碱性β-聚糖酶产生菌选育及产酶条件优化

从碱性土样中分离到数十株产碱性β聚糖酶类的细菌,经摇瓶反复筛选后,得到一株碱性β聚糖酶产量较高的耐碱性细菌．经初步鉴定,属短小芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）．其纤维素酶作用的最适ｐＨ为７．６,最适θ为６０℃,木聚糖酶的作用最适ｐＨ为９．０,最适θ为５５℃．该菌的最适生长ｐＨ为８．０,最适产酶θ为２８～３２℃．木聚糖与山梨糖分别是木聚糖酶和纤维素酶的良好诱导物．以麸皮为碳源,产酶的最适浓度为５％．添加尿素和（ＮＨ４）２ＳＯ４为氮源可提高纤维素酶酶活２倍,木聚糖酶酶活１倍．发酵周期为６０ｈ,纤维素酶酶活最高可达１．２１ＩＵｍＬ－１,木聚糖酶酶活可达４３ＩＵｍＬ－１．     

疏棉状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus YNUCC4154耐碱热稳定木聚糖酶的特性及其产生菌的系统发育分析

从云南洱源县热泉中分离到一株产木聚糖酶嗜热真菌Thermomyces lanuginosus YNUCC4154．对其28S rDNA的5‘端约900bp的片段进行了扩增和测序，并与GenBank中最相似的12个分类单位进行了比较，邻近接合法构建的系统发育树显示T.lanuginosus YNUCC4154与几个产木聚糖酶的嗜热真菌关系较近．在30L全自动发酵罐中55℃发酵50h后，木聚糖酶酶活达1032 U mL^-1．该木聚糖酶最适反应温度为73℃，最适pH为6，5，在10-67℃和pH3～12时比较稳定，表明这是一种热稳定耐碱木聚糖酶，在造纸工业中具有良好的应用前景．图7表1参24     

高产木聚糖酶细菌的筛选、鉴定及其部分酶学特性

细菌木聚糖酶具有优良的酶学特性,发掘和研究高产菌株资源对促进木聚糖酶工业生产具有十分重要的意义.采用刚果红透明圈法从采集的土样样品中筛选分离得到1株高产细菌木聚糖酶的菌株SD4-4,通过形态特征及16S r DNA序列分析进行鉴定,并以本实验室保存的细菌木聚糖酶工业生产用菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SL作为对照,对比研究SD4-4的产酶水平及酶学性质.结果表明,SD4-4为短小芽孢杆菌(B.pumilus),利用小麦麸皮摇瓶发酵,其上清酶活可达1 166.0 U/m L,而SL上清酶活为281.0 U/m L.SD4-4所产木聚糖酶作用最适温度约为50℃,最适p H约为5.0.粗酶液在30-50℃的环境下处理10 min,相对酶活均保持在90%以上;在p H 4.0的条件下处理30 min,相对酶活仍有76%,酸性环境下稳定性较好.因此,菌株SD4-4产酶水平高于对照菌株SL,酶学特性更为优良,工业应用前景良好,尤其在饲料添加剂行业具有较大的开发潜力.     

乳酸片球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

与其它微生物相比,用大肠杆菌进行发酵生产乳酸有许多优势,但大肠杆菌没有L乳酸脱氢酶基因,不能利用糖发酵生产L乳酸.本文采用PCR技术,以乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)基因组DNA为模板,克隆得到L乳酸脱氢酶(Llactatedehydrogenase)基因,将该基因的ORF连接到表达质粒pET22b( ),获得重组质粒pETldhL.将pETldhL质粒转化大肠杆菌BL21株,实现了ldhL基因的表达;对含有ldhL基因的重组菌株进行表达研究,在30℃以IPTG诱导8h后,SDSPAGE分析可见明显特异性条带,酶活力达到6.49u/mL,是野生菌酶活力(2.82u/mL)的2.3倍.对重组表达的L乳酸脱氢酶生物学特性研究显示,它们的最适反应温度为27～30℃,最适反应pH为5.0～5.3.图5参15     

碱性β—聚糖酶产生菌选育及产酶条件优化

从碱性土样中分离到数十株产碱性β－聚糖酶类的细菌经摇瓶反复筛选后,得到一株碱性β－聚产产量较高的耐碱细菌经初步鉴定,属短小芽孢杆菌,其纤维素酶作用的最适ＰＨ为７．６,最适θ为６０℃,木聚糖酶的作用最适ＰＨＪ为９．０,最适θ为５５℃,该菌的最适生长ＰＨ为８．０,最适产酶θ为２８－３２℃,木聚糖与山梨糖分别是木聚糖酶和纤维素酶的良好诱导物,以麸皮为碳源,产酶的最适浓度为５％,添加尿素和（ＮＨ４）２ＳＯ     

一株产木聚糖酶的耐冷皮壳正青霉菌鉴定与酶谱分析

从青海冻土中分离得到1株产木聚糖酶的青霉菌QH11,通过菌落特征观察、显微特征观察和18S rDNA同源性序列分析,鉴定该菌为皮壳正青霉,其最适生长温度为20℃.该菌以玉米芯水不溶木聚糖为碳源,于20℃摇瓶培养,d 4木聚糖酶达到高峰,酶活为28.13 U/mL,比酶活为9.73 U/mg,粗酶液的最适温度为47.5℃.SDS-PAGE和酶谱分析表明,该菌可产生3种木聚糖酶,其亚基相埘分子质量(Mr)分别为20.5×103、23.0×103和35.0×103.图6参15     

类弹性蛋白多肽长度对不溶活性ELPs-木聚糖酶聚集体酶学性质的影响

为了系统研究ELPs的长度对不溶活性ELPs-木聚糖酶聚集体(IAEXA)的影响,构建带有木聚糖酶与不同长度ELPs融合基因的克隆及表达载体,经表达、纯化得到不同长度ELPs与木聚糖酶的不溶活性聚集体,并考察其酶学性质.结果表明:所有IAEXA的最适温度均为70℃,比未连接ELPs的自由木聚糖酶提高了20℃,其最适反应p H均为7.0,比自由酶提高了1个p H单位,且在p H为8-9时仍保持80%以上活力,其耐碱能力也有较大提升.其中,由40个重复ELPs形成的IAEXA热稳定性最好,80个重复的ELPs的p H稳定性最好,其重复使用性也最佳,而60个重复的ELPs形成的IAEXA与底物的亲和性最佳.因此,较长ELPs有助于提高IAEXA的催化效率及重复使用率,拓展其应用范围.     

嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)RNA中通过RT-PCR克隆出β-葡萄糖苷酶基因bgl Ⅰ的全长序列,cDNA序列为2 672 bp.Genbank登录号为EU269025,将该片段插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K/bgl,经线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,在醇氧化酶AOXI基因启动子作用下,获得高效表达β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌株.经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析纯化了该重组表达蛋白.SDS-PAGER测得该重组蛋白相对分子质量(M)约为120×103.经甲醇诱导,培养基中β-葡萄糖苷酶的活力可达1.2 U/mg,小规模发酵量达0.45 mg/mL.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0.于70℃保温30 min仍保持80%的酶活力,具有较高的热稳定性,在pH 3.0～9.0的条件下酸碱耐受性强.图6表1参22     

杂合抗菌肽LPCB在毕赤酵母中的表达条件优化

为获取能表达具有天然活性的杂合抗菌肽的重组酵母菌,确定其最佳表达条件,将构建好的重组酵母表达载体pPICZα-A-CecropinB(1～10)-Magainin2(1～12)(简称pPICZα-A-CBMA)和pPICZα-A-Lfcin-Pro-CecropinB(简称pPICZα-A-LPCB)经SacⅠ线性化处理,分别电转入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,PCR扩增验证,甲醇诱导表达.采用抑菌圈法初步测定产物活性,优化杂合肽LPCB诱导时间、诱导剂浓度、诱导温度、培养基pH等表达条件,传代检测其质粒稳定性.结果显示,基因工程菌P.pastoris X-33/pPICZα-A-CBMA和P.pastoris X-33/pPICZα-A-LPCB成功构建.表达产物前者抑菌活性微弱,后者抑菌活性良好.杂合肽LPCB的最佳表达条件为:25℃,pH中性培养,每24 h添加0.5%(V/V,φ)甲醇,诱导表达72 h.重组酵母菌pPICZα-A-LPCB在培养超过100代后,未发生质粒丢失.     

米曲霉产氨基酰化酶条件及部分酶学性质研究

通过单因子和多因子摇瓶正交优化试验,确定了米曲霉液态发酵产氨基酰化酶的最佳发酵条件.优化发酵培养基组成(ρ/gL-1):葡萄糖40,蔗糖10,可溶性淀粉20,蛋白胨2.5,马铃薯液1000mL,pH自然.培养基装量50mL/250mL三角瓶,接种量4%.培养温度30℃,转速100r/min,发酵时间42h.每50mL培养物的总酶活由优化前的2627u提高到7338u,是优化前的2.79倍.研究了米曲霉氨基酰化酶的部分酶学性质.该酶催化反应的最适pH为7.0,最适温度为40℃,低浓度的Co2 (5×10-4mol/L)对酶活激活作用显著.图5表2参8     

中国虎纹捕鸟蛛神经毒素肽基因的克隆及在酵母中的表达

从中国珍稀毒蜘蛛种虎纹捕鸟蛛的粗毒中分离纯化的虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)是含33个氨基酸的多肽.有关实验已证实,HWTX-Ⅰ是一种作用于突触前膜的神经毒素和高阈值钙通道抑制剂,在电刺激时HWTX-Ⅰ也影响交感神经释放肾上腺素和迷走神经释放乙酰胆碱,这些结果表明,HWTX-Ⅰ具有潜在的镇痛活性.本文报道通过RT-PCR方法克隆、测定了HWTX-Ⅰ的cDNA序列.在此基础上,以pPIC9K为表达载体和GS115为宿主,筛选His Muts克隆,以甲醇为诱导剂,成功地构建并在毕赤酵母系统分泌表达HWTX-Ⅰ基因.进一步分析HWTX-Ⅰ表达产物,生物活性实验观察到酵母表达体系所获得的HWTX-Ⅰ产物具有与天然HWTX-Ⅰ相似的生理活性.图4参10     

木聚糖酶基因xynB在不同大肠杆菌表达系统中的表达比较

从黑曲霉(Aspergillus niger)nl-1中克隆获得木聚糖酶基因xynB.该基因全长745 bp,含有67 bp内含子,与公布的黑曲霉xynB基因有较高的同源性.将PCR扩增的木聚糖酶成熟肽基因和含有信号肽的基因分别连接到表达载体肠杆菌Top10 F’、DH10B和两种BL21宿主中获得重组菌株.通过IPTG诱导,xynB基因在重组菌株中获得特异性表达.表达产物以胞内可溶性蛋白和不溶性包涵体形式存在.诱导4 h,重组菌株pTrc-99a-xynB[BL21 condon plus(DE3)]表达量最高,胞内酶活达到299 IU/L.重组质粒pTrc-99a-xyn B(S)在不同宿主胞内和胞外均能分泌目的蛋白,诱导10 h,胞外酶活pTrc-99a-xynB(S)[BL21 condon plus(DE3)]达到347 IU/L.而pET-20b-xynB(S)在两种BL21宿主中均不表达.经SDS-PAGE分析,以pTrc-99a和pET-20b作为表达载体时,重组蛋白相对分子质量分别约为45×103和30×103.与pET-20b相比,pTrc-99a以及自身信号肽的引导更有利于重组木聚糖酶的表达.     

豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达及其产物的纯化

将含有和不含前肽的豆豉溶栓酶编码序列在毕赤酵母中分别进行表达研究,发现在含有前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母工程菌用甲醇诱导时,其培养液中可检测到较强的溶栓酶活性;而在不含前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母菌用甲醇诱导时,培养液中未检测到溶栓酶活性.对毕赤酵母表达和分泌的豆豉溶栓酶进行了分离纯化,并对其纯化产物进行溶栓酶活性、SDS-PAGE电泳、抑制剂作用及免疫印迹分析.结果表明,分泌到培养液中的豆豉溶栓酶已经过剪切加工,其前肽已被切除,重组与天然的豆豉溶栓酶具有相同的溶栓酶活性,其所测定的各理化指标均一致.本研究实现了豆豉溶栓酶在毕赤酵母菌中成功表达,并首次直接证明了前肽对豆豉溶栓酶在毕赤酵母中分泌表达是必须的.图3表1参20     

短小芽孢杆菌A—30耐碱性木聚糖酶基因的分子生物学研究

采用PCR方法对短小芽孢杆菌A－30菌株的耐碱性木聚糖酶基因进行克隆。在木聚糖选择平板上用刚果红染色法筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的重组质粒进行酶切鉴定和测序。该基因在大肠杆菌中表达，过夜培养物胞外、胞内和周质空间的木聚糖酶酶活分别为0．159IUmL^-1、0.322IUmL^-1和0.007IUmL^-1。此木聚糖酶表现出较宽的pH作用范围，最适作用pH7左右，在pH9时仍有60％以上的酶活性。图4参14     

嗜热脂肪土芽孢杆菌木聚糖酶基因的合成及其在大肠杆菌中的表达

来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的木聚糖内切酶XT6在工业上有着重要的应用,已经成功应用于工业规模的生产试验.本文作者在合成XT6基因全序列的同时对其密码子进行了优化,且构建重组质粒在大肠杆菌中高表达.通过优化表达条件,功能正常的XT6基因在大肠杆菌中成功过量表达,蛋白表达量占细胞中总蛋白的65%.重组表达的木聚糖内切酶XT6特性和天然酶相似,以桦木木聚糖为底物测定细胞提取物中木聚糖酶活性,最大活性高达3 030 U/mL.本文首次报道了来自嗜热脂肪土芽孢杆菌中木聚糖酶基因全序列的合成和在大肠杆菌中成功过量表达.图6表1参19     

肺炎嗜衣原体主要外膜蛋白基因片段在大肠杆菌中的表达与鉴定

表达肺炎嗜衣原体（Chlamydia pneumoniae,Cpn）主要外膜蛋白（MOMP）的可变区VD2-VD3区．纯化产物并进行免疫活性分析,为探索重组蛋白在肺炎嗜衣原体血清学诊断中的应用提供资料．应用聚合酶联反应（PCR）技术,从肺炎嗜衣原体标准株AR-39的MOMP上扩增出抗原优势表住VD2-VD3区,将目的片段定向插入pET-30a载体,转化大肠杆菌B121,IPTG诱导表达并以Ni-NTA亲和层析柱纯化表达产物并行western-blot鉴定．成功构建了pET-30a-MOMPVD2-VD3的原核表达系统,表达并纯化出相对分子质量（Mr）为24×10^3Da的重组蛋白．Western-blot证实重组蛋白能与Cpn MOMP多克隆抗体发生特异性反应．肺炎嗜衣原体的MOMPVD2-VD3基因可以在大肠杆菌中得到表达,其表达产物能与相应的抗体结合,为肺炎嗜衣原体诊断候选抗原的研究奠定了基础．图4,参9．     

大肠杆菌植酸酶在毕赤酵母中的表达与纯化

为探讨植酸酶的结构与功能,研究了来源于大肠杆菌的植酸酶基因在酵母中的表达和纯化条件.将含有大肠杆菌植酸酶基因的毕赤酵母工程菌在不同甲醇浓度和不同诱导时间下培养,检测植酸酶的表达情况.结果表明:诱导培养基中一次性添加2.5%的甲醇,诱导96 h后,蛋白浓度达到1.36 mg mL-1,酶活力达到6 530 U mL-1;将在毕赤酵母中表达的植酸酶粗酶液经过硫酸铵盐析、Resource S柱和Superdex-75三步纯化,得到单峰纯的蛋白,比活力为137 280 Umg-1.用圆二色谱分析纯化后的蛋白在pH 5.0和8.0环境中的结构变化,结果显示pH 8.0环境使大肠杆菌植酸酶发生了变性.图3参16     

BACILLUS SP. BT-7木聚糖酶基因克隆与鉴定

报道了从一株有较高半纤维素酶活性的Ｂａｃｉｌｕｓｓｐ．ＢＴ７克隆内切木聚糖酶基因的结果．以大肠杆菌ＸＬ１ｂｌｕｅ为宿主菌,采用水解圈检测法,在含有ＲＢＢ木聚糖（４氧甲基Ｄ葡萄糖苷Ｄ木聚糖Ｒｅｍａｚｏｌ亮蓝Ｒ）的平板上分离到能水解ＲＢＢ木聚糖的阳性克隆３个,对它们进行的限制酶作图和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明,它们属于３种不同的内切木聚糖酶基因     

Agricultural waste from the tequila industry as substrate for the production of commercially important enzymes

Approximately 1 million tons of Agave tequilana plants are processed annually by the Mexican Tequila industry generating vast amounts of agricultural waste. The aim of this study was to investigate the potential use of Agave tequilana waste as substrate for the production of commercially important enzymes. Two strains of Aspergillus niger (CH-A-2010 and CH-A-2016), isolated from agave fields, were found to grow and propagate in submerged cultures using Agave tequilana waste as substrate. Isolates showed simultaneous extracellular inulinase, xylanase, pectinase, and cellulase activities. Aspergillus CH-A-2010 showed the highest production of inulinase activity (1.48 U/ml), whereas Aspergillus niger CH-A-2016 produced the highest xylanase (1.52 U/ml) and endo-pectinase (2.7U/ml) activities. In both cases production of enzyme activities was significantly higher on Agave tequilana waste than that observed on lemon peel and specific polymeric carbohydrates. Enzymatic hydrolysis of raw A. tequilana stems and leaves, by enzymes secreted by the isolates yielded maximum concentrations of reducing sugars of 28.2 g/l, and 9.9 g/l respectively. In conclusion, Agave tequilana waste can be utilized as substrate for the production of important biotechnological enzymes.