕赤酵母表达,β-葡萄糖苷酶比活力达7.85 U/mg.图3表1参13     

β-甘露聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达

从Bacillus subtilis JNA 3-10中克隆出β-甘露聚糖酶基因成熟肽链编码序列manA1和含信号肽的β-甘露聚糖酶基因manA2,在B.subtilis 168中克隆表达,分别筛选获得高效分泌表达β-甘露聚糖酶的重组菌株BPM1001(pMA5-manA1/B.subtilis 168)和BPM1002(pMA5-manA2/B.subtilis 168),结果表明菌株BPM1002总酶活力是菌株BPM1001的9.65倍,是原始菌株的13.1倍.在基因manA2下游引入His序列克隆出β-甘露聚糖酶基因manA3,获得枯草芽孢杆菌168重组菌株BPM1003.采用Ni-NTA柱纯化重组菌株BPM1003分泌表达的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质,该酶促反应的最适pH为6.5,最适温度为65℃,在37℃条件下保存一个月酶活力依然保留有77.8%.5 L发酵罐放大实验结果表明魔芋粉对于产β-甘露聚糖酶具有明显的诱导作用,酶活力最高可达2 748.82 U/mL.图9表3参19     

热解糖高温厌氧杆菌β-葡萄糖苷酶的重组表达与酶学性质

β-葡萄糖苷酶是纤维素分解酶系中的重要组成部分,为从嗜热微生物中挖掘酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶,解决β-葡萄糖苷酶在工业应用方面普遍存在的活力偏低、稳定性不足、易受产物抑制等问题,通过密码子优化、基因合成和分子克隆技术,从热解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷酶基因bglY,构建重组表达载体pET22b-bglY,并转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,经IPTG诱导获得可溶性表达,采用Ni-NTA亲和层析法获得纯酶,并探究其酶学性质.结果显示,BglY属于GH1家族成员,分子量为52 × 10~3,最适反应温度65℃,70℃的半衰期达 1 h;最适反应pH 6.5,在pH 5-10范围内稳定;p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG)为底物时比活为420.2 ± 5.6 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率V_(max)分别为2.1 ± 0.4 mmol/L和909.1 ± 6.2 μmol min~(-1) mg~(-1);该酶对β-1,4糖苷键的底物具有水解偏好性,也可以水解纤维二糖和乳糖;5 mmol/L Fe~(3+)、Fe~(2+)、Cr~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)和EDTA对酶有激活作用,1% SDS完全抑制其活性;该酶可以抵抗产物葡萄糖的反馈抑制,且0.1-0.6 mol/L浓度的葡萄糖对酶具有激活作用,其中0.4 mol/L葡萄糖可提升活性至1.3倍,当葡萄糖浓度超过0.6 mol/L时,酶的活性才开始出现抑制.本研究表明BglY是一个葡萄糖激活型β-葡萄糖苷酶,其酶学性质优异,反应pH和温度范围较广且稳定,同时能水解天然底物纤维二糖和乳糖,可在提高纤维素生物质向葡萄糖的酶促转化等方面发挥应用潜力.(图7表3参32)     

黑胸散白蚁纤维素酶的体外酶学特性

采用DNS法研究了我国广泛分布的一种低等木食性白蚁——黑胸散白蚁纤维素酶的体外酶活特性以了解其纤维素降解机制.结果表明,内切β-1,4-葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)这3种酶的最佳反应时间均为15 min,最佳底物浓度为1%,最适反应pH为5.6,最适反应温度为35℃.在最适反应条件下,EG、CBH和BG的活性分别达到71.3(±13.9)U/mg、5.8(±0.8)U/mg和4.1(±0.7)U/mg.EG在体外的热稳定性较差,在50℃及更高温度酶活很低或完全失活,但该酶对pH稳定性较好,在pH 3.2～8.0范围内酶活力变化不大.Native-PAGE电泳检测到该白蚁体内至少有8种不同的EG活性条带,肠道不同部位纤维素酶活性条带种类不同.这些研究表明,木食性白蚁降解纤维素是一个复杂的过程,需要多种纤维素酶的共同作用.     

热紫链霉菌几丁质酶表达及低脱乙酰度壳寡糖制备

壳寡糖具有抗炎、抗肿瘤及激活植物免疫等一系列生物活性.与传统的高脱乙酰度壳寡糖相比,低脱乙酰度壳寡糖可能具有更高生物活性.表达热紫链霉菌几丁质酶基因并使用表达产物水解制备低脱乙酰度壳寡糖;优化并全基因合成热紫链霉菌几丁质酶基因,利用毕赤酵母进行分泌表达,对产物酶的性质进行鉴定;利用表达的几丁质酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖,使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(Ultra-performance liquid chromatography quadrupoletime-of-f lightmassspectrometry,UPLC-QTOFMS)对其组分进行分离及鉴定,使用核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)确定其末端结构特征.结果显示,表达的几丁质酶蛋白浓度为0.20 mg/mL,最适pH为5.6,最适温度为60℃,酶活为0.98 U/mL,该酶在80℃及以下时较稳定,该酶水解制备的低脱乙酰度壳寡糖中包含至少35种聚合度2-17、不同脱乙酰度的壳寡糖组分,这些组分的还原末端主要由N-乙酰氨基葡萄糖组成,非还原末端同时包含氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖.本研究表明毕赤酵母分泌表达的热紫链霉菌几丁质酶具有较好的热稳定性,具有应用于低脱乙酰度壳寡糖规模制备的潜力.(图4表1参22)     

无指盘臭蛙皮肤抗菌肽Odorgrin A真核表达载体的构建与转化

根据无指盘臭蛙(Odorrana grahami)皮肤抗菌肽Odorgrin A的氨基酸序列,合成了以酵母偏爱密码子编码的Odorgrin A基因片段.目的片段从合成质粒上用XhoΙ和EcoRΙ双酶切下后,与经同样限制酶酶切的pPIC9K载体连接而成表达载体pPIC9K-Odo A.PCR扩增、酶切及测序检测的结果表明表达载体构建成功.线性化的pPIC9K-OdoA经电击法转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115宿主菌,营养缺陷型筛选、遗传霉素抗性筛选、PCR扩增和测序检测的结果表明,表达载体pPIC9K-Odo A成功地转化并整合入酵母基因组.用甲醇对具遗传霉素G418高抗性的Odorgrin A重组酵母菌进行诱导表达,取酵母发酵液上清经SDS-PAGE电泳检测,结果初步表明,整合进酵母基因组的抗菌肽Odorgrin A基因已获得分泌表达,表达产物相对分子质量为3×103～4×103,与理论值相近.图10参17     

大肠杆菌植酸酶的原核表达及酶学性质

将大肠杆菌植酸酶appA摹因重组于表达载体pET32a中,导人大肠杆菌Origami(DE3)构建工程菌Origami(DE3)-pET32aappA.对表达的appA重组植酸酶经Ni柱亲和纯化、SDS-PAGE分析表明,纯化后条带单一,酶的纯度较高.对其酶学性质的研究表明,该酶反应的比活力为3.36×106 U/mg;最适pH为4.5;最适温度为60℃ ;在80℃和85℃的耐干热能力超过耐湿热能力;在37℃下,Mg2+、Ca2+、Mn2+对酶活性有促进作用,CO2+、Cu2+、K+对酶活性有不同程度的抑制作用,而Fe3+和Zn2+对酶活性有强烈的抑制作用;此外,该酶还具有非常好的抗胃蛋白酶水解的能力和部分抗胰蛋白酶水解的能力.图8表1参21     

大肠杆菌植酸酶在毕赤酵母中的表达与纯化

为探讨植酸酶的结构与功能,研究了来源于大肠杆菌的植酸酶基因在酵母中的表达和纯化条件.将含有大肠杆菌植酸酶基因的毕赤酵母工程菌在不同甲醇浓度和不同诱导时间下培养,检测植酸酶的表达情况.结果表明:诱导培养基中一次性添加2.5%的甲醇,诱导96 h后,蛋白浓度达到1.36 mg mL-1,酶活力达到6 530 U mL-1;将在毕赤酵母中表达的植酸酶粗酶液经过硫酸铵盐析、Resource S柱和Superdex-75三步纯化,得到单峰纯的蛋白,比活力为137 280 Umg-1.用圆二色谱分析纯化后的蛋白在pH 5.0和8.0环境中的结构变化,结果显示pH 8.0环境使大肠杆菌植酸酶发生了变性.图3参16     

近平滑假丝酵母NAD(H)依赖型次级醇脱氢酶的分离纯化及酶学性质

从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC 203011)中分离得到了NAD(H)依赖型的次级醇脱氢酶.粗酶经乙醇沉淀、Blue Sepharose Fast Flow亲和层析、DEAE Sepharose离子交换层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带,其酶蛋白的亚基分子量(Mr)为37.5×103.该酶还原反应的最适pH为6.0,最适温度为45℃,是一个含Zn2 金属酶.该脱氢酶具有较高的底物的选择性,对2-酮具有较高的还原活力;同时,也能作用于醇类发生氧化反应,对次级醇的氧化活力最高.以β-羟基苯乙酮为底物,用纯化得到的酶催化反应后,还原产物为(R)-苯基乙二醇,因此该酶为(R)-专一性次级醇脱氢酶,是一种生产(R)-苯基乙二醇的有效的生物催化剂.经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中3个肽段的氨基酸序列,通过比对发现该酶与NCBI编号为BAA24528的次级醇脱氢酶具有较高的同源性.图4表3参17     

乳酸片球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

与其它微生物相比,用大肠杆菌进行发酵生产乳酸有许多优势,但大肠杆菌没有L乳酸脱氢酶基因,不能利用糖发酵生产L乳酸.本文采用PCR技术,以乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)基因组DNA为模板,克隆得到L乳酸脱氢酶(Llactatedehydrogenase)基因,将该基因的ORF连接到表达质粒pET22b( ),获得重组质粒pETldhL.将pETldhL质粒转化大肠杆菌BL21株,实现了ldhL基因的表达;对含有ldhL基因的重组菌株进行表达研究,在30℃以IPTG诱导8h后,SDSPAGE分析可见明显特异性条带,酶活力达到6.49u/mL,是野生菌酶活力(2.82u/mL)的2.3倍.对重组表达的L乳酸脱氢酶生物学特性研究显示,它们的最适反应温度为27～30℃,最适反应pH为5.0～5.3.图5参15     

海洋微生物Fulvimarina manganoxydans磷酸酶FM2382的克隆表达及酶学性质

为促进海洋微生物及基因资源的开发应用,将海洋微生物Fulvimarina manganoxydans sp.nov.8047的磷酸酶基因fm2382在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达、纯化,并研究磷酸酶FM2382的酶学性质.设计引物从F.manganoxydans sp.nov.8047基因组DNA中扩增出磷酸酶fm2382基因,克隆至pET28(a)表达载体中,构建重组菌株,表达纯化后对磷酸酶FM2382的酶学性质进行分析.结果表明:磷酸酶FM2382最适反应温度为45℃,最适反应pH 7.1,70-80℃高温处理1 h后仍具35%左右的活力,在pH 7.1-9.0范围内具有较好的稳定性;金属离子对磷酸酶活力有不同程度的影响,其中Mg~(2+)、Mn~(2+)具有强烈的激活作用;K_m=1.42×10~(-3)mol/L,V_m=2.5×10~(-7)mol/L.本研究表明F.manganoxydans sp.nov.中获得的fm2382基因可以在大肠杆菌中高效表达且FM2382是一种新的磷酸酶.     

L-山梨糖还原酶基因在大肠杆菌中的表达及融合蛋白的酶学特性

为获得L 山梨糖还原酶 (SR)整个操纵子序列 ,以 pGEM 3zf( )作为载体构建了Gluconobactersp .S6基因文库 .结合转化子在以L 山梨糖为唯一碳源培养基上的生长情况 ,利用PCR技术筛选到一个含L 山梨糖还原酶基因的阳性克隆pGEM 3zf( ) sr3/E .coli,酶切鉴定插入片断长度约 5 .0kb左右 .以 pGEM 3zf( ) sr3/E .coli质粒DNA为模板 ,扩增SR结构基因 .PCR产物经测序验证为SR基因序列后 ,与表达载体Pet32a( )相连 ,转化宿主大肠杆菌AD4 94 (DE3)对SR基因进行表达 ,并利用重金属离子亲和层析技术对SR融合蛋白进行了纯化 ,对其酶学特性进行了研究 .结果表明 :还原型辅酶II(NADPH)是SR酶蛋白的最适电子供体 ;SR酶蛋白的最适反应pH为 7.0 ,pH为6 .5时保持稳定 ,酶活力较高 ;最适反应温度是 5 0℃ ,30℃时热稳定性较好 .SDS PAGE电泳分析 ,SR融合蛋白的Mr 在6 5× 10 3 左右 ,由此推测出天然SR的Mr 在 5 3× 10 3 左右 ,与SR基因序列推测出的分子量大小一致 .图 13表 2参 6     

果胶寡糖生产菌的构建与筛选

生物酶解法是新兴益生元果胶寡糖(Pectin oligosaccharides,POS)生产的主要途径.通过构建黑曲霉来源的多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PGA)基因pga A表达载体p PIC9K-PGA,电转毕赤酵母GS115,筛选能够表达用于制备POS重组果胶酶的工程菌.利用SDS-PAGE检测诱导表达上清,TLC分析其水解产物成分,筛选得到一株特定降解果胶生成寡糖的酵母工程菌GS-12.该重组多聚半乳糖醛酸酶(Recombinant polygalacturonase,re PGA)相对分子量(Mr)为86×10~3,发酵液酶活水平24.8 U/m L;GS-12经30次传代后目的基因pga A仍能稳定遗传,水解产物成分未发生改变;酶促反应得出该酶最适温度50℃,最适p H 5.5,50℃保温5 h相对酶活保持50%以上.综上,所构建酵母工程菌GS-12遗传稳定性高,耐热性提升,作用果胶可得大分子量多糖产物,对POS的工业规模化生产具有重要价值.     

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶初步纯化及部分性质

以日本沼虾内脏为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32离子交换柱层析和SephadexG-100分子筛柱层析纯化,获得比活力为3000Umg-1、纯化倍数为8.88倍的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂(NAGase).以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学,结果表明,酶的最适pH为6.0,最适温度为53℃.该酶在pH4.5~9.3区域较稳定,当pH>9.3很快失活;在50℃以下处理30min,酶活力保持稳定,高于50℃,酶稳定性较差,75℃酶完全失活.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.165mmolL-1,最大反应速度Vm为6.55μmolL-1min-1.酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为63.55kJmol-1.图5表1参16     

产碱杆菌DN25中降氰酶的分离纯化及生化特性

以一株可降氰的产碱杆菌DN25为酶来源,通过超滤、30 mg/mL硫酸鱼精蛋白沉淀、30%～70%硫酸铵盐析和Phenyl-Toyopearl 650M疏水层析等步骤,获得比活力为44 U/mg的纯化酶制剂.在确定酶浓度、反应时间等氰降解活力测定条件后开展酶学性质研究,试图为将来氰降解代谢机理的深入研究和菌株的基因工程改造提供理论基础.研究结果表明,此纯化酶催化氰化物水解的最适pH值为8.0,最适温度为30℃.该酶在pH 7.0～8.0区域稳定,而在pH>9时会很快失活;在30℃保存10 h,酶活力保持稳定,高于60℃,酶快速失活.加入甘氨酸稳定剂,在60℃下保存20 min酶活仍可保留19.6%.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为3.11 mmol/L,最大反应速率Vmax为0.23 mmolL-1min-1.     

芽孢杆菌植酸酶phy(ycD)基因在大肠杆菌中的异源表达与纯化

为研究中性植酸酶的性质,将芽孢杆菌来源植酸酶基因phy(ycD)构建到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,进行诱导表达,利用Ni-NAT和Superdex-75纯化后,对重组植酸酶r-phy(ycD)的性质进行分析.结果显示,该酶是Ca2+依赖性酶,Ca2+最适浓度为1 mmol/L,酶比活为4.7 U/mg,酶促反应的最适pH为6.5,在中性条件下稳定,最适反应温度为45℃,K m值和V max值分别为0.213 mmol/L和5.55 U/mg.Zn2+、Ni2+、Ba2+和Ag2+对酶促反应均有显著抑制作用.本研究表明,Ca2+对该类酶的活性和热稳定性起着关键性作用,因此在表达和纯化过程中需要在培养基和纯化所需的各类缓冲液中添加Ca2+.     

植物乳杆菌BBE7的胆盐水解酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

由于用大肠杆菌对植物乳杆菌来源的bsh基因进行胞内和胞外表达时,它们很容易形成包涵体,而且大肠杆菌的内毒素会显限制BSH的应用,所以利用毕赤酵母这一高效的表达系统对其进行了分泌表达.首先用融合PCR的方法将信号肽α-factor与BSH连接,然后再克隆到质粒pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-α-factor-BSH.重组质粒经过SalⅠ线性化后转化至毕赤酵母GS115.表达产物经SDS-PAGE分析和酶活测定发现,重组BSH的相对分子质量(Mr)和胞外酶活分别为37.0×103和1.08 U mL-1.通过正交实验[L9(34)]对发酵条件优化后,胞外总酶活达到2.69 U mL-1,比原来提高了1.49倍.研究为胆盐水解酶的分离纯化、酶学性质研究以及大规模生产奠定了一定的基础.