基于引物的湖泊沉积物氨氧化细菌PCR扩增策略比较

PCR扩增是检测环境中β-变形杆菌纲氨氧化细菌(β-AOB)群落的主要方法,但是引物的敏感性和特异性对结果具有关键影响.本研究首先比较了2组常用的β-AOB 16S rRNA基因引物,结果显示,在扩增一组不同性质湖泊沉积物样品时,βAMO引物均获得明亮的单一条带,但CTO引物则未能全部扩增.克隆及序列分析证实,βAMO引物扩增获得的序列均不属于β-AOB所在的Nitrosomonadales目,而CTO引物扩增获得的序列来自β-AOB中的Nitrosomonas europaea/"Nitrosococcus mobilis"分支.采用变性梯度凝胶电泳方法,对4种不同引物组合PCR策略扩增所得产物进行分析,发现以βAMO或16S rRNA通用引物结合CTO引物的巢式方案可以提高扩增的效率,且β-AOB的群落轮廓与CTO引物直接扩增方案高度相似.这些结果表明βAMO引物具有较高的敏感性但特异性较低,而CTO引物则相反.因此,特定巢式扩增方案既可提高扩增的效率,也能真实反映湖泊沉积物中β-AOB的群落轮廓,是较为理想的β-AOB研究方法.     

浮游动物DNA宏条形码标志基因比较研究

DNA宏条形码技术作为一种新型生物监测方法,在未来生态环境监测中有巨大的应用潜力。目前,浮游动物DNA宏条形码监测仍在发展阶段,需要首先对其(采样方法、引物选择和数据分析等)进行标准化和调整,然后才能用于常规流域生态监测。其中,如何选择合适的PCR扩增引物是DNA宏条形码生物监测标准化的关键问题之一。本研究比较了COI、18SV9和16S通用引物在浮游动物DNA宏条形码监测中的差异,为初步建立规范化的浮游动物DNA宏条形码监测方法提供技术支撑。结果表明,16S引物对浮游动物具有更好的特异性,其产生的操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)有88.1%属于浮游动物。虽然18SV9引物具有更高的物种覆盖度,不仅能扩增出浮游动物,还能扩增出大量藻类和真菌,但其物种识别敏感性较差,不适合浮游动物物种水平多样性监测。COI引物的浮游动物物种特异性、物种覆盖度和物种识别敏感性都适中,检出的浮游动物物种数量高于18SV9引物和16S引物,更加适合浮游动物DNA宏条形码监测。     

特异性拟杆菌引物在珠江三角洲的适应性研究

在珠江三角洲地区采集人、猪、牛、狗以及家禽等33个粪便样品,高效提取基因组DNA,选取14种特异性拟杆菌引物进行检验分析,并进一步采用已知污染源类型的水样对其进行验证.结果表明:采用粪便样品DNA专属提取试剂盒和水体样品DNA专属提取试剂盒提取的基因组模版纯度和提取率均符合后续实验要求.拟杆菌通用引物2#(Bac32F/Bac708R)检出率为85%(28/33),特别是对哺乳类动物和鸡的粪便具有更高的检出率.人的拟杆菌特异性引物3#(HF134F/ Bac708R)和4#(HF183F/Bac708R)、反刍动物的拟杆菌特异性引物8#(CF128F/Bac708R)以及猪的拟杆菌特异性引物10#(PF163F/Bac708R)在珠江三角洲地区同时具有较高的灵敏度和较强的特异性.水体样品验证实验与实际污染类型相符,说明拟杆菌通用引物2#、人的特异性引物3# 和4# 以及猪的特异性引物10# 在珠江三角洲地区具有很好的适用性.     

环境DNA(eDNA)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究

环境DNA(eDNA)宏条形码(Metabarcoding)技术越来越多地被应用于环境中物种定性识别,但如何定量监测物种在环境中的丰度尚未得到解决。本研究以太湖流域常见的5种浮游动物拟同形溞、大型溞、蚤状溞、多刺裸腹溞、老年低额溞为研究对象,建立了一种基于eDNA宏条形码技术的物种定量方法,并与实时荧光定量PCR(qPCR)相比较,研究了eDNA宏条形码技术多物种定量的准确性。结果表明,PCR引物对eDNA宏条形码的物种检测和定量影响显著。313 bp COI313引物对浮游动物物种覆盖度高,但是物种间DNA扩增的偏好性大,不适用于eDNA宏条形码定量检测。基于COI序列重新设计的短COI116引物能够同时检测出所有5个物种。荧光定量PCR(qPCR)物种拷贝数与物种相对占比呈正相关。eDNA宏条形码所检出每个物种的序列数与qPCR定量拷贝数高度一致。综上,eDNA宏条形码技术可实现对浮游动物物种的半定量检测,在生物多样性监测和生物完整性评价有显著的应用价值。     

松毛虫遗传多样性研究中AFLP反应体系的建立

以油松毛虫为材料,对T4 DNA连接酶不同用量、预扩增中的Mg~(2+)浓度、dNTP浓度、引物浓度以及选择性扩增巾的预扩增产物稀释倍数、Mg2~(2+) 浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq酶浓度进行了比较分析.最终建立了适合松毛虫的AFLP反应体系.用优化的AFLP反应体系,以油松毛虫、赤松毛虫和马尾松毛虫为材料筛选引物,从81对引物组合中筛选出10对多态性高的引物组合.图9参17     

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术同时检测水中多种肠道病毒

建立了一种利用通用引物RT-PCR技术检测水中肠道病毒的方法.利用脊髓灰质炎病毒1～3型,柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株,根据肠道病毒RNA5′非编码区中具有高度同源性的序列来设计通用引物.比较了M-MLV酶和AMV酶的逆转录效果,AMV酶能够成功地从地表水和生活污水中逆转录病毒RNA,更适于实际应用.对比研究了PCR过程中的退火温度,c(Mg2＋)等因素对RT-PCR检测结果的影响,选择退火温度55　℃,c(Mg2＋)为2　mmol/L的反应条件,优化了RT-PCR检测方法.通过检测水样中接种的连续稀释的病毒,确定了该检测方法的灵敏度为38　CCID₅₀.考察人工污染的地表水、污水、二级处理出水样品发现,检测灵敏度基本一致.该方法可应用在实际环境的肠道病毒检测中.      

用单个特异引物扩增桃ACC氧化酶cDNA及其在大肠杆菌中的表达

用单个特异引物和通用引物ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５从桃受伤叶片ｃＤＮＡ中扩增出１．３ｋｂ左右大小的片段．将该扩增产物克隆并对重组克隆作酶切分析发现至少可分为３类．用桃ＡＣＣ氧化酶基因组ＤＮＡ为探针进行点杂交表明,４,７,９,１０,１１,１２重组质粒能与之杂交,其中７,９,１０,１１,１２号重组质粒酶切图谱与已报导的桃果实成熟相关的ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ基因基本一致,而４号克隆则不同．ＤＮＡ序列分析和ＰＣＲ鉴定表明,插入片段均由５′端特异引物单个引物扩增出来,对７号重组克隆插入片段ＤＮＡ全序列分析表明,７号重组克隆插入片段全长１１４６ｂｐ,包含了除启始密码子外的全部编码区和１９２ｂｐ的３′端非编码区．通过补上起始密码子ＡＴＧ构建重组表达载体,在大肠杆菌中表达出３５×１０３的非融合蛋白     

用简并引物扩增与克隆D.radiodurans超氧化物歧化酶和过氧化 …

依据超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和过氧化氢酶（Ｃａｌ）的保守性氨基酸序列,设计简并引物,自Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ基因组ＤＮＡ扩增并克隆了ＳＯＤ和Ｃａｔ基因片 Ｃａｔ基因片段分别长４５３ｂｐ和６７３ｂｐ,各编码１５１和２２４个氨基酸,氨基酸序列与不同生物来源的ＳＯＤ或Ｃａｔ具有高度同源性。     

基于环境DNA的长江中华鲟分布特征探究

中华鲟（Acipenser sinensis）是我国长江流域的旗舰物种,在长江十年禁渔的大背景下,研究中华鲟无损化检测技术具有重要意义。环境DNA(eDNA)技术是一种环境友好型生物监测技术,可以在不直接观察或捕获生物体的情况下对物种进行检测。从文献中筛选出可以用于检测中华鲟eDNA的特异性引物,于2020年9月在长江中下游选取4个中华鲟常出现的区域,进行各断面立体式采样;提取16个点位的e DNA,使用筛选得到的引物对中华鲟进行eDNA的检测,以探究中华鲟的分布特征。结果显示,成功筛选到1组可以检测中华鲟eDNA的引物,使用该引物成功检测到包括中华鲟在内的长江4种鲟类的eDNA,共计测得约300万条鲟类序列。依据测序结果分析不同断面检测到的中华鲟eDNA的差异,发现宜昌江段断面的中华鲟eDNA最多,洞庭湖口断面最少,且表层和底层水体的中华鲟eDNA检出也有显著差异。筛选得到的引物可以用于中华鲟eDNA的检测,中华鲟e DNA的检测结果与中华鲟的历史调查和洄游特征较为吻合。不同水深条件中华鲟eDNA的检出量有显著差异,表明在今后的调查中采用混合或者立体采样可以更加全面地进行中华鲟eDN...     

染色体步行PCR技术

染色体步行是一种常用的克隆已知基因旁侧序列的技术.本文综述了现有的染色体步行PCR技术,如反向PCR、锅柄PCR、连接介导PCR、热不对称PCR、SON PCR等,并在此基础上提出了一种新的染色体步行PCR技术的构思.它运用特异引物与随机引物的搭配,在普通PCR程序下扩增目的序列.实验中设置相应随机引物的RAPD对照,识别非目的扩增产物.文中介绍了新方法的原理,分析了这种方法的优缺点.这种方法可能是一种新的有效进行染色体步行的PCR技术,国内外尚未见相关报道.图2参26