嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)RNA中通过RT-PCR克隆出β-葡萄糖苷酶基因bgl Ⅰ的全长序列,cDNA序列为2 672 bp.Genbank登录号为EU269025,将该片段插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K/bgl,经线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,在醇氧化酶AOXI基因启动子作用下,获得高效表达β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌株.经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析纯化了该重组表达蛋白.SDS-PAGER测得该重组蛋白相对分子质量(M)约为120×103.经甲醇诱导,培养基中β-葡萄糖苷酶的活力可达1.2 U/mg,小规模发酵量达0.45 mg/mL.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0.于70℃保温30 min仍保持80%的酶活力,具有较高的热稳定性,在pH 3.0～9.0的条件下酸碱耐受性强.图6表1参22     

无指盘臭蛙皮肤抗菌肽Odorgrin A真核表达载体的构建与转化

根据无指盘臭蛙(Odorrana grahami)皮肤抗菌肽Odorgrin A的氨基酸序列,合成了以酵母偏爱密码子编码的Odorgrin A基因片段.目的片段从合成质粒上用XhoΙ和EcoRΙ双酶切下后,与经同样限制酶酶切的pPIC9K载体连接而成表达载体pPIC9K-Odo A.PCR扩增、酶切及测序检测的结果表明表达载体构建成功.线性化的pPIC9K-OdoA经电击法转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115宿主菌,营养缺陷型筛选、遗传霉素抗性筛选、PCR扩增和测序检测的结果表明,表达载体pPIC9K-Odo A成功地转化并整合入酵母基因组.用甲醇对具遗传霉素G418高抗性的Odorgrin A重组酵母菌进行诱导表达,取酵母发酵液上清经SDS-PAGE电泳检测,结果初步表明,整合进酵母基因组的抗菌肽Odorgrin A基因已获得分泌表达,表达产物相对分子质量为3×103～4×103,与理论值相近.图10参17     

大肠杆菌植酸酶在毕赤酵母中的表达与纯化

为探讨植酸酶的结构与功能,研究了来源于大肠杆菌的植酸酶基因在酵母中的表达和纯化条件.将含有大肠杆菌植酸酶基因的毕赤酵母工程菌在不同甲醇浓度和不同诱导时间下培养,检测植酸酶的表达情况.结果表明:诱导培养基中一次性添加2.5%的甲醇,诱导96 h后,蛋白浓度达到1.36 mg mL-1,酶活力达到6 530 U mL-1;将在毕赤酵母中表达的植酸酶粗酶液经过硫酸铵盐析、Resource S柱和Superdex-75三步纯化,得到单峰纯的蛋白,比活力为137 280 Umg-1.用圆二色谱分析纯化后的蛋白在pH 5.0和8.0环境中的结构变化,结果显示pH 8.0环境使大肠杆菌植酸酶发生了变性.图3参16     

嗜热子囊菌光孢变种内切葡聚糖酶Ⅰ基因在毕赤酵母中的表达及部分酶学性质

嗜热子囊菌是一种嗜热真菌,可以产生具有很高工业价值的内切葡聚糖酶.本研究成功表达了嗜热子囊菌内切葡聚糖酶Ⅰ基凶,并获得热稳定的重组内切葡聚糖酶.提取嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)总RNA,通过RT-PCR方法克隆出内切-β-葡聚糖酶eg1基因的成熟肽编码序列.采用基因重组的方法构建该基因的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K-eg1,经线性化后采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,大量筛选后获得高效表达内切葡聚糖酶Ⅰ的毕赤酵母工程菌株GpN24.该菌株采用甲醇诱导120 h后,内切葡聚糖酶Ⅰ的活力可达570.7 U/mL,最适温度为55℃,在90℃的条件下保温30 min后仍具有60%的酶活力;最适pH为5.0,在pH 3.0～5.0的条件下酶活力保持稳定.图6表2参16     

碱性果胶酯裂解酶工程菌的构建

从本研究室筛选的BacillussubtilisWSHB04-02菌株中扩增出编码碱性果胶酯裂解酶的结构基因PL,将其插入大肠杆菌分泌表达载体pET22b( )多克隆位点,得到重组载体pET22b( )PL.序列分析表明,所获PL基因与已报道的B.subtilisSO113的PL基因的同源性为98%.重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达.SDS-PAGE分析显示,表达产物的分子量(Mr)均为43×103,同核酸序列测定所推导的值相符.该工程菌经IPTG诱导后,胞内酶活为8U/mL.研究发现,碱性果胶酯裂解酶不仅在胞内有酶活,胞外也有酶活,说明所构建的表达体系可使该酶向胞外分泌.图3表1参6     

黑曲霉耐热木聚糖酶XYNB在毕赤酵母中的高效表达

高比活木聚糖酶的高效表达是进一步提高木聚糖酶发酵效价、降低生产成本的有效途径.将黑曲霉木聚糖酶基因XynB(不含信号肽)克隆到分泌型表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,G418和PCR鉴定的阳性转化子经0.5%甲醇、在28℃诱导表达.SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为20×103左右.优化的诱导表达条件为,每隔12 h添加0.5%的甲醇,发酵5 d后,比活达4 757 U/mg;其最适温度为55℃,最适pH为5.0,80℃处理30min后仍有74%的残余酶活.     

短小芽孢杆菌A—30耐碱性木聚糖酶基因的分子生物学研究

采用PCR方法对短小芽孢杆菌A－30菌株的耐碱性木聚糖酶基因进行克隆。在木聚糖选择平板上用刚果红染色法筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的重组质粒进行酶切鉴定和测序。该基因在大肠杆菌中表达，过夜培养物胞外、胞内和周质空间的木聚糖酶酶活分别为0．159IUmL^-1、0.322IUmL^-1和0.007IUmL^-1。此木聚糖酶表现出较宽的pH作用范围，最适作用pH7左右，在pH9时仍有60％以上的酶活性。图4参14     

豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达及其产物的纯化

将含有和不含前肽的豆豉溶栓酶编码序列在毕赤酵母中分别进行表达研究,发现在含有前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母工程菌用甲醇诱导时,其培养液中可检测到较强的溶栓酶活性;而在不含前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母菌用甲醇诱导时,培养液中未检测到溶栓酶活性.对毕赤酵母表达和分泌的豆豉溶栓酶进行了分离纯化,并对其纯化产物进行溶栓酶活性、SDS-PAGE电泳、抑制剂作用及免疫印迹分析.结果表明,分泌到培养液中的豆豉溶栓酶已经过剪切加工,其前肽已被切除,重组与天然的豆豉溶栓酶具有相同的溶栓酶活性,其所测定的各理化指标均一致.本研究实现了豆豉溶栓酶在毕赤酵母菌中成功表达,并首次直接证明了前肽对豆豉溶栓酶在毕赤酵母中分泌表达是必须的.图3表1参20     

果胶寡糖生产菌的构建与筛选

生物酶解法是新兴益生元果胶寡糖(Pectin oligosaccharides,POS)生产的主要途径.通过构建黑曲霉来源的多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PGA)基因pga A表达载体p PIC9K-PGA,电转毕赤酵母GS115,筛选能够表达用于制备POS重组果胶酶的工程菌.利用SDS-PAGE检测诱导表达上清,TLC分析其水解产物成分,筛选得到一株特定降解果胶生成寡糖的酵母工程菌GS-12.该重组多聚半乳糖醛酸酶(Recombinant polygalacturonase,re PGA)相对分子量(Mr)为86×10~3,发酵液酶活水平24.8 U/m L;GS-12经30次传代后目的基因pga A仍能稳定遗传,水解产物成分未发生改变;酶促反应得出该酶最适温度50℃,最适p H 5.5,50℃保温5 h相对酶活保持50%以上.综上,所构建酵母工程菌GS-12遗传稳定性高,耐热性提升,作用果胶可得大分子量多糖产物,对POS的工业规模化生产具有重要价值.     

杂合抗菌肽LPCB在毕赤酵母中的表达条件优化

为获取能表达具有天然活性的杂合抗菌肽的重组酵母菌,确定其最佳表达条件,将构建好的重组酵母表达载体pPICZα-A-CecropinB(1～10)-Magainin2(1～12)(简称pPICZα-A-CBMA)和pPICZα-A-Lfcin-Pro-CecropinB(简称pPICZα-A-LPCB)经SacⅠ线性化处理,分别电转入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,PCR扩增验证,甲醇诱导表达.采用抑菌圈法初步测定产物活性,优化杂合肽LPCB诱导时间、诱导剂浓度、诱导温度、培养基pH等表达条件,传代检测其质粒稳定性.结果显示,基因工程菌P.pastoris X-33/pPICZα-A-CBMA和P.pastoris X-33/pPICZα-A-LPCB成功构建.表达产物前者抑菌活性微弱,后者抑菌活性良好.杂合肽LPCB的最佳表达条件为:25℃,pH中性培养,每24 h添加0.5%(V/V,φ)甲醇,诱导表达72 h.重组酵母菌pPICZα-A-LPCB在培养超过100代后,未发生质粒丢失.     

黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、表达及快速酶活检测体系的建

阿魏酸酯酶是参与半纤维素降解的重要酶类.为了提高阿魏酸酯酶的活性和其它性能,本文作者采用RT-PCR技术从黑曲霉CIB 423.1中克隆了编码阿魏酸酯酶A的cDNA,构建了外泌表达的质粒,并将其转化到毕赤酵母GS115进行表达.通过检测培养液上清中的酶活,表明阿魏酸酯酶已成功在这一体系表达.同时,本文还建立了快速、稳定的酶活检测体系,为后续对阿魏酸酯酶酶突变体活性进行高通量筛选奠定了基础.图5参17     

黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、表达及快速酶活检测体系的建立

阿魏酸酯酶是参与半纤维素降解的重要酶类. 为了提高阿魏酸酯酶的活性和其它性能,本文作者采用RT-PCR技术从黑曲霉CIB 423.1中克隆了编码阿魏酸酯酶A的cDNA,构建了外泌表达的质粒,并将其转化到毕赤酵母GS115进行表达. 通过检测培养液上清中的酶活,表明阿魏酸酯酶已成功在这一体系表达. 同时,本文还建立了快速、稳定的酶活检测体系,为后续对阿魏酸酯酶酶突变体活性进行高通量筛选奠定了基础. 图5 参17     

运动发酵单胞菌共表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶发酵甘薯生产乙醇

运动发酵单胞菌是乙醇发酵的极佳菌种,但其所能利用的发酵底物范围狭窄,不能利用淀粉作为发酵底物.为增加其利用底物的范围使其能够水解淀粉,本研究构建了3种表达淀粉酶的运动发酵单胞菌菌株:1)Zymomonas mobilis(pAmyE)表达α-淀粉酶;2)Z.mobilis(pGA)表达葡萄糖淀粉酶;3)Z.mobilis(pAmyGA)共同表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶.DNS法测定淀粉酶活显示,每种转化菌株的胞外淀粉酶活性均高于胞内,且两种淀粉酶共表达的酶活高于这两种淀粉酶单独表达的酶活之和,说明这两种淀粉酶能够协同作用降解淀粉.对于重组菌株Z.mobilis(pAmyGA),约59.3%的淀粉酶活性都在胞外检测到.用淀粉含量高且耐贮存的徐薯18匀浆加少量葡萄糖作为培养基直接用上述3个菌株发酵生产乙醇.结果显示,共表达α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的重组菌株Z.mobilis(pAmyGA)的乙醇产量为54.7 g/L,达到了理论值的83.2%,表明本研究得到了能够直接高效利用淀粉生产乙醇的运动发酵单胞菌的菌株.     

稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母工程菌初步构建

分别克隆了休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)的木糖还原酶基因XYL1和热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖醇脱氢酶基因XYL2,构建出重组表达质粒pACT2-xy11和pDR195-xy12,并使其分别转化酿酒酵母受体细胞.酶活测定结果显示,转化子中木糖还原酶和木糖醇脱氢酶均在宿主菌中得到活性表达.并将这两个基因连同各自重组表达质粒上的表达元件进行了克隆,进而构建出重组酵母染色体整合质粒YIp5.kanR-x12,以期今后通过同源重组的原理将上述基因整合到发酵性能良好的酿酒酵母基因组中,得到稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酵母菌株.图3表1参15     

地衣芽孢杆菌2709和 6816碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及序列分析

用PCR方法从地衣芽孢杆菌 2 70 9和 6 816中扩增了碱性蛋白酶基因 (apr1和apr2 ) ,扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体 pET -2 8a中 ,构建成重组分泌型表达载体pAPR1、pAPR2 .pAPR1、pAPR2中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM 10 9(DE3)中得到表达 .SDS -PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为 30 .5× 10 3 ,同核酸序列测定所推导的值相符 .表达产物分别占细胞总蛋白的 8.0 %和 7.5 % .2 70 9重组菌所得酶活为 12 10u/mL ,6 816重组菌所得酶活为 1175u/mL .研究发现 ,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时可能存在前肽自动脱落的现象 .同时 ,对地衣芽孢杆菌 2 70 9碱性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析 ,发现与地衣芽孢杆菌 6 816碱性蛋白酶基因的同源性为 98% .图 5参 11     

嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶基因perA在大肠杆菌中的高效表达

利用PCR技术得到嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillusstearothermophilus)过氧化氢酶基因 perA ,将该基因与表达载体 pKK2 2 3 3连接构建重组质粒pK perA ,转化大肠杆菌过氧化氢酶HPⅠ和HPⅡ双缺突变株UM 2 ,得到重组大肠杆菌UM 2 1.酶活测定结果表明 ,表达产物具有正常的生物学活性 .SDS PAGE电泳结果显示出明显的特异性表达条带 ,单体Mr =86× 10 3 ,与嗜热脂肪芽孢杆菌所产酶相同 .实验表明 ,重组质粒在宿主UM 2中有较好的稳定性 ,在无选择压力条件下传代 6 0次基本保持稳定 ,传代 10 0次重组质粒保留 80 %以上 .摇瓶实验确定重组菌的最佳表达条件为 :IPTG浓度 ,0 .75mmol/L ;诱导时间 3h ;培养基起始 pH 6 .5 ;诱导温度 37℃ ;装液量 5 0mL/ 2 5 0mL .在优化条件下 ,重组菌产生的过氧化氢酶占菌体总蛋白的 8% ,酶活力可达 35U/mL ,是原始菌株BacillusstearothermophilusIAM110 0 1的 11.7倍 .图 2表 1参 10     

大鼠血红素加氧酶-1基因在乳酸乳球菌中的克隆与表达

采用RTPCR技术从大鼠脾总RNA中分离扩增HO1基因,将该基因克隆进pGEMTeasy质粒中,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,分析基因,酶切后与含有乳酸乳球菌启动子NisA的pSEC质粒连接,经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养.用Nisin诱导HO1表达,SDSPAGE和Westernblot分析、鉴定表达产物,并且用分光光度法测定工程菌表达的HO1活性为0.45nmolmg(protein)-1h-1.图5参18     

乳酸片球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

与其它微生物相比,用大肠杆菌进行发酵生产乳酸有许多优势,但大肠杆菌没有L乳酸脱氢酶基因,不能利用糖发酵生产L乳酸.本文采用PCR技术,以乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)基因组DNA为模板,克隆得到L乳酸脱氢酶(Llactatedehydrogenase)基因,将该基因的ORF连接到表达质粒pET22b( ),获得重组质粒pETldhL.将pETldhL质粒转化大肠杆菌BL21株,实现了ldhL基因的表达;对含有ldhL基因的重组菌株进行表达研究,在30℃以IPTG诱导8h后,SDSPAGE分析可见明显特异性条带,酶活力达到6.49u/mL,是野生菌酶活力(2.82u/mL)的2.3倍.对重组表达的L乳酸脱氢酶生物学特性研究显示,它们的最适反应温度为27～30℃,最适反应pH为5.0～5.3.图5参15     

麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在巴斯德酵母中的表达及遗传稳定性

海藻糖是一种具有很多功能的非还原性二糖,在生物制品和食品等行业中具有较广泛的用途.对来自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)B12海藻糖酶转化过程中的关键酶基因--麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因进行了遗传密码子的人工改造,合成酵母偏爱密码子和修改基因遗传密码子中的A/T含量,然后将完整的MTHase基因克隆到酵母表达载体pPICZαA,筛选出重组载体并将其导入巴斯德酵母(Pichia pastoris)细胞进行重组表达以用于海藻糖的酶转化.最后获得了一株高效稳定表达MTHase的酵母菌株,分泌到表达培养基上清中的MTHase的酶活大于800U/mg(蛋白质),该重组菌株遗传稳定率达84%以上,为工业化酶法生产海藻糖奠定了一定基础.     

重组大肠杆菌产CotA漆酶的发酵条件优化

CotA漆酶在环境保护、食品工业和纸浆漂白等工业中具有重要的应用价值.将重组表达载体pET-22b/CotA转入大肠杆菌BL21(DE3),得到工程菌株,采用单因素实验和正交实验相结合的方法,研究诱导表达条件和发酵培养基对重组大肠杆菌产CotA漆酶量的影响.结果表明,初始pH 7.5的培养基中,添加0.6 mmol L-1 Cu2+,1 g L-1葡萄糖作碳源、15 g L-1蛋白胨和2 g L-1硫酸铵作氮源,以10%的接种量,37℃、200 r/min,直到菌液的D600 nm值为1.0,加入终浓度为1.0 mmol L-1的IPTG,25℃诱导12 h,漆酶的产量最高.优化前发酵液的粗提液的漆酶活性仅为1 190 U mL-1,优化后达到3 526 U mL-1,正交实验优化后漆酶活性提高了2.96倍.纯化的CotA漆酶最适反应温度为45℃,最适pH值为7.2.CotA漆酶对RBBR的脱色率在90%以上,此CotA漆酶在短时间内对染料能够有效地脱色,能够成为有潜力的工业用酶.图6表3参17